中国鲎素组成型酵母表达载体及其制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 103233035 B (45)授权公告日 2015.01.14 CN 103233035 B (21)申请号 201210051429.4 (22)申请日 2012.03.01 CGMCC No.5462 2011.11.16 C12N 15/81(2006.01) C12N 15/66(2006.01) (73)专利权人 吉林大学 地址 130062 吉林省长春市西安大路 5333 号 (72)发明人 韩文瑜 冯新 雷连成 宋战昀 刁昱文 赵红蕾 高宇 (74)专利代理机构 吉林长春新纪元专利代理有 限责任公司 22100 代理人 白冬冬 郑伟等 . 中国鲎 （t。

2、achypleus tridentatus） 基因工程抗菌肽的制备及其抗菌活性 .中国兽 医学报 .2007, 第 27 卷 ( 第 2 期 ), 祝骥等 . 抗菌肽的研究进展 .生命科 学 .2008, 第 20 卷 ( 第 4 期 ), 刘德辉等 . 蝉抗菌肽基因密码子优化及其毕 赤酵母表达载体构建 . 中国畜牧兽医 .2009, 第 36 卷 ( 第 10 期 ), (54) 发明名称 中国鲎素组成型酵母表达载体及其制备方法 (57) 摘要 一种中国鲎素组成型酵母表达载体及其制备 方法， 属于生物技术领域。本发明的目的是采用 微生态理论和分子生物学技术， 将中国鲎抗菌肽 Tachyple。

3、sinsI（TPI） 基因克隆到组成型表达载 体 pGAPZA 中， 构建鲎素抗菌肽基因 GAP 启动子 酵母表达载体。本发明首先根据 tachyplesins 基因的测序结果设计引物TPI-NNX1和TPI-NNX2， 然后根据 pGAPZ 使用手册合成通用引物， 对 TPI 基因的克隆质粒 pMD-18T-TPI 和酵母表达载 体 pGAPZA 进行双酶切， 回收酶切目的片段， 用 T4DNA连接酶连接， 连接产物转化大肠杆菌DH5， 筛选阳性转化子， 提取质粒， 进行 PCR 和双酶切鉴 定， 并进行测序。本发明筛选能够高效表达、 零污 染的鲎素抗菌肽酵母高效表达基因工程菌。 (83)生。

4、物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 张丽玮 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 1 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书10页 序列表1页 附图5页 (10)授权公告号 CN 103233035 B CN 103233035 B 1/1 页 2 1. 一种中国鲎素组成型酵母表达载体的制备方法， 其特征在于 ： 根据 tachyplesins 基 因的测序结果设计引物 TP I-NNX1 和 TP I-NNX2， 含如下酶切位点 ： 上游引物 TP I-NNX1 ： 5 -CCGC|TCGAGAAAA。

5、GAAAATGGTGCTTCCGTGTTTG-3 Xho I 下游引物 TP I-NCX2 ： 5 -GCT|CTAGATTAACGGCAACGACGGTAGCAG-3 Xba I 根据 pGAPZ 使用手册合成通用引物 ： 上游引物 5 pGAP ： 5 -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 下游引物 3 AOX1 ： 5 -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3 对 TP I 基因的克隆质粒 pMD-18T-TP I 和酵母表达载体 pGAPZ A 进行双酶切， 回收 酶切目的片段， 用T4 DNA连接酶连接， 连接产物转化大肠杆菌DH5， 筛选阳性转化子， 提取 质粒。

6、， 进行 PCR 和双酶切鉴定， 并进行测序。 2. 由权利要求 1 的方法获得的中国鲎素组成型酵母表达载体 pGAPZ A-TPI。 权 利 要 求 书 CN 103233035 B 2 1/10 页 3 中国鲎素组成型酵母表达载体及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域。 背景技术 0002 抗菌肽 （Antibacterial Peptides， ABP） 是由胚系基因编码的内源性活性肽分子， 广泛存在于多种生物体内， 是生物体对外界病原物入侵感染而产生的一系列免疫反应的产 物。由于其分子量小， 极易扩散到感染部位， 不存在使用后产生耐药性的问题， 且进入机体 后无有害残。

