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1、(10)申请公布号 CN 102071169 A (43)申请公布日 2011.05.25 CN 102071169 A *CN102071169A* (21)申请号 201010277020.5 (22)申请日 2010.09.09 CGMCC NO.4107 2010.08.30 C12N 5/20(2006.01) C07K 16/14(2006.01) G01N 33/577(2006.01) G01N 33/569(2006.01) C12R 1/91(2006.01) (71)申请人 中国疾病预防控制中心营养与食品 安全所 地址 100021 北京市朝阳区潘家园南里七号 申请人 山。
2、东大学 (72)发明人 李凤琴 赵丽 王伟 (54) 发明名称 抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的杂交瘤 细胞及其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明涉及生物工程领域, 特别的涉及一种 抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (deoxynivalenol, DON) 单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法和应 用。通过细胞融合, 免疫抗原和检测抗原均采用 DON-BSA, 获得了高效分泌抗 DON 单克隆抗体的杂 交瘤细胞株并保藏, 该抗体灵敏度高, 特异性强, 与 DON 亲和力高, 与其他毒素交叉反应低, 为 DON 检测试剂的研制奠定了基础。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共。
3、和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 CN 102071173 A1/1 页 2 1. 一种抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆的杂交瘤细胞, 其特征在于 : 所述细胞的保藏号 为 CGMCC NO.4107。 2. 一种抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体, 其特征在于 : 由保藏号为 CGMCC NO.4107 的杂交瘤的细胞所分泌, DON 最低检出浓度是 9.2g/L。 3. 一种抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆的制备方法, 其特征在于包括以下依次步骤 : 1) 偶联物制备 BSA, DON 分别与 1, 3 二环基二亚胺和 N- 羟基琥珀酰亚胺偶联, 。
4、通过戊二酸将二者连接 形成 DON-BSA 偶联物, DON 与 BSA 摩尔比为 50 1 ; 将 DON-BSA 偶联物配制成 1mg/ml 溶液, 采用小剂量长周期的免疫方案, 对 6 8 周龄的雌性小鼠 ; 首次免疫用 100g DON-BSA, 加 入等量完全福氏佐剂 ; 2 周后, 用 100g DON-BSA, 加入等量不完全福氏佐剂 ; 再 2 周后, 用 100g DON-BSA, 加入等量不完全福氏佐剂 ; 2 周后, 强化免疫, 50g DON-BSA 溶液脾内免 疫, 4d 后取脾细胞进行融合 ; 2) 细胞融合 将 Sp2/0 细胞与小鼠脾细胞按 1 10 混合于 5。
5、0mL 无菌离心管中, 1000r/min 离心 10min, 弃上清, 轻弹管底使细胞充分散开 ; 将离心管置 37水浴中, 缓慢加入 37预温的 50 PEG 0.7mL, 1min 内加完 ; 于 37静置 90s, 缓慢加入 20mL 1640 培养液终止 PEG 的作 用 ; 800r/min 离心 10min, 弃上清液, 用含 20小牛血清的 HAT 选择培养基悬浮沉淀的细 胞, 调整细胞浓度为 2106/mL, 然后分别接种于加有饲养细胞的 96 孔培养板中, 置 37, 5 CO2 培养箱中培养, 在融合 7 14d 后改用 HT 培养液 ; 逐日观察细胞生长情况, 待长至 。
