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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201110040726.4 (22)申请日 2011.02.18 C12N 15/10(2006.01) (73)专利权人 中国科学院上海应用物理研究所 地址 201800 上海市嘉定区嘉罗公路 2019 号 (72)发明人 雷豪志 米丽娟 张益 陈佳佳 郭守武 胡钧 (74)专利代理机构 上海弼兴律师事务所 31283 代理人 薛琦 朱水平 CN 102286458 A,2011.12.21, CN 102465163 A,2012.05.23, Chun-Hua Lu et al.Using graphene to protect 。
2、DNA from cleavage during cellular delivery.Chem. Commun. .2010, 第 46 卷 3116-3118. Zhiwen Tang et al.Constraint of DNA on Functionalized Graphene Improves its Biostability and Specifi city.small .2010, 第 6 卷 ( 第 11 期 ),1205-1209. Haozhi Lei et al.Adsorption of double-stranded DNA to graphene oxide pr。
3、eventing enzymatic digestion. Nanoscale .2011, 第 3 卷 38883892. Hongliu Ren et al. “DNA Cleavage System of Nanosized Graphene Oxide Sheets and Copper Ions.ACSNANO .2010, 第 4 卷 ( 第 12 期 ),7169-7174. (54) 发明名称 一种稳定双链 DNA 的方法及双链 DNA 稳定剂 (57) 摘要 本发明公开了一种稳定双链 DNA 的方法， 其 包括如下步骤 ： 将双链 DNA 保存于含有氧化石墨 烯和金属离子的体。
4、系中 ； 所述的金属离子为一价 和 / 或二价金属离子。本发明还公开了与该方法 相应的双链DNA稳定剂。 本发明首次发现一价和/ 或二价金属离子可促使氧化石墨烯与双链 DNA 结 合， 从而有效的减弱或消除非限制性内切酶、 外切 酶以及限制性内切酶等多种生物酶对双链 DNA 的 酶切作用。 与其他稳定双链DNA的方法比较， 本发 明的双链 DNA 稳定方法及稳定剂不需要如硅纳米 颗粒或者硅纳米管等特殊的修饰， 且水溶性和分 散性更好， 成本廉价， 原料制备工艺成熟， 可在需 增强双链 DNA 稳定性的各种生物实验体系得到广 泛应用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李楠 (1。
5、9)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书7页 附图4页 CN 102643793 B 2016.07.06 CN 102643793 B 1.一种抑制DNA酶酶切双链DNA的稳定双链DNA的方法， 其特征在于： 其包括如下步骤： 将双链DNA保存于含有氧化石墨烯和金属离子的水溶液体系中； 所述的金属离子为镁离子、 钙离子、 钠离子和钾离子中的一种或多种； 所述的金属离子在所述水溶液体系中的浓度为 0.05250mM； 所述的氧化石墨烯在所述水溶液体系中的浓度为0.0050.3mg/ml。 2.如权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述的金属离子以水溶性盐的形。
6、式存在于所 述水溶液体系中； 所述的盐为氯化盐、 硫酸盐、 硝酸盐或碳酸盐。 权利要求书 1/1 页 2 CN 102643793 B 2 一种稳定双链DNA的方法及双链DNA稳定剂 技术领域 0001 本发明涉及一种稳定双链DNA的方法及双链DNA稳定剂。 背景技术 0002 双链DNA作为遗传信息的主要载体， 是生命活动中最重要的分子之一。 其独特的物 理、 化学性质， 也使其成为诸多领域的重要研究对象。 例如： 基于DNA分子特异碱基识别性的 生物传感器技术； 以DNA为原料的纳米机器或纳米图形组装技术； 以及以DNA分子为靶向分 子进行药物运输和基因治疗的技术等。 然而， DNA分子在。
