抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法和应用.pdf

上传人:凯文 文档编号:8876251 上传时间:2021-01-09 格式:PDF 页数:8 大小:390.09KB
返回 下载 相关 举报
摘要
申请专利号:

CN201010277020.5

申请日:

20100909

公开号:

CN102071169A

公开日:

20110525

当前法律状态:

有效性:

失效

法律详情:

IPC分类号:

C12N5/20,C07K16/14,G01N33/577,G01N33/569,C12R1/91

主分类号:

C12N5/20,C07K16/14,G01N33/577,G01N33/569,C12R1/91

申请人:

中国疾病预防控制中心营养与食品安全所,山东大学

发明人:

李凤琴,赵丽,王伟

地址:

100021 北京市朝阳区潘家园南里七号

优先权:

CN201010277020A

专利代理机构:

代理人:

PDF下载: PDF下载
内容摘要

本发明涉及生物工程领域,特别的涉及一种抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法和应用。通过细胞融合,免疫抗原和检测抗原均采用DON-BSA,获得了高效分泌抗DON单克隆抗体的杂交瘤细胞株并保藏,该抗体灵敏度高,特异性强,与DON亲和力高,与其他毒素交叉反应低,为DON检测试剂的研制奠定了基础。

权利要求书

1.一种抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆的杂交瘤细胞,其特征在于:所述细胞的保藏号为CGMCC NO.4107。 2.一种抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体,其特征在于:由保藏号为CGMCC NO.4107的杂交瘤的细胞所分泌,DON最低检出浓度是9.2μg/L。 3.一种抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆的制备方法,其特征在于包括以下依次步骤:1)偶联物制备BSA,DON分别与1,3二环基二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺偶联,通过戊二酸将二者连接形成DON-BSA偶联物,DON与BSA摩尔比为50∶1;将DON-BSA偶联物配制成1mg/ml溶液,采用小剂量长周期的免疫方案,对6~8周龄的雌性小鼠;首次免疫用100μg DON-BSA,加入等量完全福氏佐剂;2周后,用100μg DON-BSA,加入等量不完全福氏佐剂;再2周后,用100μg DON-BSA,加入等量不完全福氏佐剂;2周后,强化免疫,50μg DON-BSA溶液脾内免疫,4d后取脾细胞进行融合;2)细胞融合将Sp2/0细胞与小鼠脾细胞按1∶10混合于50mL无菌离心管中,1000r/min离心10min,弃上清,轻弹管底使细胞充分散开;将离心管置37℃水浴中,缓慢加入37℃预温的50%PEG 0.7mL,1min内加完;于37℃静置90s,缓慢加入20mL 1640培养液终止PEG的作用;800r/min离心10min,弃上清液,用含20%小牛血清的HAT选择培养基悬浮沉淀的细胞,调整细胞浓度为2×10/mL,然后分别接种于加有饲养细胞的96孔培养板中,置37℃,5%CO2培养箱中培养,在融合7~14d后改用HT培养液;逐日观察细胞生长情况,待长至1/3~1/2视野,ELISA法检测上清液中抗体;3)杂交瘤筛选及抗体检测以0.5μg/ml DON-BSA、BSA分别为包被抗原,用间接ELISA法筛选融合细胞上清中抗DON单克隆抗体,用DON毒素间接竞争抑制性ELISA法确证单克隆抗体的特异性;以免疫小鼠的血清为阳性对照,以Sp2/0细胞培养的上清液为空白对照,以融合细胞培养板中未长出克隆的细胞培养上清为阴性对照;4)杂交瘤细胞的克隆化ELISA及DON毒素间接竞争抑制性ELISA法检测上清阳性的孔,有限稀释法进行克隆化,经3~4次亚克隆,达到3次100%阳性,建立了1株能稳定分泌DON单克隆抗体的杂交瘤细胞株,保藏号为CGMCCNO.4107,该杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体DON最低检出浓度是9.2μg/L。 4.如权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于:在检测水稻恶苗病或节瓜枯萎病中的应用。 5.如权利要求2所述的杂交瘤细胞,其特征在于:在检测水稻恶苗病或节瓜枯萎病中的应用。 6.如权利要求1所述的单克隆抗体,其特征在于:在检测农作物食品中的应用。 7.如权利要求2所述的杂交瘤细胞,其特征在于:在检测农作物食品中的应用。

说明书



技术领域:

本发明涉及生物工程领域,特别的涉及一种抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法和应用。 

背景技术:

在我国农产品的诸多污染因素中,真菌毒素是一类重要的天然污染物,由其引起的食源性疾病和食品贸易争端一直是全球关注的热点。其中毒性大、与人类健康关系最密切、对农作物污染最重、分布最广的真菌毒素是脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)不仅是赤霉病小麦污染的主要毒素,而且还可以污染玉米、大麦、高粱等谷物,人畜进食被该毒素污染的粮食和饲料后可以引起中毒,产生DON的镰刀菌还是导致水稻恶苗病、蔬菜(如节瓜节瓜枯萎病)等农作物的主要病原菌,因此DON污染不仅是一个重要的食品安全问题,而且在农业上是一个导致农作物减产、品质下降的一个重要因素。因此以研制的抗DON单克隆抗体为基础,创建快速、灵敏、准确的DON的检测方法,不仅对保障食品安全,促进人类健康具有重要意义,而且在优质、抗恶苗病水稻和蔬菜品种的筛选,提高农产品产量和保障质量方面具有重要作用。 

