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1、(10)申请公布号 CN 102586297 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102586297 A *CN102586297A* (21)申请号 201210062130.9 (22)申请日 2012.03.29 C12N 15/61(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12P 7/64(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 张灏 宋元达 张白曦 陈卫 陈海琴 刘晓明 赵建新 (74)专利代理机。
2、构 北京君智知识产权代理事务 所 11305 代理人 吕世静 (54) 发明名称 一种生产共轭亚油酸的重组酵母菌株及其用 途 (57) 摘要 本发明涉及一种生产共轭亚油酸的重组酵 母菌株及其用途。本发明对来自痤疮丙酸杆菌 (Propionibacterium acnes) 中的亚油酸异构酶 (PAI) 基因进行密码子优化得到优化基因 opai， 制备了含有 opai 基因的重组表达质粒和重组耶 氏解脂酵母菌， 并利用表达 opai 基因的重组耶氏 解脂酵母菌生产共轭亚油酸。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)。
3、发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 6 页 1/1 页 2 1. 对天然亚油酸异构酶基因 (pai) 进行密码子优化后得到的基因 opai。 2. 如权利要求 1 所述的基因 opai， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 3. 含有天然亚油酸异构酶基因 pai 或权利要求 1-2 任一项所述的 opai 基因的重组表 达质粒。 4. 如权利要求 3 所述的重组表达质粒， 具体是 pINA1312-pai、 pINA1312-opai 或 pINA1292-opai。 5. 含有天然亚油酸异构酶基因 pai、 权利要求 1-2 任一项所述的基。
4、因 opai 或者权利要 求 3-4 任一项所述的重组表达质粒的耶氏解脂酵母菌。 6. 权利要求 5 所述的耶氏解脂酵母菌， 具体是耶氏解脂酵母菌 Polh。 7.天然亚油酸异构酶基因pai、 权利要求1-2任一项所述的基因opai、 权利要求3-4任 一项所述的重组表达质粒或权利要求 5-6 任一项所述的耶氏解脂酵母菌在生产共轭亚油 酸中的用途。 8. 权利要求 8 所述的用途， 其特征在于所述的共轭亚油酸是 t10， c12CLA。 权 利 要 求 书 CN 102586297 A 2 1/6 页 3 一种生产共轭亚油酸的重组酵母菌株及其用途 技术领域 0001 本发明涉及共轭亚油酸的微生。
5、物制造， 具体是提供了一种生产共轭亚油酸的重组 酵母菌株、 所述菌株的制备方法以及所述菌株在生产共轭亚油酸中的用途。 背景技术 0002 共轭亚油酸 (Conjugated linoleic acid， CLA) 是具有共轭双键的十八碳二烯酸 混合物的统称。 在过去的三十年中， CLA由于其多样的生理活性功能而受到广泛的关注， CLA 具有的主要生理功能包括抗癌、 抗动脉粥样硬化、 抑制脂肪积累、 促进生长、 刺激免疫等。 其 中 c9， t11-CLA、 t10， c12-CLA 和 t9， t11CLA 是迄今为止确认具有生理活性的三种共轭亚油 酸单体。不同的单体其生理活性及信号传导机制均。
6、不同。在自然界中， CLA 存在于来源于 反刍动物的肉制品和乳制品中， 但是含量极低。目前， CLA 的合成广泛采用化学异构法， 即 将红花油或葵花籽油通过碱催化异构法。 但是通过此种方法获得的产物是多种异构体的混 合物， 其中包含许多生理功能及安全性未知的异构体， 活性异构体难以分离纯化。为了满 足 CLA 在医药及营养领域的应用要求， 获得单一、 安全的 CLA 单体变得非常重要， 而通过生 物技术生产 CLA 成为国内外研究人员公认的可行方案。亚油酸异构酶 (PAI) 可以催化亚油 酸生成共轭亚油酸。早在 1965 年， Tove 和他的同事就发现了在溶纤维丁酸弧菌中具有亚 油酸异构酶的。