6、1/3 1/2 视野, ELISA 法检测上清液中抗体 ; 3) 杂交瘤筛选及抗体检测 以 0.5g/ml DON-BSA、 BSA 分别为包被抗原, 用间接 ELISA 法筛选融合细胞上清中抗 DON 单克隆抗体, 用 DON 毒素间接竞争抑制性 ELISA 法确证单克隆抗体的特异性 ; 以免疫小 鼠的血清为阳性对照, 以 Sp2/0 细胞培养的上清液为空白对照, 以融合细胞培养板中未长 出克隆的细胞培养上清为阴性对照 ; 4) 杂交瘤细胞的克隆化 ELISA 及 DON 毒素间接竞争抑制性 ELISA 法检测上清阳性的孔, 有限稀释法进行克隆 化, 经 3 4 次亚克隆, 达到 3 次 1。
7、00阳性, 建立了 1 株能稳定分泌 DON 单克隆抗体的杂交 瘤细胞株, 保藏号为 CGMCCNO.4107, 该杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体 DON 最低检出浓度 是 9.2g/L。 4. 如权利要求 1 所述的单克隆抗体, 其特征在于 : 在检测水稻恶苗病或节瓜枯萎病中 的应用。 5. 如权利要求 2 所述的杂交瘤细胞, 其特征在于 : 在检测水稻恶苗病或节瓜枯萎病中 的应用。 6. 如权利要求 1 所述的单克隆抗体, 其特征在于 : 在检测农作物食品中的应用。 7. 如权利要求 2 所述的杂交瘤细胞, 其特征在于 : 在检测农作物食品中的应用。 权 利 要 求 书 CN 1020711。
8、69 A CN 102071173 A1/5 页 3 抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备 方法和应用 技术领域 : 0001 本 发 明 涉 及 生 物 工 程 领 域, 特 别 的 涉 及 一 种 抗 脱 氧 雪 腐 镰 刀 菌 烯 醇 (deoxynivalenol, DON) 单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法和应用。 背景技术 : 0002 在我国农产品的诸多污染因素中, 真菌毒素是一类重要的天然污染物, 由其引起 的食源性疾病和食品贸易争端一直是全球关注的热点。其中毒性大、 与人类健康关系最 密切、 对农作物污染最重、 分布最广的真菌毒素是脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (Deo。
9、xynivalenol, DON)。脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON) 不仅是赤霉病小麦污染的主要毒素, 而且还可以污染玉 米、 大麦、 高粱等谷物, 人畜进食被该毒素污染的粮食和饲料后可以引起中毒, 产生 DON 的 镰刀菌还是导致水稻恶苗病、 蔬菜 ( 如节瓜节瓜枯萎病 ) 等农作物的主要病原菌, 因此 DON 污染不仅是一个重要的食品安全问题, 而且在农业上是一个导致农作物减产、 品质下降的 一个重要因素。因此以研制的抗 DON 单克隆抗体为基础, 创建快速、 灵敏、 准确的 DON 的检 测方法, 不仅对保障食品安全, 促进人类健康具有重要意义, 而且在优质、 抗恶苗病水稻和 蔬菜品种的筛。
10、选, 提高农产品产量和保障质量方面具有重要作用。 0003 DON 污染控制的关键在于现场快速、 动态监控毒素水平, 摸清毒素在各类农产品 中污染的 “家底” , 而目前我国检测上述毒素方法存在灵敏度低、 操作繁琐、 接触剧毒标准 品、 检测方法不适用于批量样品处理、 难以满足现场检测要求等缺憾, 并已成为制约我国食 品工业快速发展和农产品出口贸易的 “瓶颈” , 迫切需要建立快速、 灵敏、 适于企业自检和 基层现场使用的 DON 免疫检测技术方法。目前检测 DON 的免疫方法有酶联免疫吸附实验 (ELISA)、 免疫胶体金方法和化学发光免疫检测方法 (CLIA)。这几种方法的关键是制备特 异。
11、性强的针对 DON 的单克隆抗体, 并以此为基础利用高亲和力的抗体与抗原之间的特异识 别, 筛选出最佳免疫检测方法并标准化, 从而研制出方便、 经济、 灵敏、 快速、 适于基层和现 场使用的免疫检测试剂盒。 0004 由于DON为半抗原, 因此只有免疫反应性(与特异性抗体反应)而无免疫原性(不 能刺激机体产生抗体), 必须与大分子载体偶联后方可刺激机体产生抗体。 目前国内外报道 在制备 DON单克隆抗体时用于免疫动物的完全抗原是DON-卵清蛋白(OVA)偶联物, 检测用 的包被抗原为 DON- 牛血清白蛋白 (BSA) 偶联物。而本研究免疫动物和单克隆抗体检测时 均用同一种蛋白和DON的偶联物。
