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1、(10)申请公布号 CN 102690773 A (43)申请公布日 2012.09.26 CN 102690773 A *CN102690773A* (21)申请号 201210201168.X (22)申请日 2012.06.18 CGMCC No. 6103 2012.05.11 C12N 1/20(2006.01) C12P 19/04(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 南开大学 地址 300071 天津市南开区卫津路 94 号 (72)发明人 李国强 马挺 纪凯华 王晶红 赵倩倩 (74)专利代理机构 天津佳盟知识产权代理有限 公司 12002 。
2、代理人 侯力 (54) 发明名称 一株肠杆菌 FY-07 及其静态液体深层发酵生 产细菌纤维素的方法 (57) 摘要 一株肠杆菌 FY-07 及静态液体深层发酵法生 产细菌纤维素。本发明菌株是从油田采出液中分 离驯化得到， 其分类命名为肠杆菌Enterobacter sp.， 其保藏号为 CGMCC No.6103。该菌可在普通 牛肉汁、 LB、 营养琼脂营养培养基中生长， 也可在 含糖的无机盐培养基中生长并产生细菌纤维素。 本发明提供的FY-07菌株在2035温度条件下， 能够在含糖或不含糖的无机盐和水的无菌培养基 中发酵产生细菌纤维素， 其纤维素产量可以达到 5.1710.32g/L， 且。
3、其纤维素产量不受培养体系的 装液量和氧化还原电位影响。利用本发明提供的 FY-07 菌株可以实现静态液体深层发酵法生产细 菌纤维素。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 1 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种肠杆菌 （Enterobacter sp.） FY-07 菌株， 保藏于 “中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心” ， 分类命名为肠杆菌 Enterobacter sp.， 保藏号为 CGMCC。
4、 No.6103。 2. 根据权利要求 1 所述的菌株， 其特征在于 ： 所述的肠杆菌 FY-07 菌落特征 ： 在 LB 琼脂 （蛋白胨 10g/L， 酵母粉 5g/L， NaCl 5g/L， 琼 脂粉 20g/L） 平板上 30 C 培养 24h 即可长出白色、 圆形菌落， 菌落呈颗粒状， 边缘规则， 大 小直径 1 2mm， 与培养基接触不紧密 ； 肠杆菌 FY-07 菌株的形态特征 ： 革兰氏染色阴性， 菌体呈短杆状， 大小 0.5 1.0m1.02.5m， 不形成芽孢 ； 肠杆菌 FY-07 菌株生理生化特征 ： 生长温度 1540， 生长 pH 范围 512， NaCl 耐受性 0。
5、5 ； 接触酶， 柠檬酸盐利用， 吲哚产生， 硝酸盐还原实验均为阳性 ； V.P.， 淀粉水解， 甲基 红， 亚硝酸盐还原实验为阴性 ； 葡萄糖发酵为氧化型 ； 对氧的需求为兼性厌氧型。 3. 根据权利要求 1 所述的菌株， 其特征在于所述的肠杆菌 FY-07 的 16S rDNA 序列如 SEQ ID No.1 所示。 4. 一种使用权利要求 1 所述菌株生产细菌纤维素的方法， 其特征在于该方法在 以 13g/L 的 NH4NO3， 0.51.5g/L 的 KH2PO4， 0.30.7g/L 的 K2HPO43H2O， 0.20.5g/L 的 MgSO4 7H2O， 0.10.3g/L 的 。
6、MnCl2和 1050g/L 葡萄糖组成的发酵培养基中进行静态液体深 层发酵， 并采用预处理、 碱处理、 水洗和干燥， 从发酵终产物中提取制得细菌纤维素， 具体工 艺步骤是 ： 第一、 以无菌水将原始菌种从一个或多个斜面上洗下， 直接接入含有万分之一纤维素 酶的 LB 培养基中， 好氧发酵培养制成一级种子液 ； 所述的 LB 培养基的组成包括 ： 蛋白胨 10g/L， 酵母粉 5g/L， NaCl 5g/L， 以蒸馏水配制 ； 第二、 将上步培养的一级种子液以 5% 的接种量接入二级种子培养基中进行好氧发酵 培养， 制成二级种子液 ； 其中二级种子培养基的组成包括 ： 13g/L 的 NH4N。