7、生物体外时， 极易受环境因子影响， 如各种物理、 化学、 机械等因子微弱的变化， 就会使其发生损伤或断裂， 从而失去其原有的 功能。 0003 目前， 增强体外双链DNA稳定性的方法， 主要包括： 0004 1、 物理学方法 0005 如低温储存、 冷冻干燥、 通入惰性气体并避光等， 该过程可抑制外界环境因子导致 的生物化学损伤。 该方法已经被广泛应用于DNA的运输和保藏过程。 但由于需要专业的设 备， 并不适用于日常使用的DNA产品。 0006 2、 化学添加剂方法 0007 如可添加一定pH条件的Tris-EDTA(TE)缓冲液， 以保护DNA的碱基完整性， 放置其 开环或断裂， 从而增加。
8、DNA的稳定性。 该方法是目前应用非常广泛的溶液体系稳定DNA的方 法。 添加TE缓冲液后， 由于组分中含有大量EDTA， 可以络合多种生物酶反应的金属离子， 因 而增加了双链DNA的稳定性。 但该方法中， 通常对原始DNA的浓度要求较高， 因而将DNA用于 多种生化反应过程时， 必须对DNA原液中的TE含量进行稀释。 0008 3、 商品化稳定剂 0009BioMatricaTM公司开发出了名叫的DNA保护系统， 其公司合成了 一种聚合物， 可使干燥的DNA处于低湿休眠的状态， 然后使DNA获得长时间的保存而不被损 伤。 应用该方法可保证DNA产品运输稳定性， 但与传统物理学方法类似， 使用。
9、时需将DNA干粉 再溶解。 0010 4、 纳米材料保护DNA的方法 0011 近年来， 纳米材料对DNA稳定性的影响开始引起人们的兴趣。 例如： 应用碳纳米管 保护寡核苷酸进入细胞的药物传送体(CarbonnanotubesprotectDNAstrandsduring cellulardelivery， ACSNano.2008， 2(10)， 2023-2028.)； 使质粒DNA吸附在带有经过氨基 修饰的硅纳米颗粒表面或者硅纳米管内部(BioconjugatednanoparticlesforDNA protectionfromcleavage， J.Am.Chem.Soc.2003，。
10、 125， 7168-7169； Preparationof fluorescentsilicananotubesandtheirapplicationingene delivery.Adv.Mater.2005， 17， 404-407.)， 从而保护基因工程的质粒DNA在细胞内不被降 解； 通过纳米金颗粒与寡核苷酸结合(Nano-flares： probesfortransfectionandmRNA detectioninlivingcells.J.Am.Chem.Soc.2007， 129， 15477-15479.)， 从而增强核苷酸 说明书 1/7 页 3 CN 102643793。
11、 B 3 稳定性用于生物检测等。 0012 但是， 作为一种优秀的碳二维晶体材料， 氧化石墨烯对DNA稳定性影响研究刚刚开 始。 现有文献(ConstraintofDNAonfunctionalizedgrapheneimprovesits biostabilityandspecificity.Small2010， 6(11)， 1205-1209.)报道， 氧化石墨烯可增 强短单链DNA的稳定性， 单链DNA与氧化石墨烯通过 - 相互作用结合后， 可防止其被DNase I酶切， 但当其互补单链DNA存在时， 形成的双链可以被DNaseI酶切。 发明内容 0013 本发明所要解决的技术问题是为。
12、了克服现有的稳定双链DNA的方法或者需要专用 设备， 或者操作不够简便的缺陷， 而提供一种稳定双链DNA的方法及双链DNA稳定剂。 0014 本发明人基于大量实验的摸索， 意外发现， 对DNA酶的活性有促进作用的一价和/ 或二价金属离子反而可使氧化石墨烯与双链DNA结合， 从而达到显著的增强优异的防止DNA 酶酶切双链DNA的作用。 基于此， 本发明通过下述技术方案解决上述技术问题： 0015 本发明涉及一种稳定双链DNA的方法， 其包括如下步骤： 将双链DNA保存于含有氧 化石墨烯和金属离子的体系中； 所述的金属离子为一价和/或二价金属离子， 较佳的为镁离 子、 钙离子、 钠离子和钾离子中的。
