二氢杨梅素的制备方法及其用途 二氢杨梅素是种已知的化合物(参见walter Karrerr,BirkhauserVerlag,Bassel und stuttgart(1958),P.652,NO:1640)，该文献没有公开二氢杨梅素具有保肝护肝，抗菌消毒，降血脂，镇痛，祛痰和提高免疫系统免疫力的作用。
本发明的目的是提供一种从葡萄科植物中制备二氢杨梅素的方法。
本发明方法是这样实现的：通过各种溶剂(水和/或有机溶剂)煎煮葡萄科植物，煎煮一次或多次，煎煮液经过滤，浓缩冷却至浸膏，再用热水溶解，乘热过滤，滤液直接用色谱分离；或者用超声提取，合并滤液，蒸出溶剂，再用热水溶解，乘热过滤，滤液直接用色谱分离，得二氢杨梅素晶体。
煎煮所用的溶剂优选水，醇类，酯类，酮类，醚类和强极性有机溶剂，更优选低级链烷醇，低级脂肪酸酯，具有3-12个碳原子的酮和醚和/或水，最优选甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，正丁醇，异丁醇，仲丁醇，叔丁醇，乙酸乙酯，乙酸甲酯，甲酸乙酯，丙酮，甲基乙基酮，乙醚，甲基乙基醚，甲基叔丁基醚，二氯甲烷，氯仿，四氯化碳，二甲亚砜，N,N-二甲基甲酰胺和/或水等等。
色谱分离填料可以是聚酰胺，聚丙烯酰胺，大孔吸附树脂，阳离子交换树脂，阴离子交换树脂，优选聚酰胺，聚丙烯酰胺，大孔吸附树脂，更优选聚酰胺。
色谱分离所使用的洗脱剂可以是低级醇水溶液，低级酮水溶液，低级醚水溶液，低级酯水溶液，其中有机溶剂优选甲醇，乙醇，正丙醇，异丙醇，丙酮，乙酸乙酯，甲酸乙酯或丙酯，乙酸甲酯，更优选甲醇，乙醇，丙酮，乙酸乙酯。可以是梯度洗脱。洗脱速度大约10ml/min。
本发明可以使用所有葡萄科植物，优选使用蛇葡萄属，更优选粤蛇葡萄，栋叶玉葡萄，显齿蛇葡萄，大叶蛇葡萄，白蔹，东北蛇葡萄和山葡萄等。
本发明的另一个目的是提供二氢杨梅素在制备具有保肝护肝，抗菌消毒和提高免疫系统免疫力的药物和保健品中的用途。
本发明化合物与药学上可接受载体或赋形剂混合可以配制成药物组合物，本发明化合物还可以作为保健品的有效成分，本发明组合物还可以配制成饮料等。
本发明药物组合物可以通过药物领域常规配制技术和载体，配制成药物组合物。本发明组合物可以制备成片剂，颗粒剂，胶囊，外用药，还可以加入到茶或饮料中，制成保健茶或饮料。
通过下面的实施例详细说明本发明。但是应该理解这些实施例只是说明本发明，而不是在任何方面限制本发明的范围。实施例1：从白蔹提取二氢杨梅素
室温下，将收集来的白蔹根1500克洗去尘土，加入7500毫升乙酸乙酯，煎煮1小时，过滤，残渣再加入6000毫升乙酸乙酯，再煎煮0.5小时，再过滤，滤液合并，将乙酸乙酯蒸干，得黑色浸膏，加入1800毫升90℃热水，使浸膏充分溶解，滤去黑色不溶物，滤液用聚酰胺(30-66目，浙江省台州市路桥四青生物材料厂，聚乙内酰胺)柱(规格100×1050mm)分离，先用水洗，再用30％乙醇洗脱，薄层色谱监测，得粗产物，蒸去乙醇，乘热过滤冷却，静置，沉淀，得白色丝状结晶，产率：2.1％；熔点：245℃(分解)，[α]D25为+5.405。HR EI-MS谱确定分子式是C15H12O8，IR(KBr)cm-1谱：3276cm-1为-OH吸收峰；1641cm-1为α,β不饱和C=O吸收峰；1543cm-1,1472cm-1为芳环的特征吸收峰。实施例2：从显齿蛇葡萄提取二氢杨梅素