7、活性， 可以催化 LA 转化为 cis-9， trans-11CLA。四十年过去了， 人们只发现 了三种亚油酸异构酶， 它们分别来源于罗伊氏乳杆菌 (Lactobacillus reuteri)、 生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) 和痤疮丙酸杆菌 (Propionibacterium acnes)。前两种亚油酸 异构酶的产物是 cis-9， trans-11CLA， 而最后一种亚油酸异构酶的产物则是 t10， c12CLA。 来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶是唯一一种已知晶体结构的亚油酸异构酶， 并先后在 大肠杆菌、 酿酒酵母、 烟草种子、 大米及乳酸菌中成功进行了重。
8、组表达。 0003 虽然已有国外研究人员在烟草种子和大米中表达亚油酸异构酶基因 PAI， 但共轭 亚油酸的产量却非常低， 这主要是由于这两种植物的油脂含量很低， 而且与脂肪酸脱氢酶 及延长酶不同， PAI 底物的唯一形式是游离的脂肪酸， 亚油酸的磷脂、 甲酯、 Co-A 或甘三酯 的的形式均不能作为 PAI 的底物。在大多数真核生物中游离脂肪酸的含量是非常低的， 这 也是生物转化法生产 CLA 的最主要限制性因素。相比之下， 产油微生物耶氏解脂酵母不仅 可以积累脂质达25以上， 而且可以罕见地在细胞内积累大量的游离脂肪酸。 因此， 耶氏解 脂酵母是亚油酸异构酶最为合适的表达宿主。 而通过耶氏解。
9、脂酵母生产安全、 专一性高、 具 有生理活性的共轭亚油酸产品， 对于共轭亚油酸在制药和营养领域的应用具有重要的推动 意义。综上所述， 构建一株可以生成 t10， c12CLA 的耶氏解脂酵母菌株具有很大的研究和应 用价值。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种能够利用内源性亚油酸专一性生产 t10， c12-CLA 的 耶氏解脂酵母菌株。 说 明 书 CN 102586297 A 3 2/6 页 4 0005 本发明的内容包括 ： PAI 基因经过密码子优化获得的基因 OPAI、 携带基因 PAI 或 OPAI 的表达质粒、 含有基因 PAI 或 OPAI 的能够生产共轭亚油酸的重组耶。
10、氏解脂酵母菌株、 所述重组耶氏解脂酵母菌的制备方法和所述重组耶氏解脂酵母菌在生产共轭亚油酸中的 用途等。 0006 本发明优选为 ： 根据耶氏解脂酵母基因组数据， 分析耶氏解脂酵母的密码子偏 好性、 GC 含量等参数， 将来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶基因 (pai)(genebank ： AX062088) 进行密码子优化， 得到新的酶基因序列 opai， 优化后的 opai 基因的核苷酸序 列如 SEQ ID NO ： 1 所示 ； 将天然基因 pai 和优化后的亚油酸异构酶基因 opai 分别插入 单拷贝整合质粒 pINA1312， 并将 opai 插入多拷贝整合质粒 pINA1292。
11、 中， 获得三种重组 质粒 pINA1312-pai、 pINA1312-opai 和 pINA1292-opai( 质粒 pINA1312 和 pINA1292 参见 Nicaud， J.-M.， Madzak， C.， Van den Broek， P.， Gysler， C.， Duboc， P.， Niederberger， P.， et al.(2002).Protein expression andsecretion in the yeast Yarrowia lipolytica. FEMS Yeast Research， 2， 371.279)。将构建后的重组质粒分别用 Not。
