结核分枝杆菌利福平耐药突变可视化检测探针及其应用.pdf

本发明公开了一种结核分枝杆菌利福平耐药突变可视化检测探针及其应用。本发明针对利福平耐药突变，根据结核分枝杆菌利福平耐药的rpoB基因突变核心区所包含的突变位点设计合成检测探针簇，包括：共有的锚定探针A、绝缘探针L和R、突变检测探针B和共有的竞争探针SIB，探针B与和探针SIB具有相同的靶DNA互补区，仅突变位点的碱基种类不同。具体探针簇包含9个探针组，每个探针组含一种特定的突变检测探针B，此法设计的各探针组和探针簇对合成的野生型和突变型检测片段有良好的区分性，并能准确检测利福平耐药结核分枝杆菌rpoB基因525-529位氨基酸具体的突变位点，具有良好的应用前景。

1.结核分枝杆菌利福平耐药突变可视化检测探针，其包括：锚定探针，其3’端含有3段GGG序列参与G-四链体形成，或其3’端含有1段GGG序列参与G-四链体形成；竞争探针，其互补区与野生型靶序列完全互补，所述野生型靶序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；突变检测探针，其互补区与相应的突变型靶序列完全互补，其5‘端具有1段GGG序列参与G-四链体形成，或其5‘端具有3段GGG序列参与G-四链体形成；绝缘探针，包括探针L和探针R，分别能结合在锚定探针靶向区域的下游和突变检测探针靶向区域的上游，和单链靶核酸形成稳定的双链；所述锚定探针的互补区与靶序列上的与突变检测探针互补区段的下游互补，所述锚定探针与突变检测探针结合在相应的突变型靶序列上时，两者之间能够形成G-四链体。 2.根据权利要求1所述的可视化检测探针，其特征在于，所述锚定探针具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述竞争探针具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述突变检测探针为SEQ ID No.4~12所示核苷酸序列中的一个或多个，所述绝缘探针包括探针L和探针R，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.13和14所示。 3.含有权利要求1或2所述可视化检测探针的试剂盒。 4.权利要求1或2所述可视化检测探针在结核分枝杆菌利福平耐药突变检测中的应用。 5.一种可视化检测结核分枝杆菌利福平耐药突变的方法，其包括如下步骤：A、PCR扩增待测样品的靶核苷酸序列；B、将上述A的探针与靶核苷酸互补配对，并加入Hemin，通过DNA过氧化物酶所催化的显色反应，来判断是否存在结核分枝杆菌利福平耐药突变。

技术领域

本发明属于病原生物学、分子微生物学和核酸化学领域，涉及一种新型的基因点突变检 测探针的设计方法和序列，以及其在结核分枝杆菌利福平耐药突变检测中的应用，这种方法 可以直观快速并可视化的检测结核分枝杆菌利福平耐药突变。

背景技术

由结核分枝杆菌引起的结核病(Tubercu1osis，简称TB)是一种古老的疾病，在很 早以前就在世界广泛传播，20世纪50年代以来，异烟肼、利福平等有效治疗结核药 物的发现，大大提高了结核病治愈率，并降低了结核病的复发率，使结核病成为一种 可治愈和控制的疾病。在一些发达国家，结核病已基本得到控制。然而近些年来，由 于一些国家对结核病防治工作的忽视，结核病的防治不能获得预期效果；很多地方结 核病化疗方案不合理，管理不善，缺乏监控，造成结核分枝杆菌耐药菌株，特别是耐 多药菌株的产生和传播，加大结核病治疗的难度，加剧结核病疫情的恶化；加上艾滋 病的流行以及经济全球化造成的人口广泛流动，促使结核病卷土重来，重新成为全球 紧迫的公共卫生问题。到了20世纪90年代，结核病疫情在世界的许多地方已经失控， 全球三分之一的人口感染结核分枝杆菌，每年新发结核病人约为800～1000万，每年 约有300万人死于结核病。中国结核病的疫情同样严峻，呈现患病率高、死亡率高、 耐药率高、年递减率低的“三高一低”的势态。当前我国是全球22个结核病高负担国 之一，结核病人总数仅少于印度，是全世界患者第二多的国家。面对这样的形势，科 研工作者需要发展新的诊断技术和治疗药物，解决结核病防治中的棘手问题。