7、留， 因此， 抗菌肽在畜禽养殖业上的研究与应用， 将是实现健康养殖、 消除抗生 素残留的重要措施。鲎是一种极其珍贵的海洋无脊椎动物， 也是海洋动物界现存的 “活化 石” ， 其经济价值和科研价值很高。鲎缺乏获得性免疫系统， 在抵抗病原侵袭的过程中形成 了多种天然防御系统， 在这些防御系统中， 鲎素 （Tachyplesin） 发挥了主要的抗病原作用。 鲎素是一类存在于鲎血细胞中的具有抗菌活性的阳离子多肽， 它的发现被医学界称为 “抗 生素” 研究的一个里程碑， 是后抗生素时代到来的标致。 0003 1969 年， Koichi Ogata 首次发现了一种可以利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵 母菌。

8、 。甲醇可以很廉价的从天然气中合成， 因此立即引起人们将毕赤酵母开发成动物高 蛋白饲料的兴趣。20 世纪 70 年代， Phillips Petroleum Company 研制了毕赤酵母单细 胞蛋白 （SCP） 的培养基及连续高密度培养方法 （130 g/L 细胞干重） 。进入 80 年代， Salk Institute Biotechnology/Industrial Associate Inc.（SIBIA） 将毕赤酵母开发为异源 蛋白表达系统， 并构建了载体、 菌株及毕赤酵母的基因工程操作方法。沿用 SCP 生产中使用 的培养基及发酵方法， 联合 AOX1 启动子的调控， 实现了外源蛋。

9、白在毕赤酵母中的高水平表 达。1993 年， 授权 Invitrogen Company 向全世界出售该系统， 推动了毕赤酵母表达系统的 发展和应用。到目前， 已用毕赤酵母表达系统成功的表达了 200 种以上的蛋白， 毕赤酵母还 被美国食品和医药管理局 （Food and Drug Administration， FDA） 确认为是一种安全的生 物， 具有良好的生物安全性。 1997年开发的P.pastoris的组成型甘油醛-3-磷酸脱氢酶基 因 （Glyceraldehydes3-phosphate dehydrogenase， GAP） 启动子， 该启动子是组成型表达 的， 所以不存在诱导。

10、的问题， 在以葡萄糖为碳源的培养基上就可以表达， 从而有利于产品的 生产和应用， 且表达量较诱导型高。目前， 该系统还很少应用于抗菌肽的表达， 预期将该系 统引入抗菌肽的表达， 能够成为抗菌肽规模化生产的最佳途径。 发明内容 0004 本发明的目的是采用微生态理论和分子生物学技术， 将中国鲎抗菌肽 Tachyplesins I（TP I） 基因克隆到组成型表达载体 pGAPZ A 中， 构建鲎素抗菌肽基因 GAP 启动子酵母表达载体。 0005 本发明首先根据 tachyplesins 基因的测序结果设计引物 TP I-NNX1 和 TP I-NNX2， 含如下酶切位点 ： 0006 上游引物。

11、 TP I-NNX1 ： 5 -CCGC|TCGAGAAAAGAAAATGGTGCTTCCGTGTTTG-3 说 明 书 CN 103233035 B 3 2/10 页 4 0007 Xho I 0008 下游引物 TP I-NCX2 ： 5 -GCT|CTAGATTAACGGCAACGACGGTAGCAG-3 0009 Xba I 0010 然后根据 pGAPZ 使用手册合成通用引物 ： 0011 上游引物 5 pGAP ： 5 -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 0012 下游引物 3 AOX1 ： 5 -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3 0013 对 TP I。

