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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410274666.6 (22)申请日 2014.06.18 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人 南京农业大学 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇国 家农业科技园南京农业大学基地 (72)发明人 张绍铃 吴俊 李雷廷 孙江妹 张全军 刘伦 齐开杰 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 傅婷婷 徐冬涛 (54) 发明名称 一种梨果实种子数量主效 QTL 位点的 SNP 分 子标记引物及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种与梨果。
2、实种子数量主效 QTL 位点的 SNP 标记引物及其应用。梨果实种子 数量主效QTL位点qSeeds的SNP标记Pyd14_051， 正向引物序列如SEQ ID NO.1所示， 反向引物序列 如 SEQ ID NO.2 所示。利用该特异引物基于高分 辨率溶解曲线鉴定梨果实种子数量的特异标记， 该特异引物可对种子数量进行良好分型， 即检测 QTL 位点 qSeeds 上的多态性表达种子数量的差 异。本发明提供的梨果实种子数量主效 QTL 位点 SNP 标记可用于梨果实种子数量的分子标记辅助 选择育种， 对于加快梨品种的遗传改良进程， 提高 育种选择效率具有重要的理论和实践指导意义。 (51)In。
3、t.Cl. 审查员 赵重甲 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 104032021 B 2016.05.04 CN 104032021 B 1.一种与梨果实种子数量主效QTL位点qSeeds紧密连锁的SNP标记引物对， 其特征在 于： 正向引物SEEDS-F： SEQIDNO.1， 反向引物SEEDS-R： SEQIDNO.2； 所述的与梨果实种子 数量主效QTL位点qSeeds登录号为AJSU00000000的梨基因组序列scaffold14.0的第907649 个碱基处， 利用所述的SNP标记引物对对梨基因组DNA。
4、进行HRM反应， 如果扩增产物序列大 小在272bp， 表明存在与梨种子数量相关的QTL位点qSeeds。 2.权利要求1所述的SNP标记引物对在梨分子育种中的应用， 其特征在于利用所述的引 物对基于高分辨率溶解曲线鉴定检测登录号为AJSU00000000的梨基因组序列 scaffold14 .0的第907649个碱基处是否存在一个与梨果实种子数量相关的QTL位点 qSeeds， 同时检测QTL位点qSeeds上的多态性表达梨果实种子数量的差异， 预测梨果实种子 数量的高低， 以实现梨果实种子数量性状的早期鉴定和筛选； 其中， 所述的梨选自 砀山酥 梨 或 八月红 。 3.权利要求1所述的SN。
5、P标记引物对在检测梨果实种子数量主效QTL位点qSeeds及其 SNP多态性中的应用； 其中， 所述的梨选自 砀山酥梨 或 八月红 ； 所述的与梨果实种子数 量主效QTL位点qSeeds登录号为AJSU00000000的梨基因组序列scaffold14.0的第907649个 碱基处， 利用所述的SNP标记引物对对梨基因组DNA进行HRM反应， 如果扩增产物序列大小 在272bp， 表明存在与梨种子数量相关的QTL位点qSeeds。 4.权利要求1所述的引物对用于检测梨果实种子数量主效QTL位点qSeeds的SNP标记方 法， 所述的与梨果实种子数量主效QTL位点qSeeds登录号为AJSU00。
6、000000的梨基因组序列 scaffold14.0的第907649个碱基处， 其特征在于： 利用权利要求1所述的SNP标记引物对对 梨基因组DNA进行HRM反应， 如果扩增产物序列大小在272bp， 表明存在一个与梨种子数量 相关的QTL位点qSeeds； PCR循环结束后进行熔解， 最后， 在LightCycler480II的Gene Scanning软件1.5version自动生成扩增产物的不同颜色和线型的熔解曲线， 分别以已知 梨果实种子数量相关的QTL位点qSeeds上表达的种子数量多的品种和表达的种子数量少的 品种为对照， 检测QTL位点qSeeds上的多态性表达种子数量的差异， 。