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)也常简称为结核杆菌或结核菌，是 结核病的致病菌。结核分枝杆菌耐药主要是由于基因组中药物靶基因随机突变造成 的。目前使用的一线抗结核药物主要包括利福平和异烟肼，其中利福平在细菌中的靶 蛋白为RNA聚合酶的β亚基，利福平与RNA聚合酶的β亚基结合，阻碍mRNA合成， 抑制转录过程，阻断细菌的蛋白质合成，达到抑菌的作用。研究表明结核分枝杆菌利福平耐 药通常由其RNA聚合酶β亚基编码基因rpoB突变所致，这些突变大部分(90％以上)位于 一个81bp的区域，称之为RFP耐药决定区(Rifampicin Resistant Determination Region， RRDR)。

目前耐药结核分枝杆菌检测的方法主要是培养法，但结核分枝杆菌生长缓慢，需要4～ 8周才能给出结果，而且阳性率不高，仅为30％～40％，导致很多结核病人得不到及时诊治。 而基因突变和结核分枝杆菌耐药性之间具有相关性，因此很多研究者发展各种突变检测的方 法，通过检测相关的基因突变来检测结核菌耐药。目前研究者用于检测结核分枝杆菌耐药突 变的方法包括分子信标和反向探针杂交，但这两种方法操作较复杂，且需要专门的仪器。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足，提供一种针对耐药结核分枝杆菌检测的可视化检测探 针，用于结核病利福平耐药突变的可视化检测。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

结核分枝杆菌利福平耐药突变可视化检测探针，其包括：

锚定探针，其3’端含有3段GGG序列参与G-四链体形成，或其3’端含有1段GGG序 列参与G-四链体形成；

竞争探针，其互补区与野生型靶序列完全互补，所述野生型靶序列的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；

突变检测探针，其互补区与相应的突变型靶序列完全互补，其5‘端具有1段GGG序列 参与G-四链体形成，或其5‘端具有3段GGG序列参与G-四链体形成；

所述锚定探针的互补区与靶序列上的与检测探针互补区段的下游互补，所述锚定探针与 检测探针在结合在相应的突变型靶序列上时，两者之间能够形成G-四链体；

在对靶序列PCR产物进行检测时，为防止发夹结构影响探针与靶核酸的结合，其还包 括一对绝缘探针，所述绝缘探针分别结合在锚定探针结合区域的下游和突变检测探针结合区 域的上游。在反应体系中加入这两个探针能与探针(锚定探针和突变检测探针)在靶核酸结 合区域的旁侧区域互补，和单链靶核酸形成稳定的双链，从而打开靶核酸形成的发夹结构， 有利于突变检测探针与靶核酸的结合。

针对耐药结核分枝杆菌检测，本发明选用结核分枝杆菌RNA聚合酶β亚基编码基因 rpoB为目的基因，主要集中于其利福平耐药决定区，这段区域负责编码相当于大肠杆菌RNA 聚合酶β亚基507位至533位，共27个氨基酸(黄海荣，金奇，马玙，陈曦，李惠文，庄玉 辉.中国耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变特点.中华结核和呼吸杂志，2001， 24(4)：231～235)。

具体地，本发明根据rpoB基因突变核心区525-529位氨基酸所包含的所有突变类型 设计相应的检测探针簇和若干探针组，探针簇包含一条共有的锚定探针A，一条共有的竞争 探针SIB，及根据突变类型设计的一系列突变检测探针B。探针簇包含若干探针组，分别针 对检测区域内相应的突变类型。所述锚定探针具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述竞 争探针具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述突变检测探针为SEQ ID No.4～12所示核 苷酸序列中的一个或多个。此外还可包括绝缘探针L和探针R，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.13和14所示。