12、 基因的克隆质粒 pMD-18T-TP I 和酵母表达载体 pGAPZ A 进行双酶切， 回收酶切目的片段， 用T4 DNA连接酶连接， 连接产物转化大肠杆菌DH5， 筛选阳性转化子， 提取质粒， 进行 PCR 和双酶切鉴定， 并进行测序。 0014 本发明由上述方法获得的中国鲎素组成型酵母表达载体 pGAPZ A-TPI。 0015 本发明采用微生态理论和分子生物学技术， 将中国鲎抗菌肽 Tachyplesins I（TP I） 基因克隆到组成型表达载体 pGAPZ A 中， 构建鲎素抗菌肽基因 GAP 启动子酵母表达载 体， 电转化到酵母宿主菌 X-33 中， 筛选能够高效表达、 零污染的。

13、鲎素抗菌肽酵母高效表达 基因工程菌。并以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌进行初步的抑菌活性检测。为下一 步进行工业化生产及进一步探究抗菌肽在体内体外的生物学作用及其作用机制提供材料。 附图说明 0016 图 1 是 pGAPZ A 质粒图谱 ； 0017 图 2 是重组质粒 pGAPZ A-TP I 图谱 ； 0018 图 3 是重组质粒 pGAPZ A-TP I 的 PCR 和酶切鉴定结果 ； 0019 图 4 是重组质粒 pGAPZ A-TPI 酶切鉴定结果 ； 0020 图 5 是 pGAPZ A-TP I 重组质粒测序结果 ； 0021 图 6 是 X33-GAP-TP I 重组酵母菌。

14、 PCR 鉴定 ； 0022 为对酵母菌株 DNA 用引物 TP I-NCX2 和 5 pGAP 进行 PCR 扩增检测结果， 理论扩 增片段大小为376 bp， 如图所示， 阳性菌株在目的片段附近均有特异性扩增 （316泳道） ， 2 泳道为空白的 X-33 酵母菌株 DNA 对照 ； 0023 图 7 是 X33-GAP-TPI 重组酵母菌 PCR 鉴定 ； 0024 为对酵母菌株 DNA 用引物 TP I-NNX1 和 3 AOX1 进行 PCR 扩增检测结果， 理论扩增 片段大小为 230 bp， 如图所示， 阳性菌株在目的片段附近均有特异性扩增 （2 15 泳道） ， 1 泳道为空白。

15、的 X-33 酵母菌株 DNA 对照 ； 0025 图 8 是 X33-GAP-TPI 重组酵母菌 PCR 鉴定 ； 0026 为对酵母菌株DNA用引物TP I-NNX1和TP I-NNX2进行PCR扩增检测结果， 理论扩 增片段大小为 66 bp， 如图所示， 阳性菌株在目的片段附近均有特异性扩增 （2 15 泳道） ， 16 泳道为空白的 X-33 酵母菌株 DNA 对照 ； 0027 图 9 是发酵产物 Tricine-Glycerol-SDS-PAGE 结果 ； 0028 图 10 是发酵产物的活性检测结果。 具体实施方式 0029 本发明涉及的中国鲎素组成型毕赤酵母阳性表达菌株保藏单。

16、位名称 ： 中国微生 说 明 书 CN 103233035 B 4 3/10 页 5 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏单位地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号 ； 保藏日期 ： 2011 年 11 月 16 日， 保藏编号 ： CGMCC No.5462， 分类命名 ： 巴斯德毕赤酵母 pichia pastoris。 0030 本发明首先根据 tachyplesins 基因的测序结果设计引物 TP I-NNX1 和 TP I-NNX2， 含如下酶切位点 ： 0031 上游引物 TP I-NNX1 ： 5 -CCGC|TCGAGAAAAGAAAATGGTGCTTCCGTG。

17、TTTG-3 0032 Xho I 0033 下游引物 TP I-NCX2 ： 5 -GCT|CTAGATTAACGGCAACGACGGTAGCAG-3 0034 Xba I 0035 然后根据 pGAPZ 使用手册合成通用引物 ： 0036 上游引物 5 pGAP ： 5 -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 0037 下游引物 3 AOX1 ： 5 -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3 0038 对 TP I 基因的克隆质粒 pMD-18T-TP I 和酵母表达载体 pGAPZ A 进行双酶切， 回收酶切目的片段， 用T4 DNA连接酶连接， 连接产物转化大肠杆菌D。