7、如果未知品种得到的扩 增产物的熔解曲线与对照的颜色相同、 线型相似， 则表示在梨果实种子数量主效QTL位点 qSeeds上的多态性表达的种子数量和对照相似； 其中， 所述的种子数量多的品种是指种子 数量大于等于8的梨品种， 所述的种子数量少的品种是指种子数量小于8的梨品种； 其中， 所 述的梨选自 砀山酥梨 或 八月红 ； 所述的已知梨果实种子数量相关的QTL位点qSeeds上 表达的种子数量多的品种为 砀山酥梨 ， 已知梨果实种子数量相关的QTL位点qSeeds上表 达的种子数量少的品种为 八月红 。 5.根据权利要求4所述的SNP标记方法， 其特征在于： 所述的HRM反应的反应体系按照 L。
8、ightCycler480HighResolutionMeltingMaster试剂盒中的说明书进行， HRM分析 是在LightCycler480II荧光定量PCR仪上进行； 10 L反应体系： 含有2ng L-1梨 基因组DNA模板、 1MasterMix、 2.0mmolL-1MgCl2、 0.2mmolL-1权利要求1 所述的引物对； 扩增程序采用降落式PCR： 95预变性10min， 然后95变性10s、 60 55， 每循环下降0.5， 退火15s、 72延伸12s的程序进行45个循环； PCR循环结束后进行熔解的程序为： 951min， 401min， 651s， 再从 65连续。
9、升温至95， 每升高0.04， 收集荧光1次， 最后降温至40。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104032021 B 2 一种梨果实种子数量主效QTL位点的SNP分子标记引物及其 应用 技术领域 0001 本发明属于分子遗传育种领域， 涉及一种梨果实种子数量主效QTL位点的SNP分子 标记引物及其应用。 背景技术 0002 我国是世界梨属(PyrusL.)植物最主要的起源地之一， 遗传多样性丰富。 梨的栽 培种分布广泛， 除了海南省和台湾省， 都有栽培。 梨果实的营养价值高， 香甜多汁， 而深受消 费者喜爱。 梨果实的发育与果实的种子数量密切相关， 原因在于种子是产生植物激素的中 心， 。
10、它能产生一个生理上强有力的 “库” ， 有利于幼果对养分的竞争， 从而保证果实的正常发 育。 研究表明， 果实内种子数量和果实的大小成正相关； 种子数量多而且饱满的果实， 果型 端正， 商品果率高； 相反则畸形果率高。 因此果实内种子的数量和质量对果实的大小、 形状 等外观品质都有很大影响， 并通过影响果实的大小进而影响果实的内在品质。 所以在生产 上可通过人工授粉， 或使用外源生长调节剂等措施使之形成尽量多的饱满种子， 进而提高 果实的产量和改善果实品质。 此外， 种子的数量对于培育杂交育种后代也具有重要的意义。 因此， 选育种子发育良好的梨品种是重要的育种目标之一。 0003 由于绝大多数。
11、梨品种是自交不亲和的， 梨的遗传组成表现高度杂合性； 同时， 由于 多年生果树的农艺性状多数表现为数量性状遗传特征， 有关梨的重要性状遗传规律研究相 对滞后， 也难以开展目标性状的遗传改良。 近年来， 随着分子标记技术的迅速发展、 高密度 的分子遗传图谱的出现， 以及数量性状作图方法的不断完善， 使得数量性状基因座(QTL)定 位变成了现实， 也为提高目标数量性状优良基因型选择的可能性、 准确性及预见性奠定了 基础。 利用分子标记定位数量性状QTL， 其实质就是分析分子标记与目标性状QTL之间的连 锁关系， 即利用已知座位的分子标记来定位未知座位的QTL， 通过计算分子标记与QTL之间 的交换。
12、率， 来确定QTL的具体位置。 基于获得的标记基因型分离与数量性状表型之间的关 系， 可直接确定控制数量性状位点， 开发可应用于分子标记辅助选择育种的技术， 这已在许 多重要农作物上取得了成功应用。 0004 目前有关梨数量性状的QTL定位研究仍属起步阶段， 已有的研究主要是针对一些 病害或生长性状， 对梨种子数量性状的QTL定位及检测QTL位点上的多态性表达种子数量差 异的SNP分子标记的开发应用研究尚未有报道。 因此， 开展梨种子数量性状的QTL定位， 基于 相应序列信息开发SNP分子标记， 并建立杂交后代早期辅助选择技术体系， 对于提高梨果实 品质， 提高育种效率， 节约生产成本显得尤为。