DON污染控制的关键在于现场快速、动态监控毒素水平,摸清毒素在各类农产品中污染的“家底”,而目前我国检测上述毒素方法存在灵敏度低、操作繁琐、接触剧毒标准品、检测方法不适用于批量样品处理、难以满足现场检测要求等缺憾,并已成为制约我国食品工业快速发展和农产品出口贸易的“瓶颈”,迫切需要建立快速、灵敏、适于企业自检和基层现场使用的DON免疫检测技术方法。目前检测DON的免疫方法有酶联免疫吸附实验(ELISA)、免疫胶体金方法和化学发光免疫检测方法(CLIA)。这几种方法的关键是制备特异性强的针对DON的单克隆抗体,并以此为基础利用高亲和力的抗体与抗原之间的特异识别,筛选出最佳免疫检测方法并标准化,从而研制出方便、经济、灵敏、快速、适于基层和现场使用的免疫检测试剂盒。 

由于DON为半抗原,因此只有免疫反应性(与特异性抗体反应)而无免疫原性(不能刺激机体产生抗体),必须与大分子载体偶联后方可刺激机体产生抗体。目前国内外报道在制备 DON单克隆抗体时用于免疫动物的完全抗原是DON-卵清蛋白(OVA)偶联物,检测用的包被抗原为DON-牛血清白蛋白(BSA)偶联物。而本研究免疫动物和单克隆抗体检测时均用同一种蛋白和DON的偶联物(DON-BSA)、采用载体排除法制备抗DON单克隆抗体的方法国内外未见报道。由于只需合成一种完全抗原,因此该方法虽具有经济、简单、省时的特点,但在技术上较免疫和检测用不同完全抗原的方法要求高、难度大。 

本研究通过细胞融合,免疫抗原和检测抗原均采用DON-BSA,获得了高效分泌抗DON单克隆抗体的杂交瘤细胞株,该抗体灵敏度高,特异性强,与DON亲和力高,与其他毒素交叉反应低,为DON检测试剂的研制奠定了基础。 

发明内容:

(一)抗DON单克隆抗体的制备 

1.动物免疫 

将BSA,DON分别与1,3二环基二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联,通过戊二酸将二者连接形成DON-BSA偶联物,采用小剂量长周期的免疫方案。 

2.细胞融合 

将Sp2/0细胞与小鼠脾细胞按1∶10混合于50mL无菌离心管中,1000r/min离心10min,弃上清,轻弹管底使细胞充分散开,将离心管置37℃水浴中,缓慢加入37℃预温的50%PEG0.7mL,1min内加完,于37℃静置90s,缓慢加入20mL 1640培养液终止PEG的作用。800r/min离心10min,弃上清液,用含20%小牛血清的HAT选择培养基(Gibco公司产品)悬浮沉淀的细胞,调整细胞浓度为2×106/mL,然后分别接种于加有饲养细胞的96孔培养板中,置37℃,5%CO2培养箱中培养,在融合7~14d后改用HT培养液(Gibco公司产品),逐日观察细胞生长情况,待长至1/3~1/2视野,ELISA法检测上清液中抗体。 

3.杂交瘤筛选及抗体检测 

本研究采用与传统方法不同的载体排除法进行。即以0.5μg/ml DON-BSA、BSA分别为 包被抗原,用间接ELISA法筛选融合细胞上清中抗DON单克隆抗体,用DON毒素间接竞争抑制性ELISA法确证单克隆抗体的特异性。以免疫小鼠的血清为阳性对照,以Sp2/0细胞培养的上清液为空白对照。 

4.杂交瘤细胞的克隆化 

ELISA及DON毒素间接竞争抑制性ELISA法检测上清阳性的孔,有限稀释法进行克隆化,至所有单克隆孔上清抗体阳性率为100%,将细胞扩大培养并建株,将杂交瘤细胞冻存于液氮罐中。同时送国家知识产权局指定专利微生物保藏中心保藏,保藏号为CGMCCNO.4107。 

5.单克隆抗体的生产:采用动物体内腹水诱生法。 

6.单克隆抗体的纯化:采用饱和硫酸铵法对腹水进行纯化。 

(二)抗DON单克隆抗体的鉴定 

1.抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定:采用抗体亚类测定试剂盒进行测定。 

2.抗体IgG含量的测定:采用BCA蛋白测定试剂盒对辛酸-硫酸铵法纯化后的腹水进行IgG含量测定。 

3.抗体分子量的测定:采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 

4.抗体滴度测定:以0.5μg/ml DON-BSA为包被抗原,将抗体进行倍比稀释,以Sp2/0细胞腹水纯化液为阴性对照,PBS为空白对照,用间接ELISA方法测定纯化腹水中抗体滴度,以(A实验-A空白)/(A阴性-A空白)≥2.1的最大稀释倍数为抗体的滴定终点。A值约为1时抗体的稀释度为参考工作稀释度。 