12、 I 酶切， 得到三 种表达单元转化进耶氏酵母菌株 Polh( 耶氏酵母菌 Polh 参见 Madzak， C.， Gaillardin， C.， &Beckerich， J.-M.(2004).Heterologous protein expression and secretion inthe non-conventional yeast Yarrowia lipolytica.Journal of Biotechnology， 109， 63-81)， 经同源重组后， 筛选得到三种重组菌株 Polh-1312-pai、 Polh-1312-opai 和 Polh-1292-opai ； 。
13、经 western blot 分析检测重组菌株的重组蛋白表达情况显示， 三种重 组菌株 Polh-1312-pai、 Polh-1312-opai 和 Polh-1292-opai 均成功表达了重组蛋白 PAI， 且蛋白表达量呈递增趋势 ； 经气相色谱和气质联用检测， 三种重组菌株 Polh-1312-pai、 Polh-1312-opai和Polh-1292-opai的脂肪酸中均检测到t10， c12-CLA， 且与蛋白表达量呈 正相关， Polh-1312-pai 的 CLA 产量最高为总脂肪酸的 0.2， Polh-1312-opai 的 CLA 产量 为 1.2， 而 Polh-129。
14、2-opai 菌株的 CLA 产量可达总脂肪酸的 5.9。 附图说明 0007 图 1 ： 亚油酸异构酶基因密码子优化前后的密码子适应指数 ： 经过密码子优化后， 密码子适应指数从 0.76 提高到 0.91。 0008 图 2 ： 在耶氏解脂酵母中表达亚油酸异构酶的质粒 pINA1312-pai、 pINA1312-opai 和 pINA1292-opai 的结构示意图。 0009 图 3 ： Polh-pINA1312-pai 转化子 PCR 验证电泳图 ： 挑出的转化子全部扩增出了大 小为 570bp 的特异条带， 说明均为阳性转化子。 0010 图 4 ： Polh-pINA1312-。
15、opai 转化子 PCR 验证电泳图 ： 挑出的转化子全部扩增出了 大小为 630bp 的特异条带， 说明均为阳性转化子。 0011 图 5 ： Polh-pINA1292-opai 转化子 PCR 验证电泳图 ： 挑出的转化子全部扩增出了 大小为 630bp 的特异条带， 说明均为阳性转化子。 0012 图 6 ： SDS-PAGE 检 测 pai 蛋 白 纯 化 效 果 图 ： 利 用 Ni-NTA 纯 化 BL21(DE3)/ pET28a-pai 过表达的重组蛋白 pai 0013 图 7 ： Polh-pINA1312-pai 系列转化子的 westernblot 检测图， 并标注了。
16、 CLA 在 0014 总脂肪酸中的比例 (w/w )。 说 明 书 CN 102586297 A 4 3/6 页 5 0015 图8 ： Polh-pINA1312-opai系列转化子的westernblot检测图， 并标注了CLA在总 脂肪酸中的比例 (w/w )。 0016 图9 ： Polh-pINA1292-opai系列转化子的westernblot检测图， 并标注了CLA在总 脂肪酸中的比例 (w/w )。 0017 图 10 ： 重组耶氏解脂酵母气相色谱图 0018 图 11 ： 重 组 耶 氏 解 脂 酵 母 Polh-pINA1312-opai 的 气 质 检 测 图， A 。
17、为 Polh-pINA1312-opai脂肪酸的气相色谱图， B为气相色谱检测到的t10， c12-CLA的质谱图。 具体实施方式 0019 实施例 1 亚油酸异构酶 (PAI) 基因的密码子优化 0020 参照 pai 基因序列 (genebank ： AX062088)， 基于耶氏解脂酵母基因组的特点， 利用 Genscript OptimumGeneTM 系统的运算法则对 pai 的转录、 翻译和蛋白折叠等多种相关参 数进行优化设计， 包括 GC 含量、 稀有密码子使用情况、 mRNA 结构及转录和翻译过程中的各 种顺式元素。 同时， 在基因序列的起始密码子前加入了有利于真核生物中起始翻。
