一种碳化后的墨鱼骨在骨科中的应用 【技术领域】
本发明涉及医学材料应用技术领域， 具体地说， 是关于一种碳化后的墨鱼骨在骨 科中的应用。 【背景技术】
骨移植是临床上仅次于输血的一种常见组织移植， 在骨科被广泛用于填充因感 染、 肿瘤、 创伤所致的骨缺损、 骨折不愈合、 关节及脊柱融合。 自体骨移植是治疗骨缺损的金 标准， 但其来源有限及取骨时会导致供区并发症， 因此找寻新的骨移植替代物， 或利用组织 工程技术进行骨缺损修复是当前国内外的研究热点和主攻方向。 在骨组织工程的三大要素 细胞、 载体和生长因子中， 生物材料支架作为细胞和因子的载体， 无疑在其中发挥着关键作 用。
墨鱼骨 (Cuttlebone) 为海洋软体动物墨鱼结构独特的骨骼， 具有与其海洋漂浮 习性相适应的、 良好的三维网状结构， 可悬浮于水， 成分为碳酸钙 ( 文石型晶状 )， 与骨的自 然成份和结构比较接近， 因此理论上具有良好的骨传导性能 ； 有文献报道在祖国传统医药 中， 墨鱼骨常被用作创面止血的中药。 但是关于墨鱼骨是否可以作为骨科医学材料， 未见文 献报道。 【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供一种碳化后的墨鱼骨的新用途。
为实现上述目的， 所采取的技术方案 ： 一种碳化后的墨鱼骨， 在制备治疗骨缺损、 骨肿瘤及囊肿疾病医学材料中的应用。
所述的医学材料是骨组织工程支架材料。
所述的医学材料是骨移植替代物材料。
所述的碳化后的墨鱼骨是经微波碳化后的墨鱼骨或加热碳化后的墨鱼骨。
本发明优点在于 ： 碳化后获得的墨鱼骨具有良好的微孔结构及生物相容性， 有利 于成骨细胞黏附生长， 并在一定程度上促进成骨分化。微波碳化的墨鱼骨可作为骨组织工 程支架材料及骨移植替代物材料。有望用于临床治疗及修复骨缺损， 填充肿瘤及囊肿切除 后的死腔， 促进脊柱及关节融合， 作为细胞的载体在体外复合构建组织工程化骨。
作为一种海洋动物的骨骼， 墨鱼骨内部含有的有机质可能具有一定的免疫原性及 微生物， 因此我们本发明选择微波碳化的方法来对其进行初步处理， 以提高其临床应用的 安全性。 【附图说明】
附图 1 是微波碳化墨鱼骨的扫描电镜图， a 是 ×50 低倍下的表面形貌， b 是 ×500 中倍下的表面形貌 c 是 ×2000 高倍下的表面形貌。
附图 2 是微波碳化墨鱼骨表面 hMSCs 黏附增殖的扫描电镜图， 其中 a 为细胞接种后 6h， b 为细胞接种后 3d， c 为细胞接种后 10d。
附图 3 是 hMSCs 培养 14d 后碱性磷酸酶染色， a 为 DMEM 成骨诱导液培养组， b 为墨 鱼骨 DMEM 成骨诱导培养基浸提液培养组。 【具体实施方式】
下面结合附图对本发明提供的的具体实施方式作详细说明。
实施例 1
一， 材料和方法
( 一 ) 本实验所需的材料和设备
材料 ： 购买新鲜活的墨鱼短期于 -80℃冻存 72h， DMEM 培养基 ( 美国 GIBCO 公司 )， 胰蛋白酶 ( 美国 SIGMA 公司 )， 胎牛血清 ( 美国 HYCLON 公司 )， 其他试剂均为市售分析纯试 剂。
仪器 ： 格兰仕 G8023YSP-BM1 微波炉 ( 公里 800W， 容积 23L， 中国 )， 超净工作台 (BIO-HAZARD， VCM-420， 中国台湾 )， 电子分析天平 (METTLER TOLEDO， AB204-E， 瑞士 )， 电磁 搅拌器 (STUART， SM24， 英国 )， 低温离心机 (UNIVERSAL， 32R， HETTICH， 德国 )， 扫描电子显微 镜 (SEM， JEOL， JSM-6260LV， 日本 )。 材料处理