13、一种或多种。 0016 其中， 所述的氧化石墨烯的量以可有效的减弱或消除DNA酶酶切双链DNA的用量为 准。 经本发明筛选， 所述的氧化石墨烯在体系中的浓度较佳的为0.0050.3mg/ml。 0017 其中， 所述的金属离子的量为可使氧化石墨烯有效的减弱或消除DNA酶酶切双链 DNA的用量为准。 经本发明筛选， 所述的金属离子在体系中的浓度较佳的为0.05250mM。 所 述的金属离子可以盐的形式加入体系中。 所述的盐为本领域可接受的对DNA无损害的水溶 性盐类， 如氯化盐、 硫酸盐、 硝酸盐或碳酸盐等。 0018 本发明还涉及一种双链DNA稳定剂， 其包括氧化石墨烯和金属离子； 所述的金属。
14、离 子为一价和/或二价金属离子， 较佳的为镁离子、 钙离子、 钠离子和钾离子中的一种或多种。 0019 其中， 所述的金属离子的存在形式可为盐， 所述的盐同前述。 0020 所述的双链DNA稳定剂可还包括水， 为溶液形式(能直接使用的溶液形式， 或需经 稀释才使用的浓缩液形式)， 也可为固体干粉形式(如冻干粉)。 0021 所述的双链DNA稳定剂中， 氧化石墨烯和金属离子的量以可有效的减弱或消除DNA 酶酶切双链DNA的量为准， 较佳的以使用时经稀释或不稀释能达到前述在体系中的较佳浓 度为宜。 0022 所述的双链DNA稳定剂可为所有成分混合的单一试剂形式， 也可为包含独立包装 组分的成套试剂。
15、盒形式。 0023 本发明的双链DNA稳定方法和稳定剂对双链DNA的保护作用不受DNA酶的酶切方式 的限制。 因此， 本发明的双链DNA稳定方法和稳定剂可适用于减弱或消除各种限制性或非限 制性DNA酶对DNA的酶切活性， 例如对不具特异识别位点的非限制性外切酶(如Bal31)和内 切酶(如DNaseI)， 以及具有特异识别位点的限制性内切酶(如EcoRII)。 0024 本发明中， 所述的氧化石墨烯可为现有的各种氧化石墨烯， 可通过市售获得， 或按 现有方法制备。 现有制备氧化石墨烯的方法均参照文献(Preparationofgraphite oxide.J.Am.Chem.Soc.1958，。
16、 80， 1339)中所述通过氯酸钾、 硝酸、 高锰酸钾或硫酸等氧化剂 说明书 2/7 页 4 CN 102643793 B 4 氧化石墨制备氧化石墨烯的方法。 例如， 具体可参照下述文献方法制备(1)Grapheneand GrapheneOxide： Synthesis， Properties， andApplications.Adv.Mater.2010， online.； (2)ReductionofgrapheneoxideviaL-ascorbicacid.Chem.Commun.， 2010， 46， 1112- 1114 ； ( 3 )HighYieldPreparationo。
17、fMacroscopicGrapheneOxide Membranes.J.Am.Chem.Soc.2009， 131， 898。 0025 在符合本领域常识的基础上， 上述各条件， 可任意组合， 即可得到本发明各较佳实 例。 0026 本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。 0027 本发明的积极进步效果在于： 本发明首次发现一价和/或二价金属离子可促使氧 化石墨烯与双链DNA结合， 从而有效的减弱或消除非限制性内切酶、 外切酶以及限制性内切 酶等多种生物酶对双链DNA的酶切作用。 与其他稳定双链DNA的方法比较， 本发明的双链DNA 稳定方法和稳定剂不需要如硅纳米颗粒或者硅纳米。
18、管等特殊的修饰， 且水溶性和分散性更 好， 成本廉价， 原料制备工艺成熟， 可在需增强双链DNA稳定性的各种生物实验体系得到广 泛应用。 附图说明 0028 图1为效果实施例1中不同浓度和种类的金属离子存在下， 氧化石墨烯与双链DNA 混合样品的琼脂糖凝胶电泳图。 0029 图2为效果实施例2在金属离子存在下氧化石墨烯抑制非限制性内切酶DNaseI对 双链DNA酶切的琼脂糖凝胶电泳图。 0030 图3为效果实施例3在金属离子存在下氧化石墨烯抑制非限制性外切酶Bal31对 双链DNA酶切的琼脂糖凝胶电泳图。 0031 图4为效果实施例4在金属离子存在下氧化石墨烯抑制限制性内切酶EcoRII对双 。