7、O3， 0.5 1.5g/L 的 KH2PO4， 0.30.7g/L 的 K2HPO43H2O， 0.20.5g/L 的 MgSO47H2O， 0.10.3g/L 的 MnCl2和 520g/L 的葡萄糖， 以蒸馏水配制 ； 第三、 将第二步制成的二级种子液以 10% 的接种量接入发酵培养基中进行静态液体深 层发酵生产细菌纤维素 ； 其中发酵培养基的组成包括 ： 13g/L 的 NH4NO3， 0.5 1.5g/L 的 KH2PO4， 0.30.7g/L 的 K2HPO43H2O， 0.20.5g/L 的 MgSO47H2O， 0.10.3g/L 的 MnCl2和 1050g/L 的葡萄糖， 。
8、以蒸馏水配制 ； 第四、 将第三步中获得的发酵产物， 依次经过预处理、 碱处理、 水洗和干燥的后提取处 理工艺得到细菌纤维素。 5. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于， 第四步所述的后提取处理工艺的具体操 作过程是 ： 预处理 ： 用水洗方法去除细菌纤维素水合物中大部分未与纤维素结合的菌体及其碎片 等杂质 ； 碱处理 ： 用 0.1mol/L 的 NaOH 溶液于 80条件下浸泡 2h， 除去纤维素水合物中的菌体 和残留培养基 ； 水洗 ： 用蒸馏水多次冲洗， 直至纤维素水合物的 pH 值近 7.0 ； 干燥 ： 最后将纤维素水合物风干或真空干燥， 即制得细菌纤维素。 权 利 要 求。
9、 书 CN 102690773 A 2 1/7 页 3 一株肠杆菌 FY-07 及其静态液体深层发酵生产细菌纤维素 的方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术和生物材料技术领域， 具体地说， 它涉及一株肠杆菌 FY-07 （Enterobacter sp.FY-07） 菌株， 及利用该菌株进行静态液体深层发酵生产细菌纤维素的 方法。 背景技术 0002 细菌纤维素 （Bacterial Cellulose， 简称 BC） 是细菌产生的一种胞外多糖， 由葡 萄糖分子以 -1,4- 糖苷键连接而成。与植物纤维素相比， 细菌纤维素具有许多独特的性 质 ： 高化学纯度和高结晶度， 无伴生的木质素和。
10、半纤维素 ； 超精细的网状结构， 纤维是 由直径 34nm 的亚纤维组合成 4060nm 粗的纤维束 , 并相互交织形成发达的超精细网络结 构 ； 较高的弹性模量， 其直径在 0.010.1m 之间， 弹性模量为一般植物纤维的数倍至十 倍以上 , 并且抗拉强度高 ； 很强的持水能力， 能吸收 60700 倍于干重的水分 ； 较高的 生物相容性和生物可降解性， 不污染环境。由于细菌纤维素具有以上优异的特性， 在造纸、 食品、 医药、 扬声器材、 生物医学工程、 石油开采等行业中具有广泛的应用前景。 0003 目前已经发现能够产生纤维素的细菌包括 ： Acetobacter， Alcaligene。
11、s， Sarcina， Rhizobium， Pseudomounas， Azotobacter， Agrobacterium， Achromobacter， Aerobacter， Gluconacetobacter， Vibrio， Salmonella， Escherichia 等。其中只有 Gluconacetobacter 和 Acetobacter 的某些种具有商业化生产前景。但这两个属的纤维素产生菌均为好氧菌 株， 只能在供氧充足的条件下大量产生细菌纤维素。 氧的浓度对好氧菌的生长、 纤维素的产 量以及纤维素膜的物理特性均有很大影响。研究表明 ： 当氧分压小于 10% 15% 时。