从新鲜冰冻的墨鱼中取出墨鱼骨， 放入双氧水浸泡 30 分钟后蒸馏水冲尽， 酒精浸 泡保存， 除去其外壳后微波干燥后截成 2.5mm×2.5mm×3mm 圆柱体， 再次蒸馏水冲尽， 微波 干燥灭菌并碳化有机质。
( 二 ) 墨鱼骨微孔结构观察
分别取 5 个微波处理前后样本， 临界点干燥， 喷金。在扫描电子显微镜 (JEOL JSM-6360LV， 日本 ) 下观察并拍照。主要观察墨鱼骨的多孔结构， 包括孔径和连通孔径的大 小、 孔隙率等。
( 三 ) 细胞毒性实验
根据国际标准 ISO 10993-5， 对微波碳化后的墨鱼骨进行体外细胞毒性检测。 浸提 液的准备 ： 在 37℃、 5％ CO2 条件下用无小牛血清的 DMEM 培养基浸提用环氧乙烷消毒后的墨 鱼骨， 浸提递质按 1g ∶ 10mL 比例配制。48h 以 1000r/min 离心 5min， 吸取上清并过滤， 即 得 100％浸提液。阴性对照液为高密度聚乙烯片 (Thermanoxm， 美国 ) 浸提液， 阳性对照液 为 1％、 10％、 15％和 25％的苯酚稀释液， 见表 1。苯酚原液浓度为 6.4mg/ml。
表 1 不同浓度苯酚稀释液的配制
MTT 法测细胞毒性， 96 孔板一块， 分别在 B2 至 F12 的孔中接种 L929 小鼠成纤维细 胞 ( 购于上海中国科学院细胞库 )， 接种浓度为 2×104/200μm， 在 37℃、 5％ CO2 的条件下培养 48h， 细胞贴壁生长后吸去培养基， 换以 100％的终产品浸提液， 高密度聚乙烯片浸提液， 1％、 10％、 15％、 25％的苯酚稀释液和培养基。每组复种 5 孔， 每孔 200μl。培养 24h 后， 吸 去各孔液体， 加入 200μl MMT 液 ( 浓度 0.5％ )， 37℃下保温 4h。移去 MTT 液， 加入 DMSO 液 200μl， 震荡器充分震荡， 使蓝色结晶完全溶于 DMSO。 通过酶标仪在波长 490nm 下对各组进 行吸光度 (OD 值 ) 测定， 根据所测定的各组 A 值， 分别计算各实验组细胞相对增殖度 (VB)。
VB ＝ ( 试验组平均 OD 值 / 阴性对照组平均 OD 值 )×100％
按照表 2 将各组细胞相对增殖度转换成 6 级细胞毒性以评定材料的毒性程度。实 验结果为 0 或 1 级反应为合格 ； 实验结果为 2 级反应时应结合细胞形态分析综合评价 ； 实验 结果为 3 ～ 5 级反应为不合格。
表 2 细胞毒性作用评价表 (％ )
( 四 ) 扫描电子显微镜观察微波处理后墨鱼骨对人骨髓间充质干细胞黏附增殖的影响 将微波碳化墨鱼骨用环氧乙烷消毒后放入 12 孔板孔底， 每孔加 1.5ml 细胞悬液， 密度为 1×103 个 /ml， 每组重复 3 孔， 放入细胞培养箱培养箱在 37℃、 5％ CO2 的条件下培 养 6h， 72h 后弃培养液， PBS 轻轻洗涤 3 次， 将各组墨鱼骨用 2.5％戊二醛初始固定， 4℃， 2h。 PBS 漂洗 1h， 放入 0.1％锇酸固定 1h， 梯度酒精脱水 (30％， 50％， 70％， 80％， 90％， 95％及 100％ ) 各 10min。临界点干燥， 喷金。在扫描电子显微镜 (JEOL JSM-6360LV， 日本 ) 下观 察并拍照。
( 五 ) 碱性磷酸酶染色观察墨鱼骨浸提液对 hMSCs 成骨分化的影响