12、(DON-BSA)、 采用载体排除法制备抗DON单克隆抗体的方法 国内外未见报道。 由于只需合成一种完全抗原, 因此该方法虽具有经济、 简单、 省时的特点, 但在技术上较免疫和检测用不同完全抗原的方法要求高、 难度大。 0005 本研究通过细胞融合, 免疫抗原和检测抗原均采用 DON-BSA, 获得了高效分泌抗 DON 单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 该抗体灵敏度高, 特异性强, 与 DON 亲和力高, 与其他毒素 交叉反应低, 为 DON 检测试剂的研制奠定了基础。 说 明 书 CN 102071169 A CN 102071173 A2/5 页 4 发明内容 : 0006 ( 一 ) 抗 DO。
13、N 单克隆抗体的制备 0007 1. 动物免疫 0008 将 BSA, DON 分别与 1, 3 二环基二亚胺 (DCC) 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 偶联, 通 过戊二酸将二者连接形成 DON-BSA 偶联物, 采用小剂量长周期的免疫方案。 0009 2. 细胞融合 0010 将 Sp2/0 细胞与小鼠脾细胞按 1 10 混合于 50mL 无菌离心管中, 1000r/min 离 心 10min, 弃上清, 轻弹管底使细胞充分散开, 将离心管置 37水浴中, 缓慢加入 37预温 的50PEG0.7mL, 1min内加完, 于37静置90s, 缓慢加入20mL 1640培养液终止PEG。
14、的作 用。800r/min 离心 10min, 弃上清液, 用含 20小牛血清的 HAT 选择培养基 (Gibco 公司产 品)悬浮沉淀的细胞, 调整细胞浓度为2106/mL, 然后分别接种于加有饲养细胞的96孔培 养板中, 置 37, 5 CO2 培养箱中培养, 在融合 7 14d 后改用 HT 培养液 (Gibco 公司产 品 ), 逐日观察细胞生长情况, 待长至 1/3 1/2 视野, ELISA 法检测上清液中抗体。 0011 3. 杂交瘤筛选及抗体检测 0012 本研究采用与传统方法不同的载体排除法进行。即以 0.5g/ml DON-BSA、 BSA 分 别为 包被抗原, 用间接 E。
15、LISA 法筛选融合细胞上清中抗 DON 单克隆抗体, 用 DON 毒素间接 竞争抑制性 ELISA 法确证单克隆抗体的特异性。以免疫小鼠的血清为阳性对照, 以 Sp2/0 细胞培养的上清液为空白对照。 0013 4. 杂交瘤细胞的克隆化 0014 ELISA 及 DON 毒素间接竞争抑制性 ELISA 法检测上清阳性的孔, 有限稀释法进 行克隆化, 至所有单克隆孔上清抗体阳性率为 100, 将细胞扩大培养并建株, 将杂交瘤 细胞冻存于液氮罐中。同时送国家知识产权局指定专利微生物保藏中心保藏, 保藏号为 CGMCCNO.4107。 0015 5. 单克隆抗体的生产 : 采用动物体内腹水诱生法。。
16、 0016 6. 单克隆抗体的纯化 : 采用饱和硫酸铵法对腹水进行纯化。 0017 ( 二 ) 抗 DON 单克隆抗体的鉴定 0018 1. 抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定 : 采用抗体亚类测定试剂盒进行测定。 0019 2. 抗体 IgG 含量的测定 : 采用 BCA 蛋白测定试剂盒对辛酸 - 硫酸铵法纯化后的腹 水进行 IgG 含量测定。 0020 3. 抗体分子量的测定 : 采用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 0021 4. 抗体滴度测定 : 以 0.5g/ml DON-BSA 为包被抗原, 将抗体进行倍比稀释, 以 Sp2/0 细胞腹水纯化液为阴性对照, PBS 为空白对照, 用间。
17、接 ELISA 方法测定纯化腹水中抗 体滴度, 以 (A实验-A空白)/(A阴性-A空白) 2.1 的最大稀释倍数为抗体的滴定终点。A 值约为 1 时抗体的稀释度为参考工作稀释度。 0022 5. 抗体亲和力的测定 : 采用间接 ELISA 法, 即测定抗体的亲和常数。 0023 6. 抗体的特异性测定 : 用间接竞争抑制性 ELISA 法进行测定, 参试毒素为 NIV、 DAS、 T-2 毒素、 F-X 等毒素。 0024 采用本发明取得了以下技术效果 : 0025 用 DON-BSA 免疫 Balb/c 小鼠获得了较好的免疫应答。细胞融合后, 经间接非竞争 说 明 书 CN 1020711。