为方便使用，本发明还包括含有所述上述可视化检测探针的试剂盒。

上述可视化检测探针在结核分枝杆菌利福平耐药突变检测中的应用。

本发明还提供一种可视化检测结核分枝杆菌利福平耐药突变的方法，其包括如下步骤：

A、PCR扩增待测样品的靶核苷酸序列；

B、将上述探针与靶核苷酸互补配对，并加入Hemin，通过DNA过氧化物酶所催化的 显色反应，来判断是否存在结核分枝杆菌利福平耐药突变。

发明的优点和效果：

1、可用于可视化结核分枝杆菌利福平多位点耐药突变检测，包括9种突变类型；探针 簇及其包含的探针组均可很好的区分野生型序列和突变型序列，所有的探针组对相应突变型 序列和野生型序列的区分度，即探针对二者产生信号强度的比值，均大于20倍；而探针簇 对突变型序列和野生型序列的区分度均大于15倍；所有结果均仅用肉眼观察即可明确地区 分突变型序列和野生型序列。

2、本发明设计的探针体系包括两个层次，可满足不同检测需要，探针簇可用于快速筛 查结核分枝杆菌rpoB基因的利福平耐药决定区是否存在突变；而探针组则可用于检测某种 特定突变，特别是那些与高度耐药相关的突变类型。

3、本发明设计的探针组和探针簇能够对临床样品来源的具有复杂二级结构的PCR产物 检测表现出很好的区分度，目前所得结果对突变型和野生型rpoB基因PCR产物的区分度大 于7倍。

附图说明

图1.结核分枝杆菌rpoB基因利福平(RFP)耐药决定区突变位点

结核分枝杆菌利福平耐药决定区，rpoB基因510-533位氨基酸，其中下划线表示 易突变的碱基。

图2.DNA过氧化物酶的不对称拆分-组装

将DNA过氧化物酶序列d(GGGTAGGGCGGGTTGGG)，不对称地分为两个部分，一 部分包含3段GGG序列，另一部分只含有一段GGG序列，这两段序列的5’端或3’端分别 与靶核酸相邻区域互补序列融合，形成探针A和探针B。有靶DNA-C存在时，探针A和探 针B与靶核酸的相邻区域互补，它们中DNA过氧化物酶形成序列相互靠近，折叠为G-四 链体结构，与Hemin结合后，形成有活性的DNA过氧化物酶。这样可通过DNA过氧化物 酶所催化的显色反应，检测溶液中靶核酸C的存在。

图3.探针簇对野生型序列和相应突变型序列的选择性

探针簇对野生型序列和相应突变型序列都表现出好的选择性，从照片上看，探针簇本身 及野生型检测样品基本无色，而各种突变型样品则是很明显的绿色(2～10)。表格为探针簇 实验方案和结果，探针簇对相应突变型序列的信号是对野生型信号的15倍以上。

图4.各探针组对野生型序列和相应突变型序列的选择性

各探针组对野生型序列和相应突变型序列都表现出好的选择性，从照片上各探针组对野 生型序列基本无色，而相应突变序列则是明显的绿色(1b～9b)。表格为各探针组实验方案 和结果，所有的探针组对相应突变型序列的信号是对野生型信号的20倍以上。

图5.探针簇对突变型菌株His526Tyr的检测

探针簇对利福平耐药结核分枝杆菌ropB基因突变情况的检测，探针簇对野生型菌株 PCR产物及对照基本无色，而突变型菌株PCR产物则呈现明显的绿色(d)。探针簇对突变 型菌株产物信号是对野生型信号的7倍以上。检测结果耐药菌株在525-529位氨基酸区域有 突变，与测序结果相符。