12、， 纤维素 的产量和膜的韧性随氧分压的增大而增强。这就要求在生产中必须设法满足氧的供应。例 如可以通过增加培养基与空气的接触面积 （薄层静态培养） ， 这样做无疑会增加占地面积及 劳动强度， 不适合规模化生产 ； 还可以采用通气、 搅拌等方式增加溶氧 （动态培养） 。但静态 培养和动态培养产生的纤维素虽然在化学成分上完全相同， 但在形态和物理性能方面差异 却很大， 例如， 静态培养比动态培养产生的纤维素结晶度、 杨氏模量和产量等更高 ； 此外， 较 高的剪切力可能使纤维素产生菌突变为不产纤维素菌株。 因此， 提高溶氧、 降低剪切力是细 菌纤维素培养方式的发展方向。随之出现了动态 - 静态二步培。
13、养法及独特的发酵反应器设 计 （例如生物转盘反应器、 球形鼓泡塔等） ， 但始终无法达到静态培养的效果。因此， 目前细 菌纤维素的生产主要是通过浅盘静态培养。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种能够在好氧和厌氧条件下均能高产细菌纤维素的肠 杆菌 ； 同时提供一种利用静态液体深层发酵法生产细菌纤维素的工艺， 以及从发酵终产物 中提取细菌纤维素的方法。 0005 本发明提供的肠杆菌 FY-07（Enterobacter sp.FY-07） 菌株， 于 2012 年 5 月 11 说 明 书 CN 102690773 A 3 2/7 页 4 日保藏于 “中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生。
14、物中心” （地址 ： 北京市朝阳区北辰西 路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所） ， 其保藏号为 CGMCC No.6103， 分类命名为肠杆菌 Enterobacter sp.。 0006 本发明提供的肠杆菌 FY-07（Enterobacter sp.FY-07） 菌株， 可在普通牛肉汁、 LB、 营养琼脂营养培养基中生长， 也可在含糖的无机盐培养基中生长并产生细菌纤维素。 该 菌株在 15 40之间的任一温度， 且于好氧和厌氧条件下均能生长。 0007 本发明提供的肠杆菌 FY-07（Enterobacter sp.FY-07） 菌株， 是以含糖无机盐培 养基为基础从油田采出液。
15、中分离， 并以糖为唯一碳源在 30 C 反复驯化培养而获得。 0008 本发明提供的肠杆菌 FY-07（Enterobacter sp.FY-07） 菌落特征 ： 在 LB 琼脂 （蛋 白胨 10g/L， 酵母粉 5g/L， NaCl5g/L， 琼脂粉 20g/L） 平板上 30 C 培养 24h 即可长出白色、 圆形菌落， 菌落呈颗粒状， 边缘规则， 大小直径 1 2mm， 与培养基接触不紧密。 0009 本发明提供的肠杆菌 FY-07（Enterobacter sp.FY-07） 菌株的形态特征 ： 革兰氏 染色阴性， 菌体呈短杆状， 大小 0.51.0m（宽） 1.02.5m（长） ， 。
16、不形成芽孢。 0010 本发明提供的肠杆菌 FY-07（Enterobacter sp.FY-07） 菌株生理生化特征 ： 生长 温度 1540， 生长 pH 范围 512， NaCl 耐受性 05 ； 接触酶， 柠檬酸盐利用， 吲哚产生， 硝 酸盐还原实验均为阳性 ； V.P.， 淀粉水解， 甲基红， 亚硝酸盐还原实验为阴性 ； 葡萄糖发酵 为氧化型 ； 对氧的需求为兼性厌氧型。 0011 本发明提供的肠杆菌 FY-07（Enterobacter sp.FY-07）菌株的 16S rRNA 基因 序列特征 ： 将 FY-07 菌株接种于 LB 培养基 （蛋白胨 10g/L， 酵母粉 5g/L。
17、， NaCl 5g/L） ， 30 摇床培养 （180rpm） 24 小时， 离心收集菌体， 重新悬浮， 加溶菌酶和 SDS 破壁， 由酚 - 氯 仿法提取基因组 DNA， 并采用上游引物 （5 -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ）和下游引物 （5 -AAGGAGGTGATCCA GCCGCA-3 ） ， 用这对引物对其16S rDNA基因进行PCR扩增， 将扩增引 物送大连宝生物公司进行测序， 其16S rDNA的序列如SEQ ID No.1所示。 PCR条件为 ： 94， 5min ； 94， 45s， 56.2， 45s， 7290s， 30个循环 ； 729min， 4。