18、H5， 筛选阳性转化子， 提取质粒， 进行 PCR 和双酶切鉴定， 并进行测序。 0039 本发明由上述方法获得的中国鲎素组成型酵母表达载体 pGAPZ A-TPI。 0040 菌株及质粒 0041 主要菌株及质粒见表 1 和图 1。 0042 表 1 使用的主要菌株和质粒 0043 说 明 书 CN 103233035 B 5 4/10 页 6 0044 主要试剂 0045 限制性内切酶Xho I、Xba I、Bln I、 T4 DNA 连接酶、 Ex Taq 酶、 DNA Marker DL15 000、 DNA Marker DL2 000、 DNA 凝胶回收试剂盒、 质粒 DNA 快速。

19、制备试剂盒、 酵母菌基因组 提取试剂盒均为 TaKaRa 公司产品 ； Zeocin 抗生素为 Invitrogen 公司产品 ； Peptone、 D- 葡 萄糖、 YNB（无游离氨基酸酵母含氮碱基） 、 山梨醇、 生物素、 组氨酸等均为上海生物工程试剂 公司产品。Tris、 Tricine、 SDS、 过硫酸铵、 -mercaptoethanol、 TEMED 均为 Sigma 公司产 品 ； 蛋白 Marker（116.0、 66.2、 45.0、 35.0、 25.0、 18.4、 14.4 kD） 为 Fermentas（MBI） 公司 产品 ； BM 201 型低分子量蛋白质 Ma。

20、rker （66 000、 45 000、 35 000、 27 000、 20 000、 14 400、 9 500、 6 500、 4 100 Da） 为美国 BBI 公司产品 ； MH 培养基 （Mueller hinton agar） 为英国 Oxoid 公司产品。 0046 主要仪器 0047 ECM 830 型多功能细胞电穿孔仪， 美国 BTX 公司 ； Allegra 6R 低温离心机， 美 国 Beckman 公司 ； SW-CJ-1F 净化工作台， 苏州兰林净化设备有限公司 ； TGL-16G 振荡培养 箱， 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 ； Mini-PROTEAN T。

21、etra MP4 型电泳槽， Powerpac Basic164-5050型电泳仪， Bio-Rad公司 ； M200型多功能酶标仪， 德国QIAGEN公司 ； DYY-III 型 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直电泳槽， 北京六一仪器厂 ； PYX-DHS 型恒温培养箱， 上海 市跃进医疗器械厂 ； HZQ 型恒温空气浴震荡器， 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 ； MDF-290A 型 -80 超低温冰柜， SANYO 公司 ； 4 冷藏冰箱、 -20 冷冻冰柜， 海尔公司 ； CS-9 000 型薄层扫描仪， 日本岛津 ； Counter Mat Flash 型全自动菌落成像分析系统， 西。

22、班 牙 IUL 公司 ； 程序降温盒 ： 美国 Nalgene 公司。 0048 试剂配制 0049 （1） 低盐 LB 培养基 ： 称取胰蛋白陈 （Tryptone） 1 g， 酵母提取物 （Yeast extract） 0.5 g， NaCl 0.5 g， 溶于 80 mL 的去离子水中， 充分搅拌溶解。滴加 5N NaOH 调节 pH 值至 7.4， 加入去离子水将培养基定容至 100 mL， 高压灭菌备用。固体培养基再加入 1.5 g 的琼 脂粉。含 Zeocin+的培养基终浓度为 100 g/mL， 4保存， 有效期一至两周。 0050 （3） 抗生素 Zeocin ： 购买时为 1。

23、00 mg/mL 贮存浓度， 工作浓度 100 g/mL， -20 避光保存。 0051 （4） YPD（Yeast extract Peptone Dextrose Medium） ： 称量 10g Yeast extract 与 20 g Peptone 溶于 900 mL 水中 （配制固体培养基时再加入 20 g Agar） ， 高压灭菌， 冷却 至室温后加入 100 mL 10D， 4保存。 0052 （5） 500B（Biotin） ： 在 100 mL 水中溶解 20 mg Biotin 并过滤灭菌， 4下保存。 0053 （6） 10D（Dextrose） ： 将 20 g D-。