5.抗体亲和力的测定:采用间接ELISA法,即测定抗体的亲和常数。 

6.抗体的特异性测定:用间接竞争抑制性ELISA法进行测定,参试毒素为NIV、DAS、T-2毒素、F-X等毒素。 

采用本发明取得了以下技术效果: 

用DON-BSA免疫Balb/c小鼠获得了较好的免疫应答。细胞融合后,经间接非竞争ELISA 方法筛选,并用间接竞争ELISA方法确证,从中选择出对抗DON毒素有抑制的细胞株,经3~4次亚克隆,达到3次100%阳性,建立了1株能稳定分泌DON单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3G5。 

用间接竞争抑制ELISA测得线性范围9.8μg/L-10000μg/L,线性方程Y=-0.2726X+0.2259(r=0.9309),对DON的最低检出浓度是9.2μg/L(见说明书附图1),远远高于国标中对于食品中≤750μg/L,饲料中≤1000μg/L的检测灵敏度的要求。由此可见,该研究将BSA,DON分别与DCC和NHS偶联,通过戊二酸将二者连接形成DON-BSA偶联物,该方法偶联效率高,偶联抗原稳定,溶解性好,免疫原性强。同时该研究中BSA-DON偶联物既为免疫抗原又做检测抗原,用细胞融合的方法制备了分泌抗DON的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,与其它半抗原单克隆抗体制备方法相比,该方法简单,经济可行,抗体筛选难度大。所得单克隆抗体效价高,抗体含量高,DON最低检出浓度是9.2μg/L,灵敏度高,与DON具有高度亲和力,与其它真菌毒素交叉反应低,特异性强,可用于制备高质量国产DON-ELISA检测试剂盒。 

附图说明:

说明书附图1为DON间接竞争ELISA标准曲线 

具体实施方式:

(一)抗DON单克隆抗体的制备 

1.动物免疫 

将BSA,DON分别与1,3二环基二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联,通过戊二酸将二者连接形成DON-BSA偶联物,DON与BSA摩尔比为50∶1。该方法偶联效率高,偶联抗原稳定,溶解性好,免疫原性强。 

将DON-BSA偶联物配制成1mg/ml溶液,采用小剂量长周期的免疫方案,对6~8周龄的雌性Balb/c小鼠(体重18~20g),首次免疫用100μg DON-BSA,加入等量完全福氏佐剂(Sigma公司产品),腹腔注射。2周后,用100μg DON-BSA,加入等量不完全福氏佐剂(Sigma公司产品),腹腔注射。再2周后,用100μg DON-BSA,加入等量不完全福氏佐剂,腹腔注射。2周后,强化免疫,50μg DON-BSA溶液脾内免疫,4d后取脾细胞进行融合。 

2.细胞融合 

将Sp2/0细胞与小鼠脾细胞按1∶10混合于50mL无菌离心管中,1000r/min离心10min,弃上清,轻弹管底使细胞充分散开,将离心管置37℃水浴中,缓慢加入37℃预温的50%PEG0.7mL,1min内加完,于37℃静置90s,缓慢加入20mL 1640培养液终止PEG的作用。800r/min离心10min,弃上清液,用含20%小牛血清的HAT选择培养基(Gibco公司产品)悬浮沉淀的细胞,调整细胞浓度为2×106/mL,然后分别接种于加有饲养细胞的96孔培养板中,置37℃,5%CO2培养箱中培养,在融合7~14d后改用HT培养液(Gibco公司产品),逐日观察细胞生长情况,待长至1/3~1/2视野,ELISA法检测上清液中抗体。 

3.杂交瘤筛选及抗体检测 

本研究采用与传统方法不同的载体排除法进行。即以0.5μg/ml DON-BSA、BSA分别为包被抗原,用间接ELISA法筛选融合细胞上清中抗DON单克隆抗体,用DON毒素间接竞争抑制性ELISA法确证单克隆抗体的特异性。以免疫小鼠的血清为阳性对照,以Sp2/0细胞培养的上清液为空白对照,以融合细胞培养板中未长出克隆的细胞培养上清为阴性对照,阳性细胞孔判定标准为(A试验-A空白)/(A阴性对照-A空白对照)≥2.1。 

本研究中采用的免疫抗原与检测抗原为同一载体BSA,使得半抗原单克隆抗体的制备更简单,更经济,更省时。 

4.杂交瘤细胞的克隆化 

ELISA及DON毒素间接竞争抑制性ELISA法检测上清阳性的孔,有限稀释法进行克隆化,至所有单克隆孔上清抗体阳性率为100%,将细胞扩大培养并建株,将杂交瘤细胞冻存于液氮罐中。同时送国家知识产权局指定专利微生物保藏中心包藏。 