取显齿蛇葡萄干燥嫩茎叶2kg，用95％乙醇(工业乙醇)回流提取两次，每次2小时，过滤，合并滤液，蒸发至干，加入1200毫升80℃热水，使浸膏充分溶解，滤去黑色不溶物，滤液用聚酰胺(30-66目，浙江省台州市路桥四青生物材料厂，聚乙内酰胺)柱(规格100×1050mm)分离，先用水洗，再用30％乙酸乙酯洗脱，薄层色谱监测，得粗产物，蒸去乙酸乙酯，乘热过滤冷却，静置，沉淀，得白色丝状结晶，产率：3％；熔点：246℃(分解)，[α]D25为+5.404。HR EI-MS谱确定分子式是C15H12O8,IR,1H-NMR表明与实施例1得到的晶体相同。实施例3：从东北蛇葡萄中提取二氢杨梅素
将收集来的东北蛇葡萄800克洗去尘土，加入3000毫升水，煎煮3小时，过滤，残渣再加入1000毫升丙醇，再煎煮1小时，再过滤，滤液合并，浓缩至浸膏，加入500毫升100℃热水，使浸膏溶解，冷却到60℃，静置，过滤，除去黑色沉淀。冷却至室温，静置过夜，得到浅黄色沉淀，沉淀用热水溶解，用AB-8大孔吸附树脂色谱分离，以0-95％乙醇水溶液进行梯度洗脱，并且用薄层色谱监测，以确定晶体馏分，合并晶体馏分，浓缩至干，然后用水重结晶，产率：2.9％，熔点是245℃(分解)。IR,EI-MS,1H-NMR表明产物与实施例1得到的晶体相同。实施例4从粤蛇葡萄中提取二氢杨梅素
将收集来地粤蛇葡萄1000克用冷水洗去尘土，加入3000毫升95％乙醇水溶液浸泡，超声提取0.5小时，过滤，残渣再加入1500毫升95％乙醇，再超声提取0.5小时，再过滤，滤液合并，浓缩除去乙醇，加入500毫升100℃热水，使浸膏溶解，直接用AB-8大孔吸附树脂色谱分离，以0-95％乙醇水溶液进行梯度洗脱，并且用薄层色谱监测，以确定晶体馏分，合并晶体馏分，浓缩至干，然后用水重结晶，产率：2.9％，熔点是245℃(分解)。IR,EI-MS,1H-NMR表明产物与实施例1得到的晶体相同。实施例5：对四氯化碳引起的小鼠试验性肝损伤的影响：
将动物随机分为六组：正常对照组、阳性对照组、模型对照组、二氢杨梅素组三组：100mg/kg,200mg/kg,400mg/kg。正常对照组是动物不给任何药，只给溶剂；阳性对照组为联苯双酯200mg/kg,qdx6,po，联苯双酯为常用的肝炎治疗药，以联苯双酯治疗模型动物，观察疗效，作为对照；模型对照组为检验药效，动物必须先制成肝炎模型，使动物患肝炎；二氢杨梅素组是在上述模型基础上，再给二氢杨梅素，以观察疗效，三组都为Bidx6 po。各组动物分组给药，每组10只小鼠，一日两次，服用体积0.5ml/20g小鼠，连续服用六天，末次给药后1小时腹腔注射1％四氯化碳油溶液0.2ml/只小鼠，空腹16小时后由眼眶静脉采血，分离血清，测定血清的SGPT(ALT)、SGOT(AST)含量，和血清总胆红素(T-BIL苯甲酸钠咖啡因比色法)含量，并与阳性对照组、正常对照组、模型对照组比较，模型对照组服用等量相应溶剂，阳性对照组采用联苯双酯200mg/kg,pox6，每日一次。结果见表1．
表1．二氢杨梅素对四氯化碳引起小鼠肝损伤的血清SGOT的变化组别剂量mg/kg血清SGPT(U)X±SD 血清SGOT(U)X±SD T-BIL相应溶剂模型对照组相应溶剂 109.2_9.8 83.7±4.6 5.78±2.91二氢杨梅素50 Bidx6po 108.3_10.12 79.4±10.3 二氢杨梅素100 Bidx6po 85.3_4.34 71.0±10.4 4.24±2.11 二氢杨梅素200 Bidx6po 68.3_4.89*68.4±9.2** 3.42±1.32联苯双酯200 qdx6po 63.6_4.10**61.2±4.2** 3.12±1.24
*P＜0.05**P＜0.01与模型组比较