24、glucose 溶于 100 mL 去离子水中， 高压灭菌， 室温下保存。 0054 （7） MH 培养基 （Mueller-Hinton agar） ： 称取本品 42.0 g， 加热溶解于 1 000 mL 蒸馏水中， 121 高压灭菌 15 min。 0055 引物合成 0056 根据tachyplesins基因的测序结果设计引物 TP I-NNX1 和 TP I-NNX2， 含如下酶 切位点。 0057 上游引物 TP I-NNX1 ： 5 -CCGC|TCGAGAAAAGAAAATGGTGCTTCCGTGTTTG-3 说 明 书 CN 103233035 B 6 5/10 页 7 0。

25、058 Xho I 0059 下游引物 TP I-NCX2 ： 5 -GCT|CTAGATTAACGGCAACGACGGTAGCAG-3 0060 Xba I 0061 根据 pGAPZ 使用手册合成通用引物 ： 0062 上游引物 5 pGAP ： 5 -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 0063 下游引物 3 AOX1 ： 5 -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3 0064 引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。 TP I-NNX1和TP I-NNX2理论扩增片 段大小为 66 bp， TP I-NNX1 和 3 AOX1 理论扩增片段大小为 230 bp， T。

26、P I-NCX2 和 5 pGAP 理论扩增片段大小为 376 bp。 0065 方法 0066 表达载体 pGAPZ-TP I 的构建与鉴定 0067 对 TP I 基因的克隆质粒 pMD-18T-TP I 和酵母表达载体 pGAPZ A 进行双酶切， 回收酶切目的片段， 用T4 DNA连接酶连接， 连接产物转化大肠杆菌DH5， 筛选阳性转化子， 提取质粒， 进行 PCR 和双酶切鉴定， 并进行测序。构建的重组质粒 pGAPZ A-TP I 图谱如 图 2。 0068 载体双酶切 0069 对 pMD-18T-TP I 质粒和酵母表达载体 pGAPZ A 用Xho I 和Xba I 双酶切，。

27、 按操 作说明书进行， 37 酶切 3 h， 反应体系如下表 2 所示。 0070 表 2 双酶切反应体系 0071 0072 取 10 L 进行 2.5 % 琼脂糖凝胶电泳， 凝胶成像系统拍照。 0073 酶切产物的回收 0074 将酶切产物经 2 % 琼脂糖凝胶电泳后切胶回收， 具体操作按 DNA 凝胶回收试剂盒 使用说明书进行。 0075 载体与目的片段的连接 0076 在离心管中加入以下组分， 4连接过夜。连接体系如下 ： 0077 表 3 连接反应体系 0078 说 明 书 CN 103233035 B 7 6/10 页 8 0079 连接产物的转化 0080 上述 10 L 连接产。

28、物， 转化 TOP10 感受态细胞。取 100 L 转化感受态细胞涂于 Zeocin+低盐 LB 平板上， 37 培养箱内培养过夜。选取单菌落接种于含 Zeocin+的低盐 LB 液体培养基中， 37 气浴摇床培养过夜。 0081 质粒提取 0082 用 DNA 质粒提取试剂盒提取， 操作按说明书进行。 0083 表达载体 pGAPZ A-TP I 的鉴定 0084 （1） 重组质粒的 PCR 鉴定 0085 反应体系如下 ： 0086 表 4 PCR 反应体系 0087 0088 PCR 反应条件 ： 94预变性 5 min 1 个循环 ； 94预变性 40s， 51退火 40s， 72 延。