13、重要。 发明内容 0005 本发明的目的是定位梨果实种子数量主效QTL， 根据贡献位点序列信息开发基于 高分辨率溶解曲线鉴定梨果实种子数量的SNP特异标记Pyd14_051， 检测QTL位点qSeeds上 的多态性表达种子数量的差异。 通过该分子标记可以预测梨种子数量的大小， 为实现种子 说明书 1/5 页 3 CN 104032021 B 3 数量性状的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持。 0006 本发明的目的可通过如下技术方案实现： 0007 一种与梨果实种子数量主效QTL位点紧密连锁的SNP标记引物， 其中： 0008 正向引物SEEDS F： 5 TCTGTGGATGAGCTTT。
14、GAGTT 3 (SEQIDNO.1)， 0009 反向引物SEEDS R： 5 AGTAGAGGGTTGCTTTTGGGA 3 (SEQIDNO.2)。 0010 本发明所述的SNP标记引物对在梨分子育种中的应用， 利用所述的SNP标记Pyd14_ 051引物对基于高分辨率溶解曲线鉴定检测登录号为AJSU00000000的梨基因组序列 scaffold14 .0的第907649个碱基处是否存在一个与梨果实种子数量相关的QTL位点 qSeeds， 同时检测QTL位点上的多态性表达梨果实种子数量的差异， 预测梨果实种子数量的 高低， 以实现梨果实种子数量性状的早期鉴定和筛选。 0011 本发明所。
15、述的SNP标记引物对在检测梨果实种子数量主效QTL位点qSeeds及其SNP 多态性中的应用。 0012 本发明所述的引物用于检测梨果实种子数量主效QTL位点qSeeds的SNP标记方法： 利用权利要求1所述的SNP标记引物对梨基因组DNA进行HRM反应， 如果扩增产物序列大小在 272bp， 表明存在一个与梨种子数量相关的QTL位点qSeeds； PCR循环结束后进行熔解， 最后， 在480II的GeneScanning软件中1.5version自动生成扩增产物的不同颜色和 线型的熔解曲线， 分别以已知梨果实种子数量相关的QTL位点qSeeds上表达的种子数量多 的品种和表达的种子数量少的品。
16、种为对照， 检测QTL位点qSeeds上的多态性表达种子数量 的差异， 如果未知品种得到的扩增产物的熔解曲线与对照的颜色相同、 线型相似， 则表示在 梨果实种子数量主效QTL位点qSeeds上的多态性表达的种子数量和对照相似； 其中， 所述的 种子数量多的品种是指种子数量大于等于8的梨品种， 所述的种子数量少的品种是指种子 数量小于8的梨品种。 0013 其中所述的已知与梨种子数量相关的QTL位点qSeeds上多态性表达的种子数量多 的品种为 砀山酥梨 ， 表达的种子数量少的品种为 八月红 。 0014所述的HRM反应的反应体系按照480HighResolutionMelting Master。
17、试剂盒中的说明书进行， HRM分析是在480II荧光定量PCR仪上进行； 10 L 反应体系： 含有2ng L 1梨基因组DNA模板、 1MasterMix、 2.0mmolL 1MgCl2、 0.2mmol L 1权利要求1所述的引物； 扩增程序采用降落式PCR： 95预变性10min， 然后95变性10s、 6055， 每循环下降0.5， 退火15s、 72延伸12s的程序进行45个循环； PCR循环结束后 进行熔解的程序为： 951min， 401min， 651s， 再从65连续升温至95， 每升高0.04 ， 收集荧光1次， 最后降温至40。 0015 一种与梨果实种子数量主效QTL。
18、位点qSeeds紧密连锁的SNP标记， 该分子标记由引 物对： 正向引物JUICE F： SEQIDNO.1和反向引物JUICE R： SEQIDNO.2扩增梨基因组DNA 得到。 0016 本发明所述的SNP标记在梨分子育种中的应用， 该分子标记位于梨的第14连锁群 的113.6cM处， Kruskal-Wallis统计测验值为15.039， 在 0.001显著水平下显著， 利用区 间作图法的LOD值为2.91， 对梨果实种子数量性状的贡献率为22.2。 0017 9.权利要求7所述的SNP标记在检测梨果实种子数量含量主效QTL位点qSeeds及其 说明书 2/5 页 4 CN 104032。