18、译的Kozak 序列 ： GCCACA。经密码子优化后的 opai 核苷酸序列如 SEQID NO ： 1 所示， 其密码子适应指 数 (CAI) 从 0.76 提高至 0.91， 具体结果见图 1。优化后的 opai 基因由南京金斯瑞生物科 技有限公司进行全基因合成， 并亚克隆至载体 pUC57( 购自南京金斯瑞生物科技有限公司 ) 上， 得到 pUC57-opai。 0021 实施例 2 重组表达质粒的构建 0022 以含有痤疮丙酸杆菌来源的天然亚油酸异构酶基因 pai(genebank ： AX062088) 的质粒 pGEX6-1-PAI( 德国哥廷根大学 Ivo Feussner 教。
19、授惠赠 Prof.Ivo Feussner， Georg-August-University，ttingen， Germany) 为模板， 用一对引物 ： 0023 P1 ： 5 -CACGTGATGTCCATCTCGAAGG-3和 0024 P2 ： 5 -GGTACCTTACACGAAGAACCGC-3 0025 通过 PCR 对亚油酸异构酶基因 pai 进行扩增。PCR 程序为 ： 94 15seconds， 57 30seconds， 68 1minute， 30 个 循 环。PCR 反 应 体 系 ： 5l2mM 的 dNTPs， 5l 10Buf.， 1l KOD plus， 2l。
20、 25mM 的 MgSO4， 上游及下游引物各 1.5l， 模板 1l。将 扩增后的片段连在 T 载体 pMD19T( 购自 TaKaRa 公司 ) 上， 得到 pMD19T-pai。 0026 亚克隆载体 pUC57-opai 和 pMD19T-pai 经内切酶 Pml I 和 Kpn I 37消化 1.5h 后， 通过 1琼脂糖凝胶电泳分离并回收得到目的片段， 将两种目的片段分别与经同样内切 酶处理过的质粒片段 pINA1312 进行连接， 得到重组质粒 pINA1312-pai 和 pINA1312-opai。 多拷贝整合重组质粒 pINA-1292-opai 的构建与单拷贝整合质粒相同。
21、， 见图 2。将构建后的 质粒转化 E.Coli DH5 感受态细胞并均匀涂布于 LB 平板 ( 含有 100g/mL 卡那青霉素的 LB琼脂平板)， 37过夜培养后， 挑选单克隆， PCR验证正确后送北京六合华大生物技术(上 海 ) 有限公司测序。 0027 实施例 3 重组耶氏解脂酵母菌的制备 0028 三种重组质粒 pINA1312-pai、 pINA1312-opai 和 pINA1292-opai 经 Not I 37 消化 1.5h 后， 通过 1琼脂糖凝胶电泳分离并回收带有目的基因的表达单元片段， 浓缩至 500ng/l， 取 2tg 用于转化耶氏解脂酵母 polh。转化过程如下。
22、 ： 说 明 书 CN 102586297 A 5 4/6 页 6 0029 1) 菌株 Y.lipolytica Polh 在 YPD 固体培养基上划线， 28培养 12h ； 0030 2) 用接种环从平板上挑取一环 Polh， 重悬于 1mL TE 溶液中 ； 0031 3)10000rpm 离心， 收集菌体， 将菌体悬浮于 600l 的 0.1mol/l 的乙酸锂 (pH6.0) 缓冲液中， 28水浴 1h， 注意不要晃动样品 ； 0032 4) 水浴结束， 3000rpm 离心 2min， 弃上清 ； 0033 5) 轻轻将菌体重新悬浮于 80l 0.1mol/l 的乙酸锂 (pH6。
23、.0) 中 ； 至此， 酵母菌感 受态细胞制备完成。 0034 6)取40.0l上述酵母菌感受态， 加入2.0l单链鱼精DNA和4.0l待转化DNA 片段 ； 28水浴 15min， 注意水浴过程中不要晃动样品 ； 0035 7) 上述样品中加入 350.0l 40 (w/v) 的 PEG 4000( 溶于 0.1mol/lpH6.0 乙酸 锂中 ) 与 16.0l 1mol/l 的 DDT， 28水浴 1h， 注意不要晃动样品 ； 0036 8) 逐滴加入 40.0l DMSO， 轻轻混匀， 然后置于 39水浴中热休克 10min ； 0037 9) 向上述样品中加入 600.0l 0.1m。