29、伸 40s， 反应 30 个循环 ； 72延伸 10min， 4 5min。取 10 L 进行 1% 琼脂糖凝胶电泳， 凝胶成像系统拍照。 0089 （2） 重组质粒的酶切鉴定 0090 重组质粒 pGAPZ-TP I 用Xho I 和Xba I 双酶切后理论片段大小为 3 066 bp 和 66 bp， 重组质粒 pGAPZ-TP I 用Xho I 和Bamh I 双酶切后理论片段大小为 2 666 bp 和 466 bp， 按操作说明书进行， 反应体系同1.2.1.1， 37酶切3小时， 取10 L进行2.5 %琼 脂糖凝胶电泳， 凝胶成像系统拍照。 0091 （3） 重组质粒中目的基因测。

30、序及序列分析 0092 阳性重组质粒送 TaKaRa 公司测序。序列分析采用 DNAstar、 GenBank Blast 等软 说 明 书 CN 103233035 B 8 7/10 页 9 件进行序列同源性分析。 0093 重组酵母转化和筛选 0094 采用酵母电转化法， 具体操作如下 ： 0095 酵母感受态细胞的制备 0096 从 YPD 平板上挑取一毕赤酵母 X-33 单菌落， 接种于 10 mL YPD 液体培养基中， 30， 250 r/min 振荡培养过夜 ； 取 1 mL 接种于 200 mL YPD 培养基中， 30， 250 r/min， 振 荡培养至 OD600为 1.。

31、1 1.5 ； 3 000 r/min 离心收集菌体， 用去离子水和 1 M 的山梨醇各离 洗两次 ； 加入 1 mL 预冷的 1 M 的山梨醇重悬菌体， 此即为酵母感受态细胞， 用于下一步转 化。 0097 重组质粒线性化 0098 参照Pichia pastoris Expression Kit 手册进行， 酶切体系如表 5 所示。 0099 表 5 酶切反应体系 0100 0101 37水浴酶切过夜， 取1 L进行1%琼脂糖凝胶电泳， 检测线性化是否完全 ； 加入 2 倍体积的无水乙醇、 1/10 体积的 3M NaAc（pH 5.2） 溶液， 混匀 ； -20沉淀过夜 ； 于 4， 1。

32、2 000 r/min 离心 10 min ； 弃上清， 加入 500 L 预冷的 70% 乙醇 12 000 r/min 离心 10 min 洗涤沉淀， 弃上清， 于超净台风干 ； 10 L TE（pH8.0） 溶解 DNA， -20保存， 备用。 0102 电转化 0103 电转化仪的使用方法参照 ECM 830 型电击转化仪说明书， 冰浴条件下， 将 10 L 线性化的重组质粒加入到100 L X-33酵母感受态细胞中， 轻轻混匀后将混合物加入2 mm 的电击杯底部， 放入电击槽中电击转化。ECM 830 多功能细胞电穿孔仪的参数设定为 ： 电压 1 500 V、 电阻 200 、 电容。

33、 25 f、 电击时间 10 ms ； 转化后电击杯中加入 1 mL 1 M 冰预 冷的山梨醇， 混匀， 取出 200 L 涂于 YPD Zeocin+（100 g/mL） 平板 30 培养 2 d 至长 出菌落。 0104 重组酵母菌株 PCR 鉴定 0105 从平板上挑取单菌落于试管 （含 Zeocin+的 YPD 培养基） 中摇 2 天 ； 取菌液 1 mL 加 入Eppendof管中， 9 000 r/min室温离心4 min， 收集菌体 ； 用TaKaRa公司酵母菌基因组提 取试剂盒提取基因组 DNA， 具体操作见说明书， 50 L TE（pH8.0） 溶解 DNA， -20 保存，。

34、 备用。PCR 鉴定反应体系和反应条件同 1.2.1.6， 取 10 L 进行 2 % 琼脂糖凝胶电泳， 凝胶 成像系统拍照。鉴定正确的阳性重组酵母菌株命名为 X33-GAP-TP I。 0106 重组酵母菌种的保存 0107 （1） 真空冷冻干燥保存法 0108 10% 新鲜的脱脂牛奶为保护剂， -80 预冻 1 h， 启动冻干机， 温度降到 -40 说 明 书 CN 103233035 B 9 8/10 页 10 后， 加入样品， 启动真空泵， 待真空值降至稳定不变后， 封闭样品管口， 关闭冻干机， 取出样 品 -80 冰箱保存。 0109 （2） 液氮超低温保存法 0110 用甘油或二甲。