19、链DNA酶切的琼脂糖凝胶电泳图。 具体实施方式 0032 下面通过实施例的方式进一步说明本发明， 但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 按照常规方法和条件， 或按照商 品说明书选择。 0033 下述实施例中 ， 氧化石墨烯由上海交通大学郭守武教授课题组按照文献 (Preparationofgraphiteoxide.J.Am.Chem.Soc.1958， 80， 1339.)所述的制备方法合 成。 0034 效果实施例中， 双链DNA的来源为： 以pBR322DNA环状质粒为模板， 进行PCR扩增， 获 得长度为886bp的DNA目标片段(上。
20、游引物： TGACGACCATCAGGGACA； 下游引物： TAAAGC GGGCCATGTTAA)； DNaseI从Sigma公司购买； Bal31和EcoRII从TaKaRa公司购买。 0035 实施例1 0036 双链DNA稳定剂： 单一溶液形式(能直接使用)。 将需要保护的双链DNA加入该双链 DNA稳定剂， 溶液体系中含0.005mg/ml氧化石墨烯， 以及10mM硝酸镁。 0037 实施例2 说明书 3/7 页 5 CN 102643793 B 5 0038 双链DNA稳定剂： 单一溶液形式(能直接使用)。 将需要保护的双链DNA加入该双链 DNA稳定剂， 溶液体系中含0.3mg。
21、/ml氧化石墨烯， 以及0.05mM硫酸钠。 0039 实施例3 0040 双链DNA稳定剂： 固体干粉试剂盒形式， 包括分别独立包装的150mg氧化石墨烯和 5mol碳酸钠。 使用时， 用水配制为氧化石墨烯悬浊液， 以及氯化镁溶液， 将需要保护的双链 DNA加入该双链DNA稳定剂， 溶液体系中含15mg/ml氧化石墨烯， 50mM碳酸钠。 0041 实施例4 0042 双链DNA稳定剂： 单一溶液形式(浓缩液， 使用时用水稀释)。 用水稀释该双链DNA稳 定剂， 加入需要保护的双链DNA， 溶液体系中含0.15mg/ml氧化石墨烯、 20mM氯化镁、 20mM氯 化钙、 20mM氯化钠和20。
22、mM氯化钾。 0043 效果实施例1一价和二价金属离子促使氧化石墨烯与双链DNA的结合 0044 一、 不同浓度镁离子促使氧化石墨烯与双链DNA的结合 0045 1、 实验方法 0046 将双链DNA分别加入无镁离子或含不同浓度镁离子(终浓度分别为5、 2.5、 1、 0.5、 0.25、 0.1、 0.05mM)， 以及氧化石墨烯(终浓度0.15mg/ml)的溶液中， 经琼脂糖凝胶电泳对各 体系进行目标位置DNA量的比较。 0047 2、 实验结果 0048 实验结果如图1的a所示， 与双链DNA的阳性对照(泳道1)相比， 在没有镁离子参与 下双链DNA与氧化石墨烯混合后没有变化(泳道2)，。
23、 混合不同终浓度镁离子后(泳道37镁 离子终浓度分别为5、 2.5、 1、 0.5、 0.25、 0.1、 0.05mM)， 氧化石墨烯和双链DNA结合形成较大 的双链DNA-氧化石墨烯复合体， 表现为较为明显的拖尾现象或点样孔滞留。 0049 二、 不同金属离子促使氧化石墨烯与双链DNA的结合 0050 1、 实验方法 0051 将双链DNA分别加入含氯化镁(终浓度2.5mM)、 氯化钙(终浓度2mM)、 氯化钠(终浓 度100mM)和氯化钾(终浓度20mM)、 氧化石墨烯(终浓度0.15mg/ml)的溶液中， 经琼脂糖凝胶 电泳对各体系进行目标位置DNA量的比较。 0052 2、 实验结果。
24、 0053 实验结果如图1的b所示， 与双链DNA的阳性对照(泳道1)相比， 在没有金属离子参 与下双链DNA与氧化石墨烯混合后没有变化(泳道2)， 分别加入终浓度为2.5mM氯化镁(泳道 3)、 2mM氯化钙(泳道4)、 100mM氯化钠(泳道5)、 20mM氯化钾(泳道6)后， 氧化石墨烯和双链 DNA结合形成较大的双链DNA-氧化石墨烯复合体， 表现为较为明显的拖尾现象和点样孔滞 留。 由上述结果说明， 不同的其他一价和/或二价金属离子均可促使氧化石墨烯与双链DNA 的结合。 0054 效果实施例2对非限制性内切酶DNaseI的酶切活性的抑制 0055 一、 氧化石墨烯抑制DNaseI对。