5.单克隆抗体的生产:采用动物体内腹水诱生法。 

6.单克隆抗体的纯化:采用饱和硫酸铵法对腹水进行纯化。 

(二)抗DON单克隆抗体的鉴定 

1.抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定:采用抗体亚类测定试剂盒进行测定。 

2.抗体IgG含量的测定:采用BCA蛋白测定试剂盒对辛酸-硫酸铵法纯化后的腹水进行IgG含量测定。 

3.抗体分子量的测定:采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 

4.抗体滴度测定:以0.5μg/ml DON-BSA为包被抗原,将抗体进行倍比稀释,以Sp2/0细胞腹水纯化液为阴性对照,PBS为空白对照,用间接ELISA方法测定纯化腹水中抗体滴度,以(A实验-A空白)/(A阴性-A空白)≥2.1的最大稀释倍数为抗体的滴定终点。A值约为1时抗体的稀释度为参考工作稀释度。 

5.抗体亲和力的测定:采用间接ELISA法,即测定抗体的亲和常数。取三种倍比稀释度(0.25μg/mL,0.50μg/mL,1.00μg/mL)的DON-BSA包被聚苯乙烯微板,加入系列稀释的已知浓度的纯化腹水,采用间接ELISA法,测定各抗体的亲和常数。以A值对纯化腹水浓度绘制出3条测定曲线,以各曲线上部趋于平坦段的A值为100%,查出其A值为50%时点的蛋白浓度[Ab]t,这样可得[Ab]t、[Ab’]t和[Ab”]t三个值,然后按下式计算K值:当包被抗原浓度比为2时,K1=1/2(2[Ab’]t-[Ab]t),或K2=1/2(2[Ab”]t-[Ab’]t);当包被抗原浓度比为4时,K3=3/2(4[Ab”]t-[Ab]t)。即可得3个K值,取平均值即为其亲和力常数 

6.抗体的特异性测定:用间接竞争抑制性ELISA法进行测定,参试毒素为NIV、DAS、T-2毒素、F-X等毒素。 

抗体的亚类、相对分子量、抗体滴度、亲和力常数等见表1。用间接竞争性ELISA法测得抗DON单克隆抗体与NIV、DAS、T-2毒素、F-X等毒素的交叉反应率,见表2。 

表1  抗DON单克隆抗体特性 

表2  抗DON单克隆抗体与其它类似物的交叉反应率 

(三).间接竞争ELISA检测工作条件的确定 

经过多次实验,确证DON-BSA最佳包被浓度为0.5μg/mL,包被量100μl/孔;抗DON单克隆抗体的最佳工作浓度1∶64000。用间接竞争抑制ELISA测得线性范围9.8μg/L-10000μg/L,线性方程Y=-0.2726X+0.2259(r=0.9309),对DON的最低检出浓度是9.2μg/L(见说明书附图1),远远高于国标中对于食品中≤750μg/L,饲料中≤1000μg/L的检测灵敏度的要求。

生物材料样品说明: 

(一)保藏单位名称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 

(二)保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号 

(三)保藏日期:2010年8月30日 

(四)保藏编号:CGMCC NO.4107 

(五)分类命名:杂交瘤细胞株 

抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法和应用.pdf_第1页
第1页 / 共8页
抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法和应用.pdf_第2页
第2页 / 共8页
抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法和应用.pdf_第3页
第3页 / 共8页
点击查看更多>>
资源描述

《抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法和应用.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法和应用.pdf(8页珍藏版)》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 102071169 A (43)申请公布日 2011.05.25 CN 102071169 A *CN102071169A* (21)申请号 201010277020.5 (22)申请日 2010.09.09 CGMCC NO.4107 2010.08.30 C12N 5/20(2006.01) C07K 16/14(2006.01) G01N 33/577(2006.01) G01N 33/569(2006.01) C12R 1/91(2006.01) (71)申请人 中国疾病预防控制中心营养与食品 安全所 地址 100021 北京市朝阳区潘家园南里七号 申请人 山。

2、东大学 (72)发明人 李凤琴 赵丽 王伟 (54) 发明名称 抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的杂交瘤 细胞及其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明涉及生物工程领域, 特别的涉及一种 抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (deoxynivalenol, DON) 单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法和应 用。通过细胞融合, 免疫抗原和检测抗原均采用 DON-BSA, 获得了高效分泌抗 DON 单克隆抗体的杂 交瘤细胞株并保藏, 该抗体灵敏度高, 特异性强, 与 DON 亲和力高, 与其他毒素交叉反应低, 为 DON 检测试剂的研制奠定了基础。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共。

3、和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 CN 102071173 A1/1 页 2 1. 一种抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆的杂交瘤细胞, 其特征在于 : 所述细胞的保藏号 为 CGMCC NO.4107。 2. 一种抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体, 其特征在于 : 由保藏号为 CGMCC NO.4107 的杂交瘤的细胞所分泌, DON 最低检出浓度是 9.2g/L。 3. 一种抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆的制备方法, 其特征在于包括以下依次步骤 : 1) 偶联物制备 BSA, DON 分别与 1, 3 二环基二亚胺和 N- 羟基琥珀酰亚胺偶联, 。