图6.第3探针组对突变型菌株His526Tyr的检测

第3探针组对利福平耐药结核分枝杆菌ropB基因突变情况的检测，探针组对野生型菌 株PCR产物及对照基本无色，而突变型菌株产物则呈现明显的绿色(d)，探针组对突变型 菌株产物信号是对野生型信号的10倍以上。检测结果耐药菌株为526位氨基酸突变，CAC 突变为TAC，与测序结果相符。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若无特别说明，本 发明中所涉及到的实验均为本领域技术人员所熟知常规操作。

实施例1

1.DNA过氧化物酶突变检测探针体系的设计

(1)rpoB基因突变核心区序列如图1所示，本发明包含525位到529位氨基酸的 9种突变类型，具体突变及相应的检测探针如下表：

  突变位点   突变类型   对应检测探针   526   C→A   B526-1T   526   C→G   B526-1C   526   C→T   B526-1A   526   A→G   B526-2C   526   A→T   B526-2A   526   C→G   B526-3C   526   C→G，A→C   B526-1C2G   526   C→T，A→G   B526-1A2C   526，529   A→G，C→A，G→A   B526-2C3T-529-2T

(2)根据结核分枝杆菌rpoB基因利福平(RFP)耐药决定区突变位点设计相应的检测探 针簇，探针簇包含三个部分：一条共有的锚定探针A，其3’端含有3段GGG序列参与G- 四链体形成；一条共有的竞争探针SIB，其互补区与野生型靶目标完全互补；根据突变类 型设计的一系列突变检测探针B，每条探针B的互补区与相应突变型的靶目标完全互补， 其5‘端具有一段GGG序列参与G-四链体形成。C为待检测基因片段。

(4)所需达到的检测目标：探针簇和各探针组均能很好的区分野生型和相应的 突变型DNA序列。

根据以上原则设计的探针组如下：

第1探针组：A，SIB，B526-1T(TGGGTTCGGCGCTTGTTGGTCAACCC)

第2探针组：A，SIB，B526-1C(TGGGTTCGGCGCTTGTCGGTCAACCC)

第3探针组：A，SIB，B526-1A(TGGGTTCGGCGCTTGTAGGTCAACCC)

第4探针组：A，SIB，B526-2C(TGGGTTCGGCGCTTGCGGGTCAACCC)

第5探针组：A，SIB，B526-2A(TGGGTTCGGCGCTTGAGGGTCAACCC)

第6探针组：A，SIB，B526-3C(TGGGTTCGGCGCTTCTGGGTCAACCC)

第7探针组：A，SIB，B526-1C2G(TGGGTTCGGCGCTTGGCGGTCAACCC)

第8探针组：A，SIB，B526-1A2C(TGGGTTCGGCGCTTGCAGGTCAACCC)

第9探针组：A，SIB，B526-2C3T-529-2T(TGGGTTTGGCGCTTTCGGGTCAACCC)

共有锚定探针A：GGCCCCAGCGCCGACATGGGTTGGGTTGGG

共有竞争探针SIB：CCAACTTCGGCGCTTGTGGGTCAACCC

探针簇包括锚定探针A，竞争探针SIB及9种突变检测探针B，即将上述9组探针混到 一起构成探针簇。

另外在检测PCR产物时，各探针组和探针簇中还包括帮助打开PCR产物复杂二级结构 的绝缘探针L和R。其序列如下：

L：CGACAGCGGGTTGTTCTGGTCCATG

R：GGCACGCTCACGTGACAGACCGCCG

2、验证探针簇和各探针组对野生型序列和相应突变型序列的选择性

(1)寡核苷酸定量

根据各寡核苷酸(探针A，B，SIB，待测片段C)样品管上所标注的纳摩尔数加入10倍 微升数的超纯水(电阻率为1018Ω)，充分溶解。取10μL寡核苷酸母液加入990μl双蒸水中， 即稀释100倍，用于寡核苷酸定量，定量溶液95℃加热5分钟，取出迅速置于冰上冷却，混匀 后离心，破坏高浓度寡核苷酸母液中可能存在的二级结构，保证寡核苷酸为单链状态。测定 寡核苷酸定量溶液在260nm处的紫外吸收值，根据各寡核苷酸的毫摩尔吸光系数，得到母 液浓度，根据需要将各寡核苷酸母液稀释成100μM或50μM，-20℃保存。