19、021 B 4 SNP多态性中的应用。 0018 本发明所述的SNP标记用于检测梨果实种子数量主效QTL位点qSeeds的SNP标记方 法： 利用权利要求1所述的SNP标记引物对梨基因组DNA进行HRM反应， 如果扩增产物序列大 小在272bp， 表明存在一个与梨种子数量相关的QTL位点qSeeds； PCR循环结束后进行熔解， 最后， 在480II的GeneScanning软件中1.5version自动生成扩增产物的不同颜 色和线型的熔解曲线， 分别以已知梨果实种子数量相关的QTL位点qSeeds上表达的种子数 量多的品种和表达的种子数量少的品种为对照， 检测QTL位点qSeeds上的多态性。
20、表达种子 数量的差异， 如果未知品种得到的扩增产物的熔解曲线与对照的颜色相同、 线型相似， 则表 示在梨果实种子数量主效QTL位点qSeeds上的多态性表达的种子数量和对照相似； 其中， 所 述的种子数量多的品种是指种子数量大于等于8的梨品种， 所述的种子数量少的品种是指 种子数量小于8的梨品种； 所述的已知与梨种子数量相关的QTL位点qSeeds上多态性表达的 种子数量多的品种为 砀山酥梨 ， 表达的种子数量少的品种为 八月红 。 0019 有益效果 0020 (1)本发明首次对决定 八月红 和 砀山酥梨 果实种子数量的数量性状位点进行 了QTL定位， 定位的QTL位点对该数量性状的存在显著。
21、关联关系( 0.0005)， 且贡献率较 高， 位点的贡献率为22.2。 这为实现分子辅助育种多基因控制性状遗传改良奠定了重要 的基础和必要的前提。 0021 (2)目前普遍认为可应用于分子辅助选择的连锁标记与目标性状的距离需 5cM， 本发明中种子数量主效QTL定位直接定位到SNP标记上， 且LOD值为2.91， 连锁性和可靠性 高， 这对于提高分子标记辅助选择的准确性和效率具有重要意义。 0022 (3)本发明根据定位的梨种子数量性状主效QTL位点连锁标记Pyd14_051开发检测 梨种子数量的SNP标记引物， 用于预测QTL位点qSeeds上多态性表达种子数量差异， 为梨果 实种子数量的。
22、预先选择提供了可靠的分子标记来源。 0023 (4)利用开发的SNP标记引物， 对 八月红 和 砀山酥梨 26株杂交群体进行QTL位 点qSeeds上多态性表达种子数量差异基因型检测， 可将杂交群体分为两组， 与果实实际观 察的种子数量多和种子数量少相符。 群体试验表明， 开发的SNP标记特异引物可以对后代种 子数量进行良好分型(图2)， 因此， 具有良好的应用价值， 可实现对梨果实种子数量性状的 预先选择和辅助育种。 附图说明 0024 图1为梨种子数量主效QTL区间及SNP标记位点Pyd14_051在第14连锁群上的位置。 LG14代表的是 八月红 和 砀山酥梨 合并遗传连锁图谱的第14连。
23、锁群。 SNP标记名称起始 为 Pyb 的代表来自 八月红 的SNP标记， 起始名称为 Pyd 的代表来自 砀山酥梨 的SNP标 记， 起始名称为 Pybd 的代表同时来自 八月红 和 砀山酥梨 的SNP标记。 0025 连锁群左侧的数字是标记之间的遗传距离， 单位为cM。 连锁群右侧的实心长方形 指示QTL作图区间。 右边的曲线图为QTL的LOD分布图。 果实种子数量QTL位点对应连锁群上 的Pyd14_051标记， 其位于第14连锁群113.6cM处， LOD值为2.91。 0026 图2为依据SNP标记Pyd14_051开发的HRM特异标记引物， 在 八月红 和 砀山酥梨 后代26个个体。
24、中检测的溶解曲线， 可良好分型。 熔解曲线： 线型1红色曲线， 19株个体， 全 说明书 3/5 页 5 CN 104032021 B 5 部19株种子数量多(8)； 线型2蓝色曲线， 7株个体， 其中5株种子数量少( 8)。 两组的符 合率分别为100和71。 具体实施方式 0027 实施例1： 0028 梨果实种子数量主效QTL连锁的分子标记， 是通过以下方法获得的： 0029 a)利用 八月红 和 砀山酥梨 (品种为公知公用， 见文献： 张瑞萍等， 梨AFLP标记 遗传图谱构建及果实相关性状的QTL定位， 园艺学报， 2011， 38(10)： 19911998)杂交获得其 102株F1。