在 37℃、 5％ CO2 条件下用无小牛血清的 DMEM 培养基浸提环氧乙烷消毒后的墨鱼 骨， 浸提比例按 1g ∶ 10mL 比例配制， 所得浸提液加 10％小牛血清后配制成成骨诱导培养基 作为实验组， 以 DMEM 成骨诱导培养基作为对照组， 以两组培养基分别配制细胞悬液， 使细 4 胞密度为 1×10 个 /ml， 在 12 孔板每孔加 1.5ml 的上述两组细胞悬液， 每组重复 3 孔， 放入 37℃， 5％ CO2 培养箱， 每 3d 换液。
培养 14d 后碱性磷酸酶染色观察细胞分化， 按照碱性磷酸酶染色试剂盒操作 ： (1)
用二甲基甲酰胺溶解底物后， 倒入缓冲液中， 注意需将安瓿内全部底物溶解 ； (2) 再加入固 紫 B 混匀 ； (3) 墨鱼骨取出 PBS 轻轻洗涤 3 次后放入固定液 4℃ 30s ； (4) 取出墨鱼骨， PBS 轻轻冲洗 3 次， 空气晾干 ； (5) 加工作液于培养皿浸没墨鱼骨， 置 37℃水浴箱 45min ； (6) 取 出， 荧光显微镜拍照 ； (7) 拍照后密封， 放入 4℃冰箱保存。
( 六 ) 墨鱼骨植入动物体内成骨实验
利用裸鼠动物模型研究墨鱼骨在体内的成骨效应， 将微波碳化墨鱼骨用环氧乙 烷消毒后植入裸鼠体内 ： 选择 12 只成年裸鼠， 无菌条件下切开裸鼠的股部肌肉， 将上述处 理后的墨鱼骨填塞进去， 60 天后拍 X 片后将小鼠处死， 植入物取出做组织切片， HE 及 Von Kossa 染色， 观察有无新骨形成。
二， 结果
( 一 ) 墨鱼骨微孔结构观察
墨鱼骨大体观察为瓷白色， 质地轻， 脆性较大， 硬度较低， 肉眼及放大镜下可见粗 糙多孔状外观， 纹理清晰。 扫描电镜下可见平行之板层结构， 即为肉眼及放大镜下的清晰纹 理。板层结构之间有规则的桁架结构， 桁架结构间有较小桁孔相通联。主桁孔平均孔径为 75um×135um， 通联小桁孔平均孔径为 4um×8um( 图 1)。比重， 总孔隙率为 85％～ 90％， 通 孔率 100％。 ( 二 ) 细胞毒性试验
表 3 显示了转化材料的细胞毒性试验结果。依据表 3 的细胞毒性分级， 终产品 的 100％浸提液的细胞毒性在 0 级， 其相对增殖度较高， 与阴性对照组相比差异有统计学意 义， 说明墨鱼骨浸提液对 L929 细胞增殖具有一定促进作用。阳性对照组除了 1％的浸提液 没有细胞毒性， 其余都有很大的毒性作用。
表 3 墨鱼骨转化材料的细胞毒性试验结果
注： OD ： 吸光度 ； VB ： 相对增殖度
( 三 ) 墨鱼骨表面的细胞黏附增殖的活力形态
如图 2 所示， hMSCs 接种墨鱼骨 6h 后， 可见材料表面有球形细胞， 与材料黏附的细 胞能够很好的适应材料不规则的表面形貌包括主桁孔及通联小桁孔的孔壁。接种 3d 后， 细 胞明显伸展， 伸出伪足样结构贴附于材料表面， 并可见黏附于材料表面主桁孔及通联小桁 孔的孔壁。接种 10d 后， 细胞伸展更加明显， 细胞增殖数量更多， 并逐渐向孔隙中爬行侵入 式生长， 可见有粗糙的分泌颗粒及条索状胶原纤维。
( 四 ) 碱性磷酸酶染色
大量碱性磷酸酶 (ALP) 的分泌是干细胞向成骨细胞分化的一个特征， 成骨细胞胞 质中可见红色 ALP 阳性颗粒。培养 14d 后碱性磷酸酶染色观察细胞的成骨分化， 如图 3 所 示 (a) 为对照组仅用成骨诱导液培养， 见有稀疏的紫红色的 ALP 阳性细胞 ； (b) 为实验组用 墨鱼骨的成骨诱导液培养基浸提液， 见显著增多的 ALP 染色阳性细胞， 其密度显著高于对
照组。可见墨鱼骨有利于促进 hMSCs 成骨分化。