4、通过戊二酸将二者连接 形成 DON-BSA 偶联物, DON 与 BSA 摩尔比为 50 1 ; 将 DON-BSA 偶联物配制成 1mg/ml 溶液, 采用小剂量长周期的免疫方案, 对 6 8 周龄的雌性小鼠 ; 首次免疫用 100g DON-BSA, 加 入等量完全福氏佐剂 ; 2 周后, 用 100g DON-BSA, 加入等量不完全福氏佐剂 ; 再 2 周后, 用 100g DON-BSA, 加入等量不完全福氏佐剂 ; 2 周后, 强化免疫, 50g DON-BSA 溶液脾内免 疫, 4d 后取脾细胞进行融合 ; 2) 细胞融合 将 Sp2/0 细胞与小鼠脾细胞按 1 10 混合于 5。

5、0mL 无菌离心管中, 1000r/min 离心 10min, 弃上清, 轻弹管底使细胞充分散开 ; 将离心管置 37水浴中, 缓慢加入 37预温的 50 PEG 0.7mL, 1min 内加完 ; 于 37静置 90s, 缓慢加入 20mL 1640 培养液终止 PEG 的作 用 ; 800r/min 离心 10min, 弃上清液, 用含 20小牛血清的 HAT 选择培养基悬浮沉淀的细 胞, 调整细胞浓度为 2106/mL, 然后分别接种于加有饲养细胞的 96 孔培养板中, 置 37, 5 CO2 培养箱中培养, 在融合 7 14d 后改用 HT 培养液 ; 逐日观察细胞生长情况, 待长至 。

6、1/3 1/2 视野, ELISA 法检测上清液中抗体 ; 3) 杂交瘤筛选及抗体检测 以 0.5g/ml DON-BSA、 BSA 分别为包被抗原, 用间接 ELISA 法筛选融合细胞上清中抗 DON 单克隆抗体, 用 DON 毒素间接竞争抑制性 ELISA 法确证单克隆抗体的特异性 ; 以免疫小 鼠的血清为阳性对照, 以 Sp2/0 细胞培养的上清液为空白对照, 以融合细胞培养板中未长 出克隆的细胞培养上清为阴性对照 ; 4) 杂交瘤细胞的克隆化 ELISA 及 DON 毒素间接竞争抑制性 ELISA 法检测上清阳性的孔, 有限稀释法进行克隆 化, 经 3 4 次亚克隆, 达到 3 次 1。

7、00阳性, 建立了 1 株能稳定分泌 DON 单克隆抗体的杂交 瘤细胞株, 保藏号为 CGMCCNO.4107, 该杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体 DON 最低检出浓度 是 9.2g/L。 4. 如权利要求 1 所述的单克隆抗体, 其特征在于 : 在检测水稻恶苗病或节瓜枯萎病中 的应用。 5. 如权利要求 2 所述的杂交瘤细胞, 其特征在于 : 在检测水稻恶苗病或节瓜枯萎病中 的应用。 6. 如权利要求 1 所述的单克隆抗体, 其特征在于 : 在检测农作物食品中的应用。 7. 如权利要求 2 所述的杂交瘤细胞, 其特征在于 : 在检测农作物食品中的应用。 权 利 要 求 书 CN 1020711。

8、69 A CN 102071173 A1/5 页 3 抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备 方法和应用 技术领域 : 0001 本 发 明 涉 及 生 物 工 程 领 域, 特 别 的 涉 及 一 种 抗 脱 氧 雪 腐 镰 刀 菌 烯 醇 (deoxynivalenol, DON) 单克隆抗体的杂交瘤细胞及其制备方法和应用。 背景技术 : 0002 在我国农产品的诸多污染因素中, 真菌毒素是一类重要的天然污染物, 由其引起 的食源性疾病和食品贸易争端一直是全球关注的热点。其中毒性大、 与人类健康关系最 密切、 对农作物污染最重、 分布最广的真菌毒素是脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (Deo。

9、xynivalenol, DON)。脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON) 不仅是赤霉病小麦污染的主要毒素, 而且还可以污染玉 米、 大麦、 高粱等谷物, 人畜进食被该毒素污染的粮食和饲料后可以引起中毒, 产生 DON 的 镰刀菌还是导致水稻恶苗病、 蔬菜 ( 如节瓜节瓜枯萎病 ) 等农作物的主要病原菌, 因此 DON 污染不仅是一个重要的食品安全问题, 而且在农业上是一个导致农作物减产、 品质下降的 一个重要因素。因此以研制的抗 DON 单克隆抗体为基础, 创建快速、 灵敏、 准确的 DON 的检 测方法, 不仅对保障食品安全, 促进人类健康具有重要意义, 而且在优质、 抗恶苗病水稻和 蔬菜品种的筛。