25、后代单株。 0030 b)利用RADseq方法高通量测序， 对 八月红 和 砀山酥梨 及后代进行分析， 并统 计分析多态性位点在后代群体中的遗传类型， 利用 2测验分析各标记分离是否符合3:1或 1:1的孟德尔遗传分离比例。 0031 c)用Joinmap4.0分析软件构建 八月红 和 砀山酥梨 的分子遗传连锁图谱。 将第 b)步骤中得到的多态性标记位点按Joinmap4.0分析软件中适于CP群体构图的格式导入 Joinmap4.0， 排除缺失数据过多的位点和显著偏分离的位点， 卡方检测的P值为0.05， 选择 Kosambi作图函数构建遗传连锁图。 0032 d)对 八月红 和 砀山酥梨 及。
26、其F1群体单株的果实种子数量进行计数统计， 大于 或等于8粒种子的计为种子数量多， 少于8粒种子的计为种子数量少。 0033 e)将种子数量的表型值和标记信息的相关文件导入MapQTL5.0软件， 选择区间作 图法， 以LOD值 3.0为标准， 对梨的种子数量进行QTL分析和定位。 结果表明， 在 八月红 和 砀山酥梨 的第14连锁群上检测到种子数量的主效QTL位点qSeeds(图1)， 对该性状的贡献 率为22.2， 其对应的SNP标记Pyd14_051在连锁群上的遗传距离为113.6cM， LOD值为2.91。 0034 f)利用SNP标记位点Pyd14_051开发HRM特异引物。 003。
27、5 通过梨全基因组数据库(http:/peargenome 从登录号为 AJSU00000000的梨基因组序列scaffold14.0中搜索出第14连锁群上SNP标记Pyd14_051的 DNA序列， 选取该位点前后300bp的序列， 依据引物设计原则， 开发设计SNP标记引物。 正向引 物序列SEEDSF为 5TCTGTGGATGAGCTTTGAGTT3 ； 反向引物SEEDSR为5 AGTAGAGGGTTGCTTTTGGGA 3 。 扩增产物序列大小272bp， 利用设计的SNP标记引物在 八月 红 和 砀山酥梨 的基因组DNA上进行PCR扩增， 引物均扩增正常， PCR产物符合预测大小。。
28、 因 此， 该引物可作为梨种子数量性状的检测标记。 0036 g)利用HRM技术对梨果实种子数量进行分型。 0037HRM反应体系按照480HighResolutionMeltingMaster试剂盒中的 说明书进行， HRM分析是在480II荧光定量PCR仪上进行。 0038 10 L反应体系： 含有2ngL 1梨基因组DNA模板， 1MasterMix， 2.0mmolL 1MgCl2， 0.2mmolL 1本发明所述的引物； 扩增程序采用降落式PCR(touchdownPCR)： 95 预变性10min， 然后95变性10s、 6055(每循环下降0.5)退火15s、 72延伸12s的程。
29、 序进行45个循环。 0039 PCR循环结束后进行熔解， 其程序为： 951min， 401min， 651s， 再从65连续 升温至95， 每升高0.04， 收集荧光1次， 最后降温至40。 说明书 4/5 页 6 CN 104032021 B 6 0040最后， 在480II的GeneScanning软件中1.5version自动生成扩增产物 的熔解曲线 0041 利用g)步骤中得到的SNP标记引物对 八月红 砀山酥梨 的26个杂交后代群体 进行HRM分析(图2)。 0042 线型1红色曲线， 19个体线型相似， 全部19个体为种子数量多(8)； 0043 线型2蓝色曲线， 7个体线型相。
30、似， 其中5个体为种子数量少( 8)。 0044 统计分析表明， 26个个体分型为两种基因型， 分离比例为19： 7。 根据QTL位点 qSeeds上多态性表达种子数量差异基因分型结果将26个个体的种子数量表型数据进行卡 方检验(P0.00004)， 测验结果显示种子数量多少与基因型有关， 且两组的符合率分别为 100和71。 因此， 通过对种子数量性状的表型测定结果与HRM分型结果的比较分析， 证明 该特异SNP标记可检测QTL位点qSeeds上的多态性表达种子数量的差异， 对梨果实种子数量 良好分型。 说明书 5/5 页 7 CN 104032021 B 7 0001 序列表 1/1 页 8 CN 104032021 B 8 图1 说明书附图 1/2 页 9 CN 104032021 B 9 图2 说明书附图 2/2 页 10 CN 104032021 B 10 。