从表1的数据可以看出二氢杨梅素具有极好的治疗肝炎的作用。以及降低T-BIL含量，显示二氢杨梅素用明显的降酶退黄的保肝作用。实施例6体外抑菌作用试验：二氢杨梅素体外抑菌效应试验：
采用平板打孔法测定二氢杨梅素的抗菌效应。试管法和平板打孔法进行尝试后，确定了平板打孔法这一简便易行且耗时较短的方法。采用五种实验菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎球菌、溶血链菌、卡他球菌进行效应试验。
实验组菌株名称二氢杨梅素浓度及抑菌圈大小(mm) 原液提取液1倍 稀释 多抗(青、链霉素、 制霉菌素)金黄色葡萄球菌 9.5mm 8mm 17-20mm大肠杆菌 8.5mm 6mm 11mm肺炎球菌 - - 10mm溶血链菌 - - 10-11mm卡他菌球 - - 11mm原液指初始浓度的二氢杨梅素4mg/ml实施例7：二氢杨梅素在体外的抑菌、抗病毒实验：
流感病毒的分离和鉴(滴)定：目前常用鸡胚进行分离流感病毒，接种途径为鸡胚的尿囊腔，3天后出现后鸡胚死亡的病变特征和出现血凝素，对此，我们采用此方法进行对二氢杨梅素的鉴定。我们采用一定浓度的提取液和4个血凝单位的流感病毒1∶1混合，让二者于室温作用20分钟后再注射鸡胚，注射量为每胚0.2ml。实验采用9至11日龄的鸡胚，进行尿囊腔接种，培养48小时后，于4℃放置过液，然后无菌取其尿液，经1000rpm离心10分钟后取上清，分装，-20℃存放，备检测之用，尿液的检测分血凝和血抑两种，使用的红细胞是来亨公鸡，方法为常规法。
抗病毒实验：用不同浓度的二氢杨梅素在鸡胚中进行抗病毒实验表3流感病毒血凝抑制试验血清稀 释度样品浓度原液10×20×40×80×160×320×640×128 0×原液1++++++++++++++++++++++++++原液2++++++++++++++++++++++++++原液3++++++++++++++++++++++++++++++原液4++++++++++++++++++++++++++++++10-5a++++++++++++++++++++++++++++++++++10-5b++++++++++++++++++++++++++++++++++10-5c++++++++++++++++++++++++++++++10-5d++++++++++++++++++++++++++++++10-6a++++++++++++++++++++++++++++++10-6b++++++++++++++++++++++++++++++10-6c++++++++++++++++++++++++++++++10-6d++++++++++++++++++++++++++++++备注：1、原液指初始浓度的二氢杨梅素4mg/ml
2、10-5与10-6指从二氢杨梅素原液进行药的稀释度
3、判定结果时按血凝强度分别以++++、+++、++、-表示。
红细胞呈细沙粒样无效主孔(管)底者为+++，即100％凝集；红细胞均匀铺于孔(管)底，但边缘不整而稍向孔(管)底集中者为+++，即75％凝集；红细胞于孔(管)底形成一个环状，四周有小凝集块者为++，即50％凝集；红细胞于孔(管)底形成圆团，但边缘不够光滑，四周稍有凝集块者为+，即25％凝集；红细胞于孔(管)底形成圆团，边缘光滑整齐者为一，即无凝集。实施例8：
壹、对小鼠体液免疫(血清凝集素)影响
1、阴性对照组
2、阿斯匹林组
3、本发明二氢杨梅素大剂量组(0.15g/kg，大-1.35g/kg，剂量组0.45g/kg)
观察凝集程度，分五组(0-4)，计算抗体结果进行统计学处理，按下式计算抗体积数