18、69 A CN 102071173 A3/5 页 5 ELISA 方法筛选, 并用间接竞争 ELISA 方法确证, 从中选择出对抗 DON 毒素有抑制的细胞 株, 经 3 4 次亚克隆, 达到 3 次 100阳性, 建立了 1 株能稳定分泌 DON 单克隆抗体的杂交 瘤细胞株, 命名为 3G5。 0026 用 间 接 竞 争 抑 制 ELISA 测 得 线 性 范 围 9.8g/L-10000g/L, 线 性 方 程 Y -0.2726X+0.2259(r 0.9309), 对 DON 的最低检出浓度是 9.2g/L( 见说明书附图 1), 远远高于国标中对于食品中 750g/L, 饲料中 1。
19、000g/L 的检测灵敏度的要求。由此 可见, 该研究将 BSA, DON 分别与 DCC 和 NHS 偶联, 通过戊二酸将二者连接形成 DON-BSA 偶 联物, 该方法偶联效率高, 偶联抗原稳定, 溶解性好, 免疫原性强。同时该研究中 BSA-DON 偶联物既为免疫抗原又做检测抗原, 用细胞融合的方法制备了分泌抗 DON 的单克隆抗体的 杂交瘤细胞株, 与其它半抗原单克隆抗体制备方法相比, 该方法简单, 经济可行, 抗体筛选 难度大。所得单克隆抗体效价高, 抗体含量高, DON 最低检出浓度是 9.2g/L, 灵敏度高, 与 DON 具有高度亲和力, 与其它真菌毒素交叉反应低, 特异性强,。
20、 可用于制备高质量国产 DON-ELISA 检测试剂盒。 附图说明 : 0027 说明书附图 1 为 DON 间接竞争 ELISA 标准曲线 具体实施方式 : 0028 ( 一 ) 抗 DON 单克隆抗体的制备 0029 1. 动物免疫 0030 将 BSA, DON 分别与 1, 3 二环基二亚胺 (DCC) 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 偶联, 通 过戊二酸将二者连接形成 DON-BSA 偶联物, DON 与 BSA 摩尔比为 50 1。该方法偶联效率 高, 偶联抗原稳定, 溶解性好, 免疫原性强。 0031 将DON-BSA偶联物配制成1mg/ml溶液, 采用小剂量长周期的免疫方。
21、案, 对68周 龄的雌性 Balb/c 小鼠 ( 体重 18 20g), 首次免疫用 100g DON-BSA, 加入等量完全福氏 佐剂 (Sigma 公司产品 ), 腹腔注射。2 周后, 用 100g DON-BSA, 加入等量不完全福氏佐剂 (Sigma公司产品), 腹腔注射。 再2周后, 用100g DON-BSA, 加入等量不完全福氏佐剂, 腹 腔注射。2 周后, 强化免疫, 50g DON-BSA 溶液脾内免疫, 4d 后取脾细胞进行融合。 0032 2. 细胞融合 0033 将 Sp2/0 细胞与小鼠脾细胞按 1 10 混合于 50mL 无菌离心管中, 1000r/min 离 心 。
22、10min, 弃上清, 轻弹管底使细胞充分散开, 将离心管置 37水浴中, 缓慢加入 37预温 的50PEG0.7mL, 1min内加完, 于37静置90s, 缓慢加入20mL 1640培养液终止PEG的作 用。800r/min 离心 10min, 弃上清液, 用含 20小牛血清的 HAT 选择培养基 (Gibco 公司产 品)悬浮沉淀的细胞, 调整细胞浓度为2106/mL, 然后分别接种于加有饲养细胞的96孔培 养板中, 置 37, 5 CO2 培养箱中培养, 在融合 7 14d 后改用 HT 培养液 (Gibco 公司产 品 ), 逐日观察细胞生长情况, 待长至 1/3 1/2 视野, E。
23、LISA 法检测上清液中抗体。 0034 3. 杂交瘤筛选及抗体检测 0035 本研究采用与传统方法不同的载体排除法进行。即以 0.5g/ml DON-BSA、 BSA 分 别为包被抗原, 用间接 ELISA 法筛选融合细胞上清中抗 DON 单克隆抗体, 用 DON 毒素间接 说 明 书 CN 102071169 A CN 102071173 A4/5 页 6 竞争抑制性 ELISA 法确证单克隆抗体的特异性。以免疫小鼠的血清为阳性对照, 以 Sp2/0 细胞培养的上清液为空白对照, 以融合细胞培养板中未长出克隆的细胞培养上清为阴性对 照, 阳性细胞孔判定标准为 (A试验-A空白)/(A阴性对。