对比实验 1
墨鱼骨、 鲳鱼骨、 鲫鱼骨生物相容性平行实验
( 一 ) 扫描电子显微镜观察微波处理后墨鱼骨、 鲳鱼骨、 鲫鱼骨对人骨髓间充质干细胞黏附增殖的影响
将微波碳化墨鱼骨、 鲳鱼骨、 鲫鱼骨用环氧乙烷消毒后放入 36 孔板孔底， 每孔加 3 1.5ml 细胞悬液， 密度为 1×10 个 /ml， 每组重复 3 孔， 放入细胞培养箱培养箱在 37℃、 5％ CO2 的条件下培养 6h， 72h 后弃培养液， PBS 轻轻洗涤 3 次， 将各组墨鱼骨、 鲳鱼骨、 鲫鱼骨用 2.5％戊二醛初始固定， 4℃， 2h。 PBS 漂洗 1h， 放入 0.1％锇酸固定 1h， 梯度酒精脱水 (30％， 50 ％， 70 ％， 80 ％， 90 ％， 95 ％及 100 ％ ) 各 10min。临界点干燥， 喷金。在扫描电子显微镜 (JEOL JSM-6360LV， 日本 ) 下观察。
hMSCs 接种墨鱼骨 6h 后， 可见材料表面有球形细胞， 与材料黏附的细胞能够很好 的适应材料不规则的表面形貌包括主桁孔及通联小桁孔的孔壁。接种 3d 后， 细胞明显伸 展， 伸出伪足样结构贴附于材料表面， 并可见黏附于材料表面主桁孔及通联小桁孔的孔壁。 接种 10d 后， 细胞伸展更加明显， 细胞增殖数量更多， 并逐渐向孔隙中爬行侵入式生长， 可 见有粗糙的分泌颗粒及条索状胶原纤维。
hMSCs 接种鲳鱼骨， 本实验的材料与方法与实施例相同， 接种墨鲳鱼骨 6h 后， 可见 材料表面有较墨鱼骨少的球形细胞分布。接种 3d 后， 细胞明显伸展， 伸出伪足样结构贴附 于材料表面， 但细胞铺展密度及平均伸展面积均较墨鱼骨表面细胞小。接种 10d 后， 细胞未 见明显增多， 且没有墨鱼骨表面细胞呈立体状生长的现象。hMSCs 接种鲫鱼骨， 本实验的材 料与方法与实施例相同， 接种墨鲳鱼骨 6h 后， 可见材料表面只有极少的球形细胞分布。接 种 3d 后， 细胞伸出伪足样结构贴附于材料表面， 但未见明显增殖， 但细胞铺展密度及平均 伸展面积均很小。接种 10d 后， 细胞未见明显增多， 且没有墨鱼骨表面细胞呈立体状生长的 现象。
( 二 ) 碱性磷酸酶染色观察墨鱼骨、 鲳鱼骨、 鲫鱼骨浸提液对 hMSCs 成骨分化的影响 在 37℃、 5％ CO2 条件下用无小牛血清的 DMEM 培养基浸提环氧乙烷消毒后的墨鱼 骨、 鲳鱼骨、 鲫鱼骨， 浸提比例按 1g ∶ 10mL 比例配制， 所得浸提液加 10％小牛血清后配制 成墨鱼骨成骨诱导培养基作为实验组 1， 制成鲳鱼骨成骨诱导培养基作为实验组 2， 制成鲫 鱼骨成骨诱导培养基作为实验组 3。以上述三组培养基分别配制细胞悬液， 使细胞密度为 4 1×10 个 /ml， 在孔板每孔加 1.5ml 的上述两组细胞悬液， 每组重复 3 孔， 放入 37℃， 5％ CO2 培养箱， 每 3d 换液。培养 14d 后碱性磷酸酶染色观察细胞分化， 按照碱性磷酸酶染色试剂 盒操作。
实验组 1 见显著增多的 ALP 染色阳性细胞， 其密度高于实验组 2， 显著高于实验组 3。
总之， 微波碳化后获得的墨鱼骨生物相容性优于微波碳化后获得的鲳鱼骨， 更优 于微波碳化后获得的鲫鱼骨。
以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员， 在不脱离本发明方法的前提下， 还可以做出若干改进和补充， 这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。