18、保存。 16S rDNA基因序列 长度为 1531bp， 与 Enterobacter cloacae ATCC 13047(99.1%),Enterobacter aerogenes KCTC 2190(98.7%) 的同源性均大于 98%。 0012 本发明同时还提供了使用上述肠杆菌 FY-07（Enterobacter sp.FY-07） 菌株生 产细菌纤维素的方法， 该方法以 13g/L 的 NH4NO3， 0.51.5g/L 的 KH2PO4， 0.30.7g/L 的 K2HPO43H2O， 0.20.5g/L 的 MgSO47H2O， 0.10.3g/L 的 MnCl2和 1050。
19、g/L 的葡萄糖组成 发酵培养基， 使用静态液体深层发酵法生产细菌纤维素， 并依次经过预处理、 碱处理、 水洗 和干燥， 从发酵终产物中提取细菌纤维素。 0013 具体工艺步骤是 ： 0014 第一、 以无菌水将原始菌种从一个或多个斜面上洗下， 直接接入含有万分之一纤 维素酶的 LB 培养基中， 好氧发酵培养制成一级种子液 ； 所述的 LB 培养基的组成包括 ： 蛋白 胨 10g/L， 酵母粉 5g/L， NaCl 5g/L， 以蒸馏水配制 ； 0015 第二、 将上步培养的一级种子液以 5% 的接种量接入二级种子培养基中进行好氧 发酵培养， 制成二级种子液 ； 其中二级种子培养基的组成包括 。
20、： 13g/L 的 NH4NO3， 0.51.5g/ L 的 KH2PO4， 0.30.7g/L 的 K2HPO43H2O， 0.20.5g/L 的 MgSO47H2O， 0.10.3g/L 的 MnCl2 和 520g/L 的葡萄糖， 以蒸馏水配制 ； 说 明 书 CN 102690773 A 4 3/7 页 5 0016 第三、 将第二步制成的二级种子液以 10% 的接种量接入发酵培养基中进行静态液 体深层发酵生产细菌纤维素 ； 其中发酵培养基的组成包括 ： 13g/L 的 NH4NO3， 0.51.5g/L 的 KH2PO4， 0.30.7g/L 的 K2HPO43H2O， 0.20.5。
21、g/L 的 MgSO47H2O， 0.10.3g/L 的 MnCl2和 1050g/L 的葡萄糖， 以蒸馏水配制 ； 0017 第四、 将第三步中获得的发酵产物， 依次经过预处理、 碱处理、 水洗、 干燥的后提取 处理工艺得到细菌纤维素。 0018 后提取处理工艺的具体操作过程是 ： 0019 （1） 预处理 ： 用水洗方法去除细菌纤维素水合物中大部分未与纤维素结合的菌体 及其碎片等杂质 ； 0020 （2） 碱处理 ： 再用 0.1mol/L 的 NaOH 溶液于 80条件下浸泡 2h， 除去纤维素水合 物中的菌体和残留培养基 ； 0021 （3） 水洗 ： 再用蒸馏水多次冲洗， 直至纤维素。
22、水合物的 pH 值近 7.0 ； 0022 （4） 干燥 ： 最后将纤维素水合物风干或真空干燥， 即制得细菌纤维素。 0023 本发明的优点和有益效果 ： 0024 细菌纤维素以其独特的性能及广阔的应用前景成为近二十年来研究的热点。但 目前有潜力作为纤维素工业化生产的菌株比较单一， 均为醋酸杆菌属和葡糖醋杆菌属的菌 株， 且它们都是好氧菌。 与目前细菌纤维素工业生产中用到的菌种均为好氧细菌不同， 本发 明提供的肠杆菌 FY-07（Enterobacter sp.FY-07） 菌株为兼性厌氧细菌， 不仅可以在好氧、 厌氧等不同氧化还原电位下生长， 并在好氧和厌氧条件下均可以大量产生细菌纤维素， 。
23、且 其产量可以达到10g/L， 达到甚至超过纤维素工业主流菌种的产量。 肠杆菌FY-07在好氧和 厌氧条件下均能大量细菌纤维素的特点使利用静态液体深层发酵法生产细菌纤维素成为 可能， 给细菌纤维素生产工艺带来重大变革， 大幅降低细菌纤维素的生产成本， 改善细菌纤 维素的产品质量。 附图说明 0025 图 1 是肠杆菌 FY-07 在 LB 固体培养基上 30培养 24h 后的菌落照片 ； 0026 图 2 是肠杆菌 FY-07 在发酵培养基上 30培养 24h 后的菌体电镜照片 ； 0027 图 3 是不同氧化还原电位下肠杆菌 FY-07 的纤维素产量 ； 0028 图 4 是肠杆菌 FY-0。