(抗体积数∑=S1+2S2+3S3+4S4……NSn)
表5、本发明二氢杨梅素对小鼠凝集素的影响动物数抗体积数P值空白对照组10 93.4±13.22阿斯匹林10 115.00 ±＜0.01 17.31二氢杨梅素小剂量组10 103±11.31中剂量组10 115.92 ± 19.38＜0.01大剂量组10 103±7.01＜0.05结果证实：中、高剂量组明显增加血清中抗羊红细胞凝集素值，有显著性差异，二氢杨梅素对机体网体内系统吞噬功能有增强作用。实施例9二氢杨梅素镇痛实验1、动物对象：昆明小白鼠18～22g雌雄各半2、分组与溶液配制：
将小白鼠每组10只，分为5组：①生理盐水组；②水提取组(0.26g/ml)；③醇提取物(0.21g/ml)；④总黄酮组(0.15g/ml)；⑤二氢杨梅素(0.04g/ml)。3、给药方式
给各组小白鼠称重，按每只0.1ml/10g给药，连续三天灌胃给药，并开每3天给药后60min，腹腔给入醋酸(0.5％)溶液0.2ml/只，观察5～30min内动物扫体数。4、结果与统计药品名 给药量 止痛率 P值生理盐水 0.2ml/只 0水提组 2.6g/kg 88.1％ P＜0.05醇提组 2.1g/kg 93.5％ P＜0.05总黄酮组 1.5g/kg 88.0％ P＜0.05二氢杨梅素 0.4g/kg 54.1％ P＜0.05组结果证明：二氢杨梅素具有明显的止痛作用。实施例10二氧杨梅素对高血脂症小鼠血脂的降脂作用
剂量 TC TG HDL-C组别 mg/kg (mmol/L) (mmol/ (mmol/L L) )正常对照组 3.91± 1.41± 1.85± 0.78 0.37 0.28模型对照组 11.24± 2.11± 1.35± 5.79 0.41 0.52安妥明 310 5.12± 1.76± 1.72± 1.14 0.11 0.64二氢杨梅素 400 6.11± 1.58± 1.621± 1.90 0.2 0.56
将动物随机分为4组，正常对照组，阳性对照组，模型对照组，提取液组。每组10只小鼠，一日一次，连续给药10天，正常对照组不给任何药。其实各组小鼠均给高脂乳剂0.5ml/只，形成实验性高血脂。于10天用药后禁食过夜。次日从小鼠眼眶取静脉血。按酶法检测血清总胆固醇(TC)，甘油三脂(TG)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。结果表明，模型对照组血清TC,TG值明显升高，HDL-C值下降。与模型对照组比较。二氢杨梅素组能明显降低血清TC,TG值，还使HDL-C略有升高。说明此提取物能抑制高脂乳剂引起的小鼠血脂升高，具有降脂作用。实施例11二氢杨梅素对小鼠酚红祛痰试验实验方法：
动物每日口服试验样品1次，连续口服三天。受试品剂量为100/kg，给药组按20ml/kg给药，阴性对照组口服同体积生理盐水。末次给药前1天禁食，末次给药后0.5小时腹腔注射25％酚红溶液500mg/kg，再0.5小时后按颈处死动物分离气管，插入注射针，用2ml生理盐水冲洗，冲洗液加1M NaOH 0.1ml显色，用722型分光光度计于546mm波长比色，直接读出酚红含量。
表下方：从试验结果表示，二氢杨梅素样品，口服3天后增加小志呼吸道酚红分泌量，提示样品有祛痰作用。
表1、二氢杨梅素对小鼠酚红祛痰试验的影响样品 剂量 mg/kg 酚红量 增加百分率 (ug/ml) (X±SD) ％二氢杨梅素20ml/kg 0.68±0.22 -二氢杨梅素100 0.70 ± -
0.17**P＞0.05，料P＜0.05，***P＜0.01同生理盐水组比较。