10、选, 提高农产品产量和保障质量方面具有重要作用。 0003 DON 污染控制的关键在于现场快速、 动态监控毒素水平, 摸清毒素在各类农产品 中污染的 “家底” , 而目前我国检测上述毒素方法存在灵敏度低、 操作繁琐、 接触剧毒标准 品、 检测方法不适用于批量样品处理、 难以满足现场检测要求等缺憾, 并已成为制约我国食 品工业快速发展和农产品出口贸易的 “瓶颈” , 迫切需要建立快速、 灵敏、 适于企业自检和 基层现场使用的 DON 免疫检测技术方法。目前检测 DON 的免疫方法有酶联免疫吸附实验 (ELISA)、 免疫胶体金方法和化学发光免疫检测方法 (CLIA)。这几种方法的关键是制备特 异。

11、性强的针对 DON 的单克隆抗体, 并以此为基础利用高亲和力的抗体与抗原之间的特异识 别, 筛选出最佳免疫检测方法并标准化, 从而研制出方便、 经济、 灵敏、 快速、 适于基层和现 场使用的免疫检测试剂盒。 0004 由于DON为半抗原, 因此只有免疫反应性(与特异性抗体反应)而无免疫原性(不 能刺激机体产生抗体), 必须与大分子载体偶联后方可刺激机体产生抗体。 目前国内外报道 在制备 DON单克隆抗体时用于免疫动物的完全抗原是DON-卵清蛋白(OVA)偶联物, 检测用 的包被抗原为 DON- 牛血清白蛋白 (BSA) 偶联物。而本研究免疫动物和单克隆抗体检测时 均用同一种蛋白和DON的偶联物。

12、(DON-BSA)、 采用载体排除法制备抗DON单克隆抗体的方法 国内外未见报道。 由于只需合成一种完全抗原, 因此该方法虽具有经济、 简单、 省时的特点, 但在技术上较免疫和检测用不同完全抗原的方法要求高、 难度大。 0005 本研究通过细胞融合, 免疫抗原和检测抗原均采用 DON-BSA, 获得了高效分泌抗 DON 单克隆抗体的杂交瘤细胞株, 该抗体灵敏度高, 特异性强, 与 DON 亲和力高, 与其他毒素 交叉反应低, 为 DON 检测试剂的研制奠定了基础。 说 明 书 CN 102071169 A CN 102071173 A2/5 页 4 发明内容 : 0006 ( 一 ) 抗 DO。

13、N 单克隆抗体的制备 0007 1. 动物免疫 0008 将 BSA, DON 分别与 1, 3 二环基二亚胺 (DCC) 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 偶联, 通 过戊二酸将二者连接形成 DON-BSA 偶联物, 采用小剂量长周期的免疫方案。 0009 2. 细胞融合 0010 将 Sp2/0 细胞与小鼠脾细胞按 1 10 混合于 50mL 无菌离心管中, 1000r/min 离 心 10min, 弃上清, 轻弹管底使细胞充分散开, 将离心管置 37水浴中, 缓慢加入 37预温 的50PEG0.7mL, 1min内加完, 于37静置90s, 缓慢加入20mL 1640培养液终止PEG。

14、的作 用。800r/min 离心 10min, 弃上清液, 用含 20小牛血清的 HAT 选择培养基 (Gibco 公司产 品)悬浮沉淀的细胞, 调整细胞浓度为2106/mL, 然后分别接种于加有饲养细胞的96孔培 养板中, 置 37, 5 CO2 培养箱中培养, 在融合 7 14d 后改用 HT 培养液 (Gibco 公司产 品 ), 逐日观察细胞生长情况, 待长至 1/3 1/2 视野, ELISA 法检测上清液中抗体。 0011 3. 杂交瘤筛选及抗体检测 0012 本研究采用与传统方法不同的载体排除法进行。即以 0.5g/ml DON-BSA、 BSA 分 别为 包被抗原, 用间接 E。

15、LISA 法筛选融合细胞上清中抗 DON 单克隆抗体, 用 DON 毒素间接 竞争抑制性 ELISA 法确证单克隆抗体的特异性。以免疫小鼠的血清为阳性对照, 以 Sp2/0 细胞培养的上清液为空白对照。 0013 4. 杂交瘤细胞的克隆化 0014 ELISA 及 DON 毒素间接竞争抑制性 ELISA 法检测上清阳性的孔, 有限稀释法进 行克隆化, 至所有单克隆孔上清抗体阳性率为 100, 将细胞扩大培养并建株, 将杂交瘤 细胞冻存于液氮罐中。同时送国家知识产权局指定专利微生物保藏中心保藏, 保藏号为 CGMCCNO.4107。 0015 5. 单克隆抗体的生产 : 采用动物体内腹水诱生法。。

16、 0016 6. 单克隆抗体的纯化 : 采用饱和硫酸铵法对腹水进行纯化。 0017 ( 二 ) 抗 DON 单克隆抗体的鉴定 0018 1. 抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定 : 采用抗体亚类测定试剂盒进行测定。 0019 2. 抗体 IgG 含量的测定 : 采用 BCA 蛋白测定试剂盒对辛酸 - 硫酸铵法纯化后的腹 水进行 IgG 含量测定。 0020 3. 抗体分子量的测定 : 采用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 0021 4. 抗体滴度测定 : 以 0.5g/ml DON-BSA 为包被抗原, 将抗体进行倍比稀释, 以 Sp2/0 细胞腹水纯化液为阴性对照, PBS 为空白对照, 用间。