24、7 合成细菌纤维素的发酵动态曲线 ； 0029 图 5 是限氧条件下肠杆菌 FY-07 培养体系氧化还原电位的变化 ； 0030 图 6 是静态培养时获得的细菌纤维素水合物状态图。 具体实施方式 0031 实施例 1 0032 本发明提供的肠杆菌 FY-07（Enterobacter sp.FY-07） 菌株的筛选和育种。 0033 取 10mL 吉林油田的油田采出液于 90mL 含葡萄糖无机盐培养基中 （培养基组成 ： KH2PO43.48g/L， Na2HPO412H2O 1.5g/L， (NH4)2SO42g/L， MgSO47H2O 0.5g/L， 酵母提取物 0.05g/L， 葡萄糖。
25、 10g/L， 蒸馏水 1000mL， pH7.2， 105灭菌 30min） ， 置于 200r/min 低温摇床 30富集培养 5 天。由于细菌纤维素具有精细的网状结构， 致使其菌落与固体培养基表面 说 明 书 CN 102690773 A 5 4/7 页 6 接触不紧密， 挑取菌落时容易在固体培养基表面滑动。因此将上述富集培养物在固体平板 上划线培养后选取与培养基表面接触不紧密的菌落进行复筛 ； 复筛时将挑选的菌落接种至 新鲜的 100mL 葡萄糖无机盐培养基中进行传代驯化， 培养条件同上 ； 经过 5 7 个周期富 集后最终得到 FY-07 ； 在 LB 琼脂 （蛋白胨 10g/L， 。
26、酵母粉 5g/L， NaCl 5g/L， 琼脂粉 20g/L） 平 板上反复划线， 挑取单菌落划斜面保存 ； 将 FY-07 菌落分别取一环接入装有 5mL LB 培养基 （蛋白胨 10g/L， 酵母粉 5g/L， NaCl 5g/L） 的试管内， 30震荡培养 48h， 作为种子液 ； 分别取 1mL 种子液接入装有 100mL 葡萄糖无机盐培养基的 250mL 三角瓶中， 30培养 3d， 检测多糖 聚合物的产量和种类 （具体方法详见实施例 4 和实施例 5） ， 选取纤维素产量最高的菌株作 为选育目的菌株。 0034 实施例 2 0035 肠杆菌 FY-07（Enterobacter s。
27、p.FY-07） 菌株的形态特征和生理生化特征。 0036 参照 Bergey s Mannual of Systematic Bacteriology （Vol. ） 的实验方 法进行， 检测其革兰氏染色， 菌体大小和形态， 有无芽孢， 生长温度， 生长 pH 范围， NaCl 耐受 性。接触酶， M.R. 实验， V.P. 实验， 吲哚产生， 硝酸盐还原， 淀粉水解， 柠檬酸盐利用， 葡萄糖 发酵等实验。 0037 肠杆菌FY-07在LB琼脂 （蛋白胨10g/L， 酵母粉5g/L， NaCl 5g/L， 琼脂粉20g/L） 平 板上30C培养24h即可长出白色、 圆形菌落， 菌落呈颗粒状，。
28、 边缘规则， 大小直径12mm， 与培养基接触不紧密 ； 革兰氏染色阴性， 菌体呈短杆状， 大小 0.51.0m （宽） 1.02.5m （长） ， 不形成芽孢 ； 生长温度 1540， 生长 pH 范围 512， NaCl 耐受性 05 ； 接触酶， 柠檬 酸盐利用， 吲哚产生， 硝酸盐还原实验均为阳性 ； V.P.， 淀粉水解， M.R.， 亚硝酸盐还原实验 为阴性 ； 葡萄糖发酵为氧化型 ； 对氧的需求为兼性厌氧型。 0038 实施例 3 0039 肠杆菌 FY-07（Enterobacter sp.FY-07） 菌株的 16S rRNA 基因的 PCR 扩增和序 列测定。 0040 本。
29、发明提供的肠杆菌 FY-07 （Enterobacter sp.FY-07） 菌株的 16S rRNA 基因序列 特征 ： 将FY-07菌株接种于LB培养基 （蛋白胨10g/L， 酵母粉5g/L， NaCl 5g/L） ， 30摇床培 养 （180rpm） 24h， 离心收集菌体， 重新悬浮， 加溶菌酶和 SDS 破壁， 由酚 - 氯仿法提取基因组 DNA， 并采用上游引物 （5 -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ） 和下游引物 （5 -AAGGAGGTGATCCA GCCGCA-3 ） ， 用这对引物对其 16S rDNA 基因进行 PCR 扩增， 将扩增引物送大连宝生物公司。