24、ol/l 的乙酸锂 (pH 6.0)， 轻轻晃动混匀 ； 将 酵母菌悬液稀释成不同浓度涂布 YNBD 平板， 28培养 2-4d， 得到单菌落。 0038 分别挑取 7 个 Polh-pINA1312-pai 系列转化子、 12 个 Polh-pINA1312-opai 系列 转化子和 13 个 Polh-pINA1292-opai 系列转化子于 5mL YNBD 培养基中， 28， 200rpm 培养 1-2d， 收集菌体， 提取转化子的基因组， 以引物 P3/P4 和 P5/P6 分别对插入基因 pai 和 opai 的转化子基因组进行 PCR 验证， 引物序列如下 ： 0039 P3/P。
25、4 ： 5 -ACGCCAACGGCCACTACAAC-3和 0040 5 -CAGCCCAGCGGTGGTAGTAAAC-3 ； 0041 P5/P6 ： 5 -ACCAGGGATACGACGCTAAC-3和 0042 5 -ATGGTTTCGGAGCAGGTAAG-3。 0043 PCR 程序为 ： 94 30s， 55 30s， 72 30s， 30 个循环， 72补充延伸 5min。PCR 反 应体系 ： 2l 2.5mM 的 dNTPs， 2l 10Buf.， 0.5lTaq， ， 上游及下游引物各 0.5l， 模 板 1l。挑出的转化子全部扩增出了大小为 570bp 或 630bp。
26、 的特异条带， 说明均为阳性转 化子， 见图 3-5。对照菌株 Polh-pINA1312 和 Polh-pINA1292 的构建方法同上。 0044 实施例 4pai 特异性多克隆抗体的制备 0045 以含有pai基因(genebank ： AX062088)的质粒pGEX6-1-PAI为模板， 用一对引物 ： 0046 P7 ： 5 -CGCCATATGTCCATCTCGAAGGATTCAC-3和 0047 P8 ： 5 -CCGCTCGAGTTACACGAAGAACCGCG-3。 0048 通过 PCR 对亚油酸异构酶基因 pai 进行扩增。PCR 程序为 ： 94 15s， 57 30。
27、s， 68 1min， 30 个循环。PCR 反应体系 ： 5l 2mM 的 dNTPs， 5l 10Buffer， 1l KOD plus， 2l 25mM 的 MgSO4， 上游及下游引物各 1.5l， 模板 1l。将扩增后的片段和质粒 pET28a( 购自默克上海代表处 ) 分别经内切酶 Nde I 和 Xho I 37消化 1.5h 后， 通过 1 琼脂糖凝胶电泳分离并回收得到目的片段， 将目的片段与质粒片段进行连接， 得到用于在 大肠杆菌中过表达的重组质粒 pET28a-pai。将构建后的质粒转化 E.Coli DH5 感受态细 胞并均匀涂布于 LB 平板 ( 含有 100g/mL 。
28、卡那青霉素的 LB 琼脂平板 )， 37过夜培养后， 挑选单克隆， PCR 验证正确后送北京六合华大生物技术 ( 上海 ) 有限公司测序。 0049 将测序正确的质粒转化 E.Coli BL21(DE3) 感受态细胞并均匀涂布于 LB 平 说 明 书 CN 102586297 A 6 5/6 页 7 板 ( 含有 100g/mL 卡那青霉素的 LB 琼脂平板 )， 获得大肠杆菌重组菌株 E.Coli BL21(DE3)-pET28a-pai。 将 重 组 菌 株 经 活 化 后， 接 种 于 250mL LB 液 体 培 养 基 中， 37 200rpm/min 培养至 OD600达到 0.6。
29、 0.8， 加入 IPTG( 异丙基 -d- 硫代半乳糖苷， 终 浓度 0.1mM)， 诱导 20h， 离心收集菌体， 用 100mM 磷酸缓冲液 (pH 7.5) 重悬， 冰浴下超声破 壁， 10000rpm/min 离心 10min， 取上清过 Ni-NTA agarose 柱纯化， SDS-PAGE 检测纯化效果 ( 图 6)， 纯化后的 pai 蛋白用于免疫兔子， 最后获得 pai 的特异性多克隆抗体。 0050 实施例 5 重组耶氏解脂酵母重组蛋白的 Westernblot 检测 0051 耶氏解脂酵母重组菌株活化后， 将种子液接种于 50ml YPD 培养基中， 至 OD600 0。