35、亚枫 （DMSO） 作保护剂制备细胞悬液， 分装入无菌安瓿瓶， 每管 0.2 mL， 使用程序降温盒在控制温度下降速率为1 /min的条件下预冻至-40 ， 然后立即放 入液氮生物贮存罐中 （-150 ） 保存。 0111 重组酵母菌 X33-GAP-TP I 的摇瓶发酵 0112 从转化的 YPD Zeocin+平板上挑取单菌落， 接种到 10 mL YPD Zeocin+（100 g/ L） 培养基中， 28 30 ， 250 r/min， 振荡培养至 OD600为 2 ； 吸取 0.1 mL 菌液到 50 mL YPD 培养基中， 继续培养 4 d 左右。取上清， 通过 Tricine-。

36、Glycerol-SDS-PAGE 及抑菌实验 来分析 TP I 表达情况， 筛选高效表达菌株。 0113 发酵产物的电泳检测 0114 发酵产物的处理 0115 收集发酵液 12 000 r/min 离心 10 min， 取上清 -20 备用。 0116 发酵产物的 Tricine-Glycerol-SDS-PAGE 检测 0117 （1） 凝胶的配制 0118 Tricine-Glycerol-SDS-PAGE 凝胶的配置按表 6 体系进行。 0119 表 6 Tricine-Glycerol-SDS-PAGE 胶配方 0120 0121 2） 电泳缓冲液的配制 0122 阳极缓冲液 ： 。

37、0.2 mol/L Tris， pH 8.9 ； 0123 阴极缓冲液 ： 0.1 mol/L Tris， 0.1 mol/L Tricine， 0.1% SDS， pH 8.25。 0124 （3） 样品的制备 0125 取发酵产物， 8 000 r/min 离心 5 min 分离菌体和上清， 分别取发酵上清液和菌体 200 L， 加入等量的 2loading buffer， 混匀后沸水煮 8 min， 8 000 r/min 离心 5 min， 取 10 L 上清上样。 0126 （4） 电泳 0127 电泳条件 ： 浓缩胶， 恒压 8 V/cm， 恒流 12 mA/ 板 ； 夹层胶和分离。

38、胶， 恒压 15 V/cm， 恒流 18-20 mA/ 板， 若电流电压急剧改变表明电泳状态不正常。 说 明 书 CN 103233035 B 10 9/10 页 11 0128 （5） 染色和脱色 0129 凝胶置于0.25 %考马斯亮蓝R250的染色液中摇荡2 h， 然后用50%的乙醇脱色至 条带清晰。 0130 （6） 对 SDS-PAGE 凝胶进行薄层扫描和积分计算。 0131 发酵液抑菌活性测定 0132 分别取 MH 琼脂平板上的大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌单菌落， 经增菌培养后， 调菌 液浓度 A600约 0.5 相当于 1108 CFU/mL， 用预先溶化、 冷却到 45的 MH。

39、 琼脂 1:10 稀释， 直接用此菌悬液制作平板， 每板厚度约在 5 mm 左右。待培养基凝固后用无菌的金属打孔器 （直径为 6 mm） 打孔， 孔中心间距不小于 24 mm， 除去孔内琼脂。每孔内加入 50 L 待检测 的表达上清， 置于37温箱培养1624 h后 （孵育时间因细菌种类不同而异） ， 用全自动菌 落成像分析系统测定抑菌圈直径， 以间接表示表达上清的抑菌活性。每组实验重复 3 次， 取 平均值为最终结果。 0133 重组质粒 pGAPZ A-TP I 的鉴定 0134 对重组质粒 pGAPZ A-TP I 用引物 TP I-NNX1 和 TP I-NNX2 进行 PCR 鉴定，。