25、双链DNA的酶切 0056 DNaseI是一种非限制性核酸酶， 可从DNA的任意位点进行酶切作用， 直至将全部 DNA片段酶切为单个核苷酸为止。 本发明使用非限制性内切酶DNaseI对添加或未添加氧化 石墨烯的DNA体系进行酶切， 以考察氧化石墨对抑制DNaseI对双链DNA的酶切作用。 0057 1、 实验方法 说明书 4/7 页 6 CN 102643793 B 6 0058 两种DNA体系： 一个是常规保存(水中， 4)的双链DNA， 另一个在常规保存溶液基 础上添加终浓度为0.15mg/ml的氧化石墨烯。 0059 按试剂盒说明书， 向上述两种DNA体系中分别加入10酶切反应缓冲液(体。
26、系中含 终浓度2mM氯化镁)， 以及1UDNaseI， 37温浴条件下进行酶切反应。 对常规保存的双链 DNA体系， 反应1min， 添加有氧化石墨烯的体系延长至10min和30min。 经琼脂糖凝胶电泳对 目标位置DNA量进行比较。 0060 2、 实验结果 0061 实验结果如图2的a所示， 与双链DNA的阳性对照(泳道1)相比， 未加氧化石墨烯的 双链DNA， 经过37温浴1min后， 目标位置双链DNA完全消失， (泳道2)； 而加入氧化石墨烯 后， 将温浴时间分别延长至10min(泳道3)和30min(泳道4)， 目标位置双链DNA仍然存在， 但 荧光强度减弱。 从图中可以看出， 在。
27、氯化镁存在下， 氧化石墨烯可抑制DNaseI对双链DNA的 酶切， 且保护时间可达30min以上。 0062 二、 不同浓度的氧化石墨烯抑制DNaseI对双链DNA的酶切 0063 1、 实验方法 0064 分别采用添加终浓度为0、 0.025、 0.05、 0.1、 0.15、 0.2和0.25mg/ml氧化石墨烯的 DNA体系。 按试剂盒说明书， 向上述各DNA体系中分别加入10酶切反应缓冲液(体系中含终 浓度2mM氯化镁)， 以及1UDNaseI， 经37温浴10min。 经琼脂糖凝胶电泳对目标位置DNA量 进行比较。 0065 2、 实验结果 0066 实验结果如图2的b所示， 双链D。
28、NA的阳性对照为泳道1， 泳道2-8中， 氧化石墨烯终 浓度依次为0、 0.025、 0.05、 0.1、 0.15、 0.2和0.25mg/ml。 该结果表明， 在氯化镁存在下， 0.0250.25mg/ml的氧化石墨烯均可在较好保护双链DNA， 减弱DNaseI的酶切作用。 随着 氧化石墨烯浓度逐渐增加， 在阳性对照的位置， 双链DNA的荧光强度也逐渐增加， 尤其是在 氧化石墨烯终浓度为0.10.15mg/ml时， 保护作用最显著。 0067 效果实施例3对非限制性外切酶Bal31酶切活性的抑制 0068 一、 氧化石墨烯抑制Bal31对双链DNA的酶切 0069 Bal31核酸酶为一种外。
29、切酶， 可从双链DNA的两端同时进行酶切反应， 直至将全部 DNA片段切为单个核苷酸为止。 本发明使用非限制性外切酶Bal31， 对添加或未添加氧化石 墨烯的DNA体系进行酶切， 以考察氧化石墨对抑制Bal31对双链DNA的酶切作用。 0070 1、 实验方法 0071 两种DNA体系： 一个是常规保存(水中， 4)的双链DNA， 另一个在常规保存溶液基 础上添加终浓度为0.10mg/ml的氧化石墨烯。 0072 按试剂盒说明书， 向上述两种DNA体系中分别加入5酶切反应缓冲液(体系中含 终浓度为240mM氯化钠、 4.8mM氯化钙、 4.8mM氯化镁)， 以及2UBal31， 37温浴条件下。
30、进行 酶切反应。 对常规保存的双链DNA体系， 反应2min。 添加有氧化石墨烯的体系延长至30min和 60min。 经琼脂糖凝胶电泳对目标位置DNA量进行比较。 0073 2、 实验结果 0074 实验结果如图3的a所示， 与双链DNA的阳性对照(泳道1)相比， 未加氧化石墨烯的 双链DNA， 经37温浴2min后， 目标位置双链DNA完全消失(泳道2)； 而加入氧化石墨烯后， 将 说明书 5/7 页 7 CN 102643793 B 7 温浴时间分别延长至30min(泳道3)和60min(泳道4)， 目标位置双链DNA仍然存在， 但荧光强 度减弱。 从图中可以看出， 在氯化钠、 氯化钙和。