30、 进行测序， 其 16S rDNA 的序列如 SEQ ID No.1 所示。PCR 条件为 ： 94， 5min ； 94， 45s， 56.2， 45s， 7290s， 30个循环 ； 729min， 4保存。 16S rDNA基因序列长度为1531p， 与 Enterobacter cloacaeATCC 13047(99.1%),Enterobacter aerogenes KCTC 2190(98.7%) 的同源性均大于 98%。 0041 实施例 4 0042 肠杆菌 FY-07（Enterobacter sp.FY-07） 菌株的多糖聚合物定性分析。 0043 肠杆菌 FY-07（。
31、Enterobacter sp.FY-07） 菌株产生的聚合物不溶于水、 醇、 酮等有 机溶剂。 0044 聚合物的双缩脲反应、 斐林试剂反应均为阴性， 说明样品中不含游离的氨基酸和 单糖类物质。 采用不同的特异性显色方法对聚合物样品和酸水解后的样品进行薄层定性分 说 明 书 CN 102690773 A 6 5/7 页 7 析。酸水解前后的聚合物样品用硫酸 - 蒽酮显色后都呈明显的蓝绿色斑点， 说明样品中含 有糖类成分 ； 聚合物样品的丁酮抽提物用钼酸铵 - 高氯酸显色无明显斑点， 说明聚合物中 不含有脂类物质 ； 用茚三酮显色水解聚合物样品无明显斑点， 说明聚合物样品中不含有多 肽组分。 。
32、0045 聚合物样品经过三氟乙酸水解后， 气相色谱法测定单糖组成， 结果表明样品中只 含有一种单糖， 其相对保留时间为14.542， 与葡萄糖标准品的相对保留时间一致。 进一步采 用酶解法确定聚合物中葡萄糖苷键的链接方式， 结果表明 ： 肠杆菌 FY-07 产生的多糖只能 被纤维素酶水解而不能被淀粉酶、 半纤维素酶、 果胶酶等糖苷酶水解。说明肠杆菌 FY-07 产 生的多糖为葡萄糖分子以 -1,4- 糖苷键连接而成的纤维素。 0046 实施例 5 0047 本发明提供的肠杆菌 FY-07（Enterobacter sp.FY-07） 菌株生产细菌纤维素的方 法 1。 0048 将肠杆菌 FY-。
33、07 在以 1g/L 的 NH4NO3， 0.5g/L 的 KH2PO4， 0.3g/L 的 K2HPO43H2O， 0.2g/L 的 MgSO4 7H2O， 0.1g/L 的 MnCl2和 10g/L 的葡萄糖组成的培养基为发酵培养基进行 发酵， 发酵过程是在 20， pH 6.0 的条件下进行静态液体深层发酵， 对发酵终产物采用预 处理、 碱处理、 水洗和干燥技术， 从发酵终产物中提取细菌纤维素。具体工艺步骤是 ： 0049 1、 以无菌水将原始菌种从一个或多个斜面上洗下， 直接接入含有万分之一纤维素 酶的 LB 培养基 （蛋白胨 10g/L， 酵母粉 5g/L， NaCl 5g/L） 中。
34、， 好氧发酵 24 36h 制成一级 种子液 ； 0050 2、 将一级种子液以 5% 的接种量接入二级种子培养基 （1g/L 的 NH4NO3， 0.5g/L 的 KH2PO4， 0.3g/L 的 K2HPO43H2O， 0.2g/L 的 MgSO47H2O， 0.1g/L 的 MnCl2和 5g/L 的葡萄糖， 以蒸馏水配制） 中 20好氧发酵 24 36h 制成二级种子液 ； 0051 3、 将二级种子液以 10% 的接种量接入发酵培养基 （1g/L 的 NH4NO3， 0.5g/L 的 KH2PO4， 0.3g/L 的 K2HPO43H2O， 0.2g/L 的 MgSO47H2O， 0。