17、接 ELISA 方法测定纯化腹水中抗 体滴度, 以 (A实验-A空白)/(A阴性-A空白) 2.1 的最大稀释倍数为抗体的滴定终点。A 值约为 1 时抗体的稀释度为参考工作稀释度。 0022 5. 抗体亲和力的测定 : 采用间接 ELISA 法, 即测定抗体的亲和常数。 0023 6. 抗体的特异性测定 : 用间接竞争抑制性 ELISA 法进行测定, 参试毒素为 NIV、 DAS、 T-2 毒素、 F-X 等毒素。 0024 采用本发明取得了以下技术效果 : 0025 用 DON-BSA 免疫 Balb/c 小鼠获得了较好的免疫应答。细胞融合后, 经间接非竞争 说 明 书 CN 1020711。

18、69 A CN 102071173 A3/5 页 5 ELISA 方法筛选, 并用间接竞争 ELISA 方法确证, 从中选择出对抗 DON 毒素有抑制的细胞 株, 经 3 4 次亚克隆, 达到 3 次 100阳性, 建立了 1 株能稳定分泌 DON 单克隆抗体的杂交 瘤细胞株, 命名为 3G5。 0026 用 间 接 竞 争 抑 制 ELISA 测 得 线 性 范 围 9.8g/L-10000g/L, 线 性 方 程 Y -0.2726X+0.2259(r 0.9309), 对 DON 的最低检出浓度是 9.2g/L( 见说明书附图 1), 远远高于国标中对于食品中 750g/L, 饲料中 1。

19、000g/L 的检测灵敏度的要求。由此 可见, 该研究将 BSA, DON 分别与 DCC 和 NHS 偶联, 通过戊二酸将二者连接形成 DON-BSA 偶 联物, 该方法偶联效率高, 偶联抗原稳定, 溶解性好, 免疫原性强。同时该研究中 BSA-DON 偶联物既为免疫抗原又做检测抗原, 用细胞融合的方法制备了分泌抗 DON 的单克隆抗体的 杂交瘤细胞株, 与其它半抗原单克隆抗体制备方法相比, 该方法简单, 经济可行, 抗体筛选 难度大。所得单克隆抗体效价高, 抗体含量高, DON 最低检出浓度是 9.2g/L, 灵敏度高, 与 DON 具有高度亲和力, 与其它真菌毒素交叉反应低, 特异性强,。

20、 可用于制备高质量国产 DON-ELISA 检测试剂盒。 附图说明 : 0027 说明书附图 1 为 DON 间接竞争 ELISA 标准曲线 具体实施方式 : 0028 ( 一 ) 抗 DON 单克隆抗体的制备 0029 1. 动物免疫 0030 将 BSA, DON 分别与 1, 3 二环基二亚胺 (DCC) 和 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 偶联, 通 过戊二酸将二者连接形成 DON-BSA 偶联物, DON 与 BSA 摩尔比为 50 1。该方法偶联效率 高, 偶联抗原稳定, 溶解性好, 免疫原性强。 0031 将DON-BSA偶联物配制成1mg/ml溶液, 采用小剂量长周期的免疫方。

21、案, 对68周 龄的雌性 Balb/c 小鼠 ( 体重 18 20g), 首次免疫用 100g DON-BSA, 加入等量完全福氏 佐剂 (Sigma 公司产品 ), 腹腔注射。2 周后, 用 100g DON-BSA, 加入等量不完全福氏佐剂 (Sigma公司产品), 腹腔注射。 再2周后, 用100g DON-BSA, 加入等量不完全福氏佐剂, 腹 腔注射。2 周后, 强化免疫, 50g DON-BSA 溶液脾内免疫, 4d 后取脾细胞进行融合。 0032 2. 细胞融合 0033 将 Sp2/0 细胞与小鼠脾细胞按 1 10 混合于 50mL 无菌离心管中, 1000r/min 离 心 。

22、10min, 弃上清, 轻弹管底使细胞充分散开, 将离心管置 37水浴中, 缓慢加入 37预温 的50PEG0.7mL, 1min内加完, 于37静置90s, 缓慢加入20mL 1640培养液终止PEG的作 用。800r/min 离心 10min, 弃上清液, 用含 20小牛血清的 HAT 选择培养基 (Gibco 公司产 品)悬浮沉淀的细胞, 调整细胞浓度为2106/mL, 然后分别接种于加有饲养细胞的96孔培 养板中, 置 37, 5 CO2 培养箱中培养, 在融合 7 14d 后改用 HT 培养液 (Gibco 公司产 品 ), 逐日观察细胞生长情况, 待长至 1/3 1/2 视野, E。