(2)检测样品的动力学测试

DNA过氧化物酶催化H2O2氧化ABTS2-所生成的ABTS·-在414nm处有最大吸收， 我们通过监测检测体系在414nm的吸收来判断检测体系的过氧化物酶活性，进而推断靶核 酸存在与否或相关突变的类型。DNA过氧化物酶反应在缓冲液：25mM HEPES-NH4OH(pH 8.0)、200mM NaCl、20mM KCl中进行，反应底物H2O2和ABTS2-的浓度均为2mM。每 个样品含有指定浓度的各种寡核苷酸和50nM Hemin。

具体步骤，每个1.5mL离心管中加入约760μL超纯水、100μL10×混合盐溶液(2MNaCl 200mM KCl)、100μL10×H-Buffer(250mM HEPES-NH4OH(pH＝8.0))及指定浓度的各种 寡核苷酸(探针A、B在检测体系中的终浓度为100nM，SIB为300nM，，人工合成的C片 段终浓度为100nM)(见图3和图4中的表格，表格中“C526-1A”表示ropB氨基酸第526 位的第一个密码子突变为A的待检片段，其他的待检片段也采取类似的表示方式，Bmix表 示9突变检测探针B的混合物)；样品混和均匀后离心，95℃加热5分钟，取出冷却至室 温；每个样品中加入1μL50μM Hemin溶液，Hemin终浓度为50nM，混匀后离心，室温 放置1小时或4℃放置3小时。

检测反应在室温下进行，用Shimadzu UV-2550型分光光度计的动力学模式监测反应的 动力学过程。414nm为监测波长，1秒记录1次数据，记录3分钟。反应前，每个样品中加 入40μL50mM ABTS溶液，混匀，取500μL样品于参比池，再取1μL1M H2O2粘附在 样品池内壁，将剩下的500μL样品沿粘附有H2O2的样品池内壁注入，关闭样品仓门，点击 “开始”按钮，开始记录数据。

3.利用探针组和探针簇对临床分离的利福平耐药结核分枝杆菌rpoB基因核心区域突变情况 进行检测

(1)提取野生型和耐药结核分枝杆菌基因组DNA，使用天根公司细菌基因组提取试剂盒 (目录号：DP302)步骤如下：

取细菌培养液5毫升，12000rpm离心1分钟，尽量弃尽上清。加入180μl溶菌酶缓冲 液重悬菌体(缓冲液配方：20mM Tris·HCl，pH 8.0；2mM Na2-EDTA；1.2％Triton，20mg/ml 溶菌酶)，37℃水浴2小时，加入4μl RNaseA(100mg/ml)，混匀，常温10分钟，加入20μl 蛋白酶K溶液，55℃水浴40分钟，加入220μl缓冲液GB，振荡15秒，70℃水浴10分 钟，12000rpm离心1分钟，取上清转移到新的EP管。加入220μl无水乙醇，将混合物全部 转入离心柱CB3，12000rpm离心1分钟，弃废液，向CB3中加入500μl缓冲液GD，12000rpm 离心1分钟，弃废液，向CB3中加入700μl缓冲液PW，12000rpm离心1分钟，弃废液， 向CB3中加入500μl缓冲液PW，12000rpm离心1分钟，弃废液。空离心柱12000rpm离心 2分钟，之后室温静置3分钟，将吸附柱CB3转入一个干净的离心管，向吸附膜中间加入 100μl双蒸水，静置2分钟，12000rpm离心1分钟，再次向吸附膜中间加入100μl双蒸水， 静置2分钟，12000rpm离心1分钟。离心管中即为细菌基因组DNA。