30、.5， 28， 200rpm 培养 3d。8000rpm 离心 5min， 收集菌体， 无菌水洗菌体两次， 菌体重悬 于 RIPA 裂解液中， 冰浴 30min， 10000rpm 离心 10min， 上清通过 BCA 法测定总蛋白浓度， 取 20g 蛋白上样， 经 8-12 SDS-PAGE 分离后， 转移至硝酸纤维素膜上， 先后与 PAI 特异性多 克隆抗体及羊抗兔 lgG 抗体杂交后， 加入显色液避光显色。 0052 经 Westernblot 检测， 7 个 Polh-pINA1312-pai 转化子中只有 Polh-1312-pai-3 和 Polh-1312-pai-4 两个转化子。
31、检测到了 PAI 的杂交条带， 而 12 个 Polh-pINA1312-opai 转化子和 13 个 Polh-pINA1292-opai 转化子全部检测到了杂交条带， 充分说明亚油酸 异构酶基因的密码子优化对于重组蛋白的表达有明显促进作用。而多拷贝整合菌株 (Polh-pINA1312-opa) 的蛋白表达量也明显高于单拷贝整合菌株 (Polh-pINA1292-opai)， 结果见图 7-9。 0053 实施例 6 重组耶氏解脂酵母的脂质提取及脂肪酸组分检测 0054 耶氏解脂酵母重组菌株活化后， 将种子液接种于 50ml YPD 培养基中， 至 OD600 0.5， 28， 200rp。
32、m 培养 3d。8000rpm 离心 5min， 收集菌体， 无菌水洗菌体两次， 取 50mg 冻干 后的酵母菌体， 加入10盐酸-甲醇， 60水浴3h， 气相色谱定性、 定量分析脂肪酸甲酯， 并 进一步通过气质联用确定目的产物 t10， c12-CLA。 0055 通过气相色谱对于脂肪酸组分的分析发现， 重组菌株和对照菌株之间的脂肪酸组 分差异不大， 但大部分重组菌株都在 23min 处检测到一个特征峰， 而对照菌株无此峰出现， 通过与CLA标准品的比较， 确定其为t10， c12-CLA(图10)， 之后通过气质联用进一步确定了 t10， c12-CLA 的产生， 见图 11。与重组蛋白 。
33、PAI 的表达情况一致， 7 个 Polh-pINA1312-pai 转化子中只有Polh-1312-pai-3和Polh-1312-pai-4两个转化子检测到了t10， c12-CLA， 而 12 个 Polh-pINA1312-opai 转化子和 13 个 Polh-pINA1292-opai 转化子全部检测到了 t10， c12-CLA， 而 PAI 的表达量与产物 t10， c12-CLA 的产量也呈正相关 ( 图 7-9)。经过亚油酸 异构酶基因的密码子优化， CLA 在耶氏解脂酵母中的产量提高了 6 倍， 而同时使用了多拷贝 整合质粒后， CLA 在耶氏解脂酵母中的产量较单拷贝插入。
34、天然酶基因的转化子提高了近 30 倍， 达到总脂肪酸含量的 5.9， 见表 1。 0056 表 1. 重组耶氏解脂酵母的脂肪酸组成 0057 说 明 书 CN 102586297 A 7 6/6 页 8 0058 表中数值代表了每种脂肪酸在总脂肪酸中所占的质量比， 数据来源于三组独立的 平行试验， ND 代表未检测到。 说 明 书 CN 102586297 A 8 1/1 页 9 0001 序 列 表 CN 102586297 A 9 1/6 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102586297 A 10 2/6 页 11 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102586297 A 11 3/6 页 12 图 6 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 102586297 A 12 4/6 页 13 图 9 说 明 书 附 图 CN 102586297 A 13 5/6 页 14 图 10 说 明 书 附 图 CN 102586297 A 14 6/6 页 15 图 11 说 明 书 附 图 CN 102586297 A 15 。