23、LISA 法检测上清液中抗体。 0034 3. 杂交瘤筛选及抗体检测 0035 本研究采用与传统方法不同的载体排除法进行。即以 0.5g/ml DON-BSA、 BSA 分 别为包被抗原, 用间接 ELISA 法筛选融合细胞上清中抗 DON 单克隆抗体, 用 DON 毒素间接 说 明 书 CN 102071169 A CN 102071173 A4/5 页 6 竞争抑制性 ELISA 法确证单克隆抗体的特异性。以免疫小鼠的血清为阳性对照, 以 Sp2/0 细胞培养的上清液为空白对照, 以融合细胞培养板中未长出克隆的细胞培养上清为阴性对 照, 阳性细胞孔判定标准为 (A试验-A空白)/(A阴性对。

24、照-A空白对照) 2.1。 0036 本研究中采用的免疫抗原与检测抗原为同一载体 BSA, 使得半抗原单克隆抗体的 制备更简单, 更经济, 更省时。 0037 4. 杂交瘤细胞的克隆化 0038 ELISA及DON毒素间接竞争抑制性ELISA法检测上清阳性的孔, 有限稀释法进行克 隆化, 至所有单克隆孔上清抗体阳性率为 100, 将细胞扩大培养并建株, 将杂交瘤细胞冻 存于液氮罐中。同时送国家知识产权局指定专利微生物保藏中心包藏。 0039 5. 单克隆抗体的生产 : 采用动物体内腹水诱生法。 0040 6. 单克隆抗体的纯化 : 采用饱和硫酸铵法对腹水进行纯化。 0041 ( 二 ) 抗 D。

25、ON 单克隆抗体的鉴定 0042 1. 抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定 : 采用抗体亚类测定试剂盒进行测定。 0043 2. 抗体 IgG 含量的测定 : 采用 BCA 蛋白测定试剂盒对辛酸 - 硫酸铵法纯化后的腹 水进行 IgG 含量测定。 0044 3. 抗体分子量的测定 : 采用 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 0045 4. 抗体滴度测定 : 以 0.5g/ml DON-BSA 为包被抗原, 将抗体进行倍比稀释, 以 Sp2/0 细胞腹水纯化液为阴性对照, PBS 为空白对照, 用间接 ELISA 方法测定纯化腹水中抗 体滴度, 以 (A实验-A空白)/(A阴性-A空白) 2.1 的。

26、最大稀释倍数为抗体的滴定终点。A 值约为 1 时抗体的稀释度为参考工作稀释度。 0046 5. 抗体亲和力的测定 : 采用间接 ELISA 法, 即测定抗体的亲和常数。取三种倍比 稀释度(0.25g/mL, 0.50g/mL, 1.00g/mL)的DON-BSA包被聚苯乙烯微板, 加入系列稀 释的已知浓度的纯化腹水, 采用间接 ELISA 法, 测定各抗体的亲和常数。以 A 值对纯化腹水 浓度绘制出 3 条测定曲线, 以各曲线上部趋于平坦段的 A 值为 100, 查出其 A 值为 50时 点的蛋白浓度 Abt, 这样可得 Abt、 Ab t 和 Ab” t 三个值, 然后按下式计算 K 值 :。

27、 当 包被抗原浓度比为 2 时, K1 1/2(2Ab t-Abt), 或 K2 1/2(2Ab” t-Ab t) ; 当包 被抗原浓度比为 4 时, K3 3/2(4Ab” t-Abt)。即可得 3 个 K 值, 取平均值即为其亲和 力常数 0047 6. 抗体的特异性测定 : 用间接竞争抑制性 ELISA 法进行测定, 参试毒素为 NIV、 DAS、 T-2 毒素、 F-X 等毒素。 0048 抗体的亚类、 相对分子量、 抗体滴度、 亲和力常数等见表1。 用间接竞争性ELISA法 测得抗 DON 单克隆抗体与 NIV、 DAS、 T-2 毒素、 F-X 等毒素的交叉反应率, 见表 2。 0。

28、049 表 1 抗 DON 单克隆抗体特性 0050 0051 表 2 抗 DON 单克隆抗体与其它类似物的交叉反应率 说 明 书 CN 102071169 A CN 102071173 A5/5 页 7 0052 0053 ( 三 ). 间接竞争 ELISA 检测工作条件的确定 0054 经过多次实验, 确证 DON-BSA 最佳包被浓度为 0.5g/mL, 包被量 100l/ 孔 ; 抗 DON 单克隆抗体的最佳工作浓度 1 64000。用间接竞争抑制 ELISA 测得线性范围 9.8g/ L-10000g/L, 线性方程 Y -0.2726X+0.2259(r 0.9309), 对 DO。

29、N 的最低检出浓度是 9.2g/L(见说明书附图1), 远远高于国标中对于食品中750g/L, 饲料中1000g/L 的检测灵敏度的要求。 生物材料样品说明 : ( 一 ) 保藏单位名称 : 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ( 二 ) 保藏单位地址 : 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号 ( 三 ) 保藏日期 : 2010 年 8 月 30 日 ( 四 ) 保藏编号 : CGMCC NO.4107 ( 五 ) 分类命名 : 杂交瘤细胞株 说 明 书 CN 102071169 A CN 102071173 A1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102071169 A 。

展开阅读全文
相关资源
猜你喜欢
相关搜索

当前位置:首页 >


copyright@ 2017-2020 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备2021068784号-1