(2)针对rpoB基因设计引物，PCR得到588bp的双链片段 PCR反应体系如下：

94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，30cycles，72℃5min。

引物序列如下：

ropP1：GAGCGGATGACCACCCAGG

ropP2：CAGGAAGGGAATCATCGCGG

(3)以588bp双链为模板，PCR得到158bp单链片段

94℃5min，94℃1min，52℃1min，72℃1min，40cycles，72℃5min。

引物序列如下：

ropTR8：GTGCACGTCGCGGACCTCCA

ropTR9：TCGCCGCGATCAAGGAGT

(4)用上述显色方法对野生型和耐药结核分枝杆菌rpoB基因单链PCR产物进行检测

在对利福平耐药结核分枝杆菌PCR产物进行检测时，为防止发夹结构影响探针A，B与 靶核酸的结合，特加入绝缘探针L，R，在反应体系中加入这两个探针能与探针A，B在靶核酸 结合区域的旁侧区域互补，和单链靶核酸形成稳定的双链，从而打开靶核酸形成的发夹结构， 有利于检测探针与靶核酸的结合。检测方法同实施例1，绝缘探针L，R的终浓度为100nM， 反应结果记录的是180秒(sec)的结果。其反应体系如下表：

(5)将588bp双链PCR产物送公司测序，确定具体突变位点，与探针检测结果相比较。

本发明检测结果如图5～6所示，突变型的结果均肉眼可见，按本发明方法检测的结果与 测序结果比较，结果完全一致。

序列表说明：SEQ ID No.1是结核分枝杆菌利福平耐药决定区的碱基序列，SEQ ID No.2结核分枝杆菌利福平耐药检测的锚定探针，SEQ ID No.3是竞争探针，SEQ ID No.4～12是9个不同的突变检测探针，SEQ ID No.13～14是绝缘探针L和R，SEQ ID No.15～18 分别是引物ropP1&ropP2以及ropTR8&ropTR9。

 序列表

<110>  武汉大学

<120>  结核分枝杆菌利福平耐药突变可视化检测探针及其应用

<130> 

<160>  18   

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  72

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

cagctgagcc aattcatgga ccagaacaac ccgctgtcgg ggttgaccca caagcgccga       60

ctgtcggcgc tg                                                           72

<210>  2

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

ggccccagcg ccgacatggg ttgggttggg                                    30

<210>  3

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

ccaacttcgg cgcttgtggg tcaaccc                                           26

<210>  4

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

tgggttcggc gcttgttggt caaccc                                            26

<210>  5

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

tgggttcggc gcttgtcggt caaccc                                            26

<210>  6

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

tgggttcggc gcttgtaggt caaccc                                            26

<210>  7

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  7

tgggttcggc gcttgcgggt caaccc                                         26

<210>  8

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  8

tgggttcggc gcttgagggt caaccc                                         26

<210>  9

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  9

tgggttcggc gcttctgggt caaccc                                         26

<210>  10

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

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tgggttcggc gcttggcggt caaccc                                         26

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<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  11

tgggttcggc gcttgcaggt caaccc                                         26

<210>  12

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  12

tgggttcggc gctttcgggt caaccc                                         26

<210>  13

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  13

cgacagcggg ttgttctggt ccatg                                          25

<210>  14

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  14

ggcacgctca cgtgacagac cgccg                                          25

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<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  15

gagcggatga ccacccagg                                                    19

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<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  16

caggaaggga atcatcgcgg                                                   20

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<212>  DNA

<213>  人工序列

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gtgcacgtcg cggacctcca                                                   20

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<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  18

tcgccgcgat caaggagt                                                     18