31、氯化镁的存在下， 氧化石墨烯可抑制Bal31 对双链DNA的酶切， 且保护时间可达60min以上。 0075 二、 不同浓度的氧化石墨烯抑制Bal31对双链DNA的酶切 0076 1、 实验方法 0077 分别采用添加0、 0.05、 0.1、 0.15、 0.2、 0.25和0.3mg/ml氧化石墨烯的DNA体系， 按 试剂盒说明书， 向上述各DNA体系中分别加入5酶切反应缓冲液(体系中含终浓度240mM氯 化钠、 4.8mM氯化钙、 4.8mM氯化镁)， 以及2UBal31， 经37温浴2min。 经琼脂糖凝胶电泳对 目标位置DNA量进行比较。 0078 2、 实验结果 0079 实验结果。
32、如图3的b所示， 双链DNA的阳性对照为泳道1， 泳道2-8中， 氧化石墨烯浓 度依次为0、 0.05、 0.1、 0.15、 0.2、 0.25、 0.3mg/ml。 结果表明， 在该体系下， 0.050.3mg/ml 氧化石墨烯均可保护双链DNA， 随着氧化石墨烯浓度逐渐增加， 在阳性对照的位置， 双链DNA 的荧光强度也逐渐增加， 0.10.25mg/ml的氧化石墨烯(泳道4-7)保护双链DNA的效果最 好。 0080 效果实施例4对限制性内切酶EcoRII酶切活性的抑制 0081 一、 氧化石墨烯抑制EcoRII对双链DNA的酶切 0082 EcoRII核酸酶是一种限制性内切酶， 只对。
33、具有特异识别位点的双链DNA位置进行 酶切反应， 针对本实施例中的双链DNA(886bp)， 该内切酶作用位点在该序列的第371bp处， 可将该双链DNA酶切成371bp和515bp两种长度的DNA。 本发明使用限制性内切酶EcoRII， 对 添加或未添加氧化石墨烯的两种DNA体系进行酶切， 以考察氧化石墨对抑制EcoRII对双链 DNA的酶切作用。 0083 1、 实验方法 0084 两种DNA体系： 一个是常规保存(水中， 4)的双链DNA， 另一个在常规保存溶液基 础上添加终浓度为0.05mg/ml的氧化石墨烯。 0085 按试剂盒说明书， 向上述两种DNA体系中分别加入10酶切反应缓冲。
34、液(体系中含 终浓度2.5mM氯化镁、 25mM氯化钾)， 以及2UEcoRII， 37温浴条件下进行酶切反应。 对常 规保存的双链DNA体系， 反应8min。 添加有氧化石墨烯的体系延长至30min和60min。 经琼脂 糖凝胶电泳对目标位置DNA量进行比较。 0086 2、 实验结果 0087 实验结果如图4的a所示， 与双链DNA的阳性对照(泳道1)相比， 未加氧化石墨烯的 双链DNA， 经37温浴8min后， 目标位置双链DNA完全消失， 在其下方产生了两条DNA产物条 带(泳道2)； 而加入氧化石墨烯后， 将温浴时间分别延长至30min(泳道3)和60min(泳道4)， 虽然仍有少量。
35、双链DNA被限制性内切酶酶切， 但大部分双链DNA被保留下来。 从图中可以看 出， 在氯化镁和氯化钾的作用下， EcoRII存在下， 氧化石墨烯可抑制EcoRII对双链DNA的 酶切， 且保护时间可达60min以上。 0088 二、 不同浓度的氧化石墨烯抑制EcoRII对双链DNA的酶切 0089 1、 实验方法 0090 分别采用添加0、 0.005、 0.125、 0.025、 0.05和0.06mg/ml氧化石墨烯的DNA体系， 按 说明书 6/7 页 8 CN 102643793 B 8 试剂盒说明书， 向上述两种DNA体系中分别加入10酶切反应缓冲液(体系中含终浓度 2.5mM氯化镁。
36、、 25mM氯化钾)， 以及2UEcoRII， 经37温浴8min。 经琼脂糖凝胶电泳对目标位 置DNA量进行比较。 0091 2、 实验结果 0092 实验结果如图4的b所示， 双链DNA的阳性对照为泳道1， 泳道2-7中， 氧化石墨烯浓 度依次为0、 0.005、 0.125、 0.025、 0.05和0.06mg/ml。 结果表明， 随着氧化石墨烯浓度逐渐增 加， 目标位置的双链DNA的荧光强度略有下降， 但被EcoRII降解的产物也减少。 该结果表明 在这个体系， 0.0050.06mg/ml的氧化石墨烯均能起到保护双链DNA的作用， 但从特异性和 产量综合考虑， 0.050.06mg/ml的氧化石墨烯用量更佳。 说明书 7/7 页 9 CN 102643793 B 9 图1 说明书附图 1/4 页 10 CN 102643793 B 10 图2 说明书附图 2/4 页 11 CN 102643793 B 11 图3 说明书附图 3/4 页 12 CN 102643793 B 12 图4 说明书附图 4/4 页 13 CN 102643793 B 13 。