24、照-A空白对照) 2.1。 0036 本研究中采用的免疫抗原与检测抗原为同一载体 BSA, 使得半抗原单克隆抗体的 制备更简单, 更经济, 更省时。 0037 4. 杂交瘤细胞的克隆化 0038 ELISA及DON毒素间接竞争抑制性ELISA法检测上清阳性的孔, 有限稀释法进行克 隆化, 至所有单克隆孔上清抗体阳性率为 100, 将细胞扩大培养并建株, 将杂交瘤细胞冻 存于液氮罐中。同时送国家知识产权局指定专利微生物保藏中心包藏。 0039 5. 单克隆抗体的生产 : 采用动物体内腹水诱生法。 0040 6. 单克隆抗体的纯化 : 采用饱和硫酸铵法对腹水进行纯化。 0041 ( 二 ) 抗 D。
25、ON 单克隆抗体的鉴定 0042 1. 抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定 : 采用抗体亚类测定试剂盒进行测定。 0043 2. 抗体 IgG 含量的测定 : 采用 BCA 蛋白测定试剂盒对辛酸 - 硫酸铵法纯化后的腹 水进行 IgG 含量测定。 0044 3. 抗体分子量的测定 : 采用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 0045 4. 抗体滴度测定 : 以 0.5g/ml DON-BSA 为包被抗原, 将抗体进行倍比稀释, 以 Sp2/0 细胞腹水纯化液为阴性对照, PBS 为空白对照, 用间接 ELISA 方法测定纯化腹水中抗 体滴度, 以 (A实验-A空白)/(A阴性-A空白) 2.1 的。
26、最大稀释倍数为抗体的滴定终点。A 值约为 1 时抗体的稀释度为参考工作稀释度。 0046 5. 抗体亲和力的测定 : 采用间接 ELISA 法, 即测定抗体的亲和常数。取三种倍比 稀释度(0.25g/mL, 0.50g/mL, 1.00g/mL)的DON-BSA包被聚苯乙烯微板, 加入系列稀 释的已知浓度的纯化腹水, 采用间接 ELISA 法, 测定各抗体的亲和常数。以 A 值对纯化腹水 浓度绘制出 3 条测定曲线, 以各曲线上部趋于平坦段的 A 值为 100, 查出其 A 值为 50时 点的蛋白浓度 Abt, 这样可得 Abt、 Ab t 和 Ab” t 三个值, 然后按下式计算 K 值 :。
27、 当 包被抗原浓度比为 2 时, K1 1/2(2Ab t-Abt), 或 K2 1/2(2Ab” t-Ab t) ; 当包 被抗原浓度比为 4 时, K3 3/2(4Ab” t-Abt)。即可得 3 个 K 值, 取平均值即为其亲和 力常数 0047 6. 抗体的特异性测定 : 用间接竞争抑制性 ELISA 法进行测定, 参试毒素为 NIV、 DAS、 T-2 毒素、 F-X 等毒素。 0048 抗体的亚类、 相对分子量、 抗体滴度、 亲和力常数等见表1。 用间接竞争性ELISA法 测得抗 DON 单克隆抗体与 NIV、 DAS、 T-2 毒素、 F-X 等毒素的交叉反应率, 见表 2。 0。
28、049 表 1 抗 DON 单克隆抗体特性 0050 0051 表 2 抗 DON 单克隆抗体与其它类似物的交叉反应率 说 明 书 CN 102071169 A CN 102071173 A5/5 页 7 0052 0053 ( 三 ). 间接竞争 ELISA 检测工作条件的确定 0054 经过多次实验, 确证 DON-BSA 最佳包被浓度为 0.5g/mL, 包被量 100l/ 孔 ; 抗 DON 单克隆抗体的最佳工作浓度 1 64000。用间接竞争抑制 ELISA 测得线性范围 9.8g/ L-10000g/L, 线性方程 Y -0.2726X+0.2259(r 0.9309), 对 DO。
29、N 的最低检出浓度是 9.2g/L(见说明书附图1), 远远高于国标中对于食品中750g/L, 饲料中1000g/L 的检测灵敏度的要求。 生物材料样品说明 : ( 一 ) 保藏单位名称 : 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 二 ) 保藏单位地址 : 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号 ( 三 ) 保藏日期 : 2010 年 8 月 30 日 ( 四 ) 保藏编号 : CGMCC NO.4107 ( 五 ) 分类命名 : 杂交瘤细胞株 说 明 书 CN 102071169 A CN 102071173 A1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102071169 A 。