35、.1g/L 的 MnCl2和 10g/L 的葡萄糖， 以蒸馏水配制） 中， 于 20条件下进行静态液体深层发酵生产细菌纤维素。 0052 4、 将发酵终产物进行后提取处理工艺得到纤维素， 包括如下步骤 ： 0053 （1） 预处理 ： 用水洗方法去除细菌纤维素水合物中大部分未与纤维素结合的菌体 及其碎片等杂质 ； 0054 （2） 碱处理 ： 再用 0.1mol/L 的 NaOH 溶液于 80条件下浸泡 2h， 除去纤维素水合 物中的菌体和残留培养基 ； 0055 （3） 水洗 ： 再用蒸馏水多次冲洗， 直至纤维素水合物的 pH 值近 7.0 ； 0056 （4） 干燥 ： 最后将纤维素水合物。
36、风干或真空干燥， 即制得细菌纤维素。统计称重纤 维素产量约为 5.17g/L。 0057 实施例 6 0058 本发明提供的肠杆菌 FY-07（Enterobacter sp.FY-07） 菌株生产细菌纤维素的方 法 2。 0059 将肠杆菌FY-07在以2g/L的NH4NO3， 1g/L的KH2PO4， 0.5g/L的K2HPO4 3H2O， 0.35g/ L 的 MgSO4 7H2O， 0.2g/L 的 MnCl2和 30g/L 的葡萄糖组成的培养基为发酵培养基进行发酵， 发酵过程是在 30， pH 7.0 的条件下进行静态液体深层发酵， 对发酵终产物采用预处理、 说 明 书 CN 102。
37、690773 A 7 6/7 页 8 碱处理、 水洗和干燥技术， 从发酵终产物中提取细菌纤维素。具体工艺步骤是 ： 0060 1、 以无菌水将原始菌种从一个或多个斜面上洗下， 直接接入含有万分之一纤维素 酶的 LB 培养基 （蛋白胨 10g/L， 酵母粉 5g/L， NaCl 5g/L） 中， 好氧发酵 24 36h 制成一级 种子液 ； 0061 2、 将一级种子液以 5% 的接种量接入二级种子培养基 （2g/L 的 NH4NO3， 1g/L 的 KH2PO4， 0.5g/L 的 K2HPO43H2O， 0.35g/L 的 MgSO47H2O， 0.2g/L 的 MnCl2和 10g/L 的。
38、葡萄 糖， 以蒸馏水配制） 中 30好氧发酵 24 36h 制成二级种子液 ； 0062 3、 将二级种子液以 10% 的接种量接入发酵培养基 （2g/L 的 NH4NO3， 1g/L 的 KH2PO4， 0.5g/L 的 K2HPO43H2O， 0.35g/L 的 MgSO47H2O， 0.2g/L 的 MnCl2和 30g/L 的葡萄糖， 以蒸 馏水配制） 中， 于 30条件下进行静态液体深层发酵生产细菌纤维素。 0063 4、 将发酵终产物进行后提取处理工艺得到纤维素， 包括如下步骤 ： 0064 （1） 预处理 ： 用水洗方法去除细菌纤维素水合物中大部分未与纤维素结合的菌体 及其碎片等。
39、杂质 ； 0065 （2） 碱处理 ： 再用 0.1mol/L 的 NaOH 溶液于 80条件下浸泡 2h， 除去纤维素水合 物中的菌体和残留培养基 ； 0066 （3） 水洗 ： 再用蒸馏水多次冲洗， 直至纤维素水合物的 pH 值近 7.0 ； 0067 （4） 干燥 ： 最后将纤维素水合物风干或真空干燥， 即制得细菌纤维素。统计称重纤 维素产量约为 10.32g/L。 0068 实施例 7 0069 本发明提供的肠杆菌 FY-07（Enterobacter sp.FY-07） 菌株生产细菌纤维素的方 法 3。 0070 将肠杆菌 FY-07 在以 3g/L 的 NH4NO3， 1.5g/L。
40、 的 KH2PO4， 0.7g/L 的 K2HPO43H2O， 0.5g/L 的 MgSO4 7H2O， 0.3g/L 的 MnCl2和 50g/L 的葡萄糖组成的培养基为发酵培养基进行 发酵， 发酵过程是在 35， pH 8.0 的条件下进行静态液体深层发酵， 对发酵终产物采用预 处理、 碱处理、 水洗和干燥技术， 从发酵终产物中提取细菌纤维素。具体工艺步骤是 ： 0071 1、 以无菌水将原始菌种从一个或多个斜面上洗下， 直接接入含有万分之一纤维素 酶的 LB 培养基 （蛋白胨 10g/L， 酵母粉 5g/L， NaCl 5g/L） 中， 好氧发酵 24 36h 制成一级 种子液 ； 00。