40、 理论 扩增片段大小为 66 bp， 结果如图 3 泳道 2 所示， 在目的条带附近出现特异性扩增片段。对 重组质粒pGAP-TP I用Xho I和Xba I双酶切鉴定， 理论片段大小为3 066 bp和66 bp， 结 果如图 3 泳道 3 所示， 在目的条带附近出现特异性片段。 0135 对重组质粒 pGAPZ A-TP I 用Xho I 和Bamh I 双酶切鉴定， 理论片段大小为 2 666 bp 和 466 bp， pGAPZ A 空载体对照应为 2 663 bp 和 417 bp， 结果如图 4 泳道 2 6 所示， 在目的条带附近出现特异性片段。 0136 序列测定结果 0137。

41、 pGAPZ A-TP I 质粒测序结果如图 5 所示， 测序结果经 DNAstar、 GenBank Blast 软件进行序列同源性分析表明， TP I 基因碱基未发生突变， 整个表达载体阅读框正确无误， 与预期设计目标一致。 0138 重组酵母菌株 X33-GAP-TP I 的 PCR 鉴定 0139 酵母的突变效率比较高， 因此 Zeocin+筛选出来的菌株还需要进一步验证。本研 究所选用的表达载体属于整合型质粒， 不能在酵母中自行复制， 而是通过同源重组整合到 酵母染色体中， 转化后培养 2-3 d， 提取 DNA， 利用 PCR 对转化菌株进行鉴定和筛选， 结果如 图 6、 图 7 。

42、和图 8 所示。 0140 重组菌株 X33-GAP-TP I 的分泌表达 0141 将发酵 4 d 的摇瓶发酵液的上清和菌体， 同时进行 Tricine-Glycerol-SDS-PAGE 电泳。结果如图 9 所示， 从电泳凝胶上看， 一些菌株发酵液的上清在远小于 14.4 kD 处有一 条带 （图 9 的 2、 4、 7 泳道） ， 约与理论计算蛋白条带大小相符， 而相应菌体样品则未出现蛋白 条带 （图 9 的 1、 3、 6 泳道） ， 说明 TP I 基因得到了表达。图 9 中泳道 5 为 Fermentas（MBI） 的蛋白 Marker（116.0、 66.2、 45.0、 35.。

43、0、 25.0、 18.4、 14.4 kD） 。 0142 发酵产物的活性鉴定 0143 取有表达条带的发酵 4 d 摇瓶发酵液上清， 在 MH 琼脂平板上用打孔法， 以金黄色 葡萄球菌 （ATCC 25923） 和大肠杆菌 （ATCC 25922） 为受试菌， 检测抑菌活性， 结果如图 10 所示。图中 A 为发酵液上清对两株受试菌的抑菌活性检测结果， 100 L 发酵液上清对金黄 说 明 书 CN 103233035 B 11 10/10 页 12 色葡萄球菌的抑菌圈直径为 24 mm， 对大肠杆菌的的抑菌圈直径为 16 mm， 表现出较强的抑 菌活性。图中 B 为该株菌摇瓶发酵 4 d。

44、 发酵液上清的 Tricine-Glycerol-SDS-PAGE 电泳结 果， 从图中可见其表达产物的分子量与理论计算值 2.2 kD 基本相同， 图中泳道 2 为 BBI （BM 201） 低范围蛋白质分子量标准 （66 000、 45 000、 35 000、 27 000、 20 000、 14 400、 9 500、 6 500、 4 100 Da） 。 说 明 书 CN 103233035 B 12 1/1 页 13 吉林大学 中国鲎素组成型酵母表达载体及其制备方法 201210051429.4 2012.03.01 1 1 CCGCTCGAGAAAAGAAAATGGTGCTTCC。

45、GTGTTTG 2 1 GCTCTAGATTAACGGCAACGACGGTAGCAG 3 1 GACTGGTTCCAATTGACAAGC 4 1 GCAAATGGCATTCTGACATCC 序 列 表 CN 103233035 B 13 1/5 页 14 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103233035 B 14 2/5 页 15 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103233035 B 15 3/5 页 16 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103233035 B 16 4/5 页 17 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 103233035 B 17 5/5 页 18 图 10 说 明 书 附 图 CN 103233035 B 18 。