41、72 2、 将一级种子液以 5% 的接种量接入二级种子培养基 （3g/L 的 NH4NO3， 1.5g/L 的 KH2PO4， 0.7g/L 的 K2HPO43H2O， 0.5g/L 的 MgSO47H2O， 0.3g/L 的 MnCl2和 20g/L 的葡萄糖， 以蒸馏水配制） 中 35好氧发酵 24 36h 制成二级种子液 ； 0073 3、 将二级种子液以 10% 的接种量接入发酵培养基 （3g/L 的 NH4NO3， 1.5g/L 的 KH2PO4， 0.7g/L 的 K2HPO43H2O， 0.5g/L 的 MgSO47H2O， 0.3g/L 的 MnCl2和 50g/L 的葡萄糖，。
42、 以蒸馏水配制） 中， 于 35条件下进行静态液体深层发酵生产细菌纤维素。 0074 4、 将发酵终产物进行后提取处理工艺得到纤维素， 包括如下步骤 ： 0075 （1） 预处理 ： 用水洗方法去除细菌纤维素水合物中大部分未与纤维素结合的菌体 及其碎片等杂质 ； 0076 （2） 碱处理 ： 再用 0.1mol/L 的 NaOH 溶液于 80条件下浸泡 2h， 除去纤维素水合 物中的菌体和残留培养基 ； 说 明 书 CN 102690773 A 8 7/7 页 9 0077 （3） 水洗 ： 再用蒸馏水多次冲洗， 直至纤维素水合物的 pH 值近 7.0 ； 0078 （4） 干燥 ： 最后将纤。
43、维素水合物风干或真空干燥， 即制得细菌纤维素。统计称重纤 维素产量约为 8.52g/L。 0079 实施例 8 0080 本发明提供的肠杆菌 （Enterobacter sp.FY-07） 菌株发酵生产细菌纤维素时对氧 的需求。 0081 将肠杆菌 FY-07 分别在有氧、 限氧和无氧条件下进行静态液体深层发酵培养， 测 定其在不同氧化还原电位下菌体生长和细菌纤维素的产生状况。 以无菌水将原始菌种从一 个或多个斜面上洗下制成菌悬液 （12107cells/mL） ， 然后将此菌悬液直接接入发酵培养 基 （2g/L 的 NH4NO3， 1g/L 的 KH2PO4， 0.5g/L 的 K2HPO4。
44、3H2O， 0.35g/L 的 MgSO47H2O， 0.2g/L 的 MnCl2和 30g/L 的葡萄糖， 以蒸馏水配制） 中， 30条件下进行静态液体深层发酵生产细 菌纤维素。好氧培养在 250mL 三角瓶中进行， 装液量为 230mL, 三角瓶用可以通气的乳胶塞 封口。厌氧培养时， 应先将培养基煮沸， 加入终浓度为 1mg/L 的刃天青， 密封、 灭菌。然后， 在经紫外照射灭菌的厌氧培养箱中加入 0.5g/L 的半胱氨酸盐酸盐， 调节 pH 至 7.0， 接种后 通无菌N2(2.0m3/h)直至培养基变为无色， 最后分装到厌氧瓶中。 限氧培养在厌氧培养瓶中 进行， 与厌氧培养不同的是培养。
45、体系不除氧， 不加半胱氨酸盐酸盐。 纤维素的提取和定量参 照实施例 5 中的第 4 步进行。 0082 在不同氧化还原电位条件下肠杆菌 FY-07 均能大量产生细菌纤维素， 其产量可以 达到 5.1710.32g/L， 且不同氧化还原电位下细菌纤维素的产量并没有较大变化， 说明在利 用肠杆菌 FY-07 发酵生产纤维素时氧的有无不影响其生长和纤维素产量。限氧条件下， 培 养体系的氧化还原电位随着菌体的生长和纤维素的产生逐渐降低。肠杆菌 FY-07 不是只在 培养基表面产生细菌纤维素， 并逐渐形成纤维素膜的 ； 而是在整个培养体系中产生细菌纤 维素， 形成果冻状细菌纤维素水合物， 之后随着纤维素中气体含量的增加改变了它的比重， 逐渐漂浮到液面形成了纤维素膜。 这使得利用静态液体深层发酵法生产细菌纤维素成为可 能。 说 明 书 CN 102690773 A 9 1/1 页 10 0001 序 列 表 CN 102690773 A 10 1/3 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102690773 A 11 2/3 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102690773 A 12 3/3 页 13 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102690773 A 13 。