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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610483993.1 (22)申请日 2016.06.28 (71)申请人 郭舒洋 地址 213164 江苏省常州市钟楼区白云东 苑6幢甲单元401室 (72)发明人 郭舒洋薛培龙许博伟 (51)Int.Cl. C12N 9/42(2006.01) (54)发明名称 一种低温纤维素酶的制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种低温纤维素酶的制备方法， 属于生物技术领域。 本发明用蜗牛的消化道作为 原材料， 对其进行冰冻处理， 再切片和捣碎， 制备 得消化道匀浆， 将其与制备的。
2、糊状发酵淀粉浆料 与乙醇混合后， 利用糊状发酵淀粉作为保护剂保 护消化道匀浆中的纤维素酶不被蛋白酶水解， 同 时再加入壳聚糖， 使得溶解的纤维素酶沉淀， 对 其离心分离， 并将沉淀物利用丙酮进行脱脂提 纯， 最后对其进行冷冻干燥， 即可制备低温纤维 素酶。 本发明制备本发明制备的低温纤维素酶在 1530， 可保持较高的酶活性和酶催化效率， 酶活性大于9550IU/g以上， 酶催化效率提高17 25。 权利要求书1页 说明书4页 CN 106119227 A 2016.11.16 CN 106119227 A 1.一种低温纤维素酶的制备方法， 其特征在于具体制备步骤为： （1） 依次称取1002。
3、00g玉米淀粉和35g酵母粉， 加入盛有3050mL去离子水的密闭 反应釜中， 升温至4050， 启动搅拌器， 以400600r/min转速搅拌反应13h， 得糊状发 酵淀粉浆料， 备用； （2） 称取300500g活蜗牛， 经人工除杂后， 用去离子水洗涤35次， 再将其转入培养皿 中， 停止供食23天后， 人工敲碎并除去其外壳， 随后顺消化道剪开体壁， 剥离出消化道， 用 聚乙烯塑料包装袋密封包装， 并立即转入-20-18冰箱中冰冻处理24h； （3） 用切片机将上述冰冻处理后的消化道切成厚为1.01.2cm薄片， 随后转入高速组 织捣碎机中， 以10001500r/min转速捣碎处理102。
4、0min， 得消化道匀浆， 再将其转入密闭 容器中， 启动搅拌器， 设定转速为300500r/min， 在搅拌作用下， 将2030g步骤 （1） 备用糊 状发酵淀粉浆料和6080mL质量浓度为3040%乙醇溶液加入至密闭容器中， 继续搅拌反 应3060min； （4） 待搅拌结束后， 过滤除去滤渣， 并将所得滤液移至烧杯中， 并将烧杯置于磁力搅拌 器上， 设定转速为200400r/min， 在搅拌状态下， 加入1020g壳聚糖， 继续搅拌反应10 20min后， 进行离心分离， 除去上清液， 将沉淀物转入盛有1020mL丙酮的烧杯中， 用玻璃棒 搅拌510min， 过滤除去滤液， 得沉淀湿料；。
5、 （5） 将上述所得沉淀湿料转入-20-18冰箱中冰冻处理35h， 再将其转入3040 真空干燥箱中， 干燥处理1012h， 即得低温纤维素酶。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106119227 A 2 一种低温纤维素酶的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种低温纤维素酶的制备方法， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 纤维素酶是指能降解纤维素生成纤维二糖和葡萄糖等小分子物质的一组酶的总 称， 是一种复合的诱导酶， 包括多种水解酶(张启先， 微生物学报， 1974)。 纤维素酶作为生物 制剂， 已经广泛应用于饲料、 食品加工， 中草药提取， 原油开采， 造纸及纺织、 印染等行业中。
6、。 但目前使用的纤维素酶主要为中温纤维素酶。 低温纤维素酶与高温、 中温纤维素酶相比具 有很大的应用优势， 因为低温酶在低温下具有高酶活力及高催化效率， 可大大缩短处理过 程的时间并省却昂贵的加热或冷却费用； 在节能方面有相当大的优势； 经过温和的热处理 即可使低温酶的活力丧失， 而低温或适温处理不会影响产品的品质， 这将有助于低温纤维 素酶的推广和使用。 0003 目前纤维素酶生产的方法主要有固态发酵法和液态发酵法， 固态发酵法是以玉米 等农作物秸杆为主要原料， 通过接种微生物来进行发酵生产， 发酵设备简单， 投资少， 产品 价格低廉， 而液态发酵法具有生产稳定性高， 技术易于掌握， 但是这。
7、两种方法生产出来的纤 维素酶通常在50左右的条件下具有较高的催化效率和高酶活力， 但是将其用于纺织等领 域， 则需要在低温度水平下仍然具有较高的活性能力。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题： 针对以发酵法生产出来的纤维素酶在低于50条件 下， 不具有较高的酶活性和较高的催化效率， 影响产品的质量的问题， 提供了一种用蜗牛的 消化道作为原材料， 对其进行冰冻处理， 再切片和捣碎， 制备得消化道匀浆， 将其与制备的 糊状发酵淀粉浆料与乙醇混合后， 利用糊状发酵淀粉作为保护剂保护消化道匀浆中的纤维 素酶不被蛋白酶水解， 同时再加入壳聚糖， 使得溶解的纤维素酶沉淀， 对其离心分离， 并将 。
8、沉淀物利用丙酮进行脱脂提纯， 最后对其进行冷冻干燥， 即可制备低温纤维素酶的方法。 本 发明制备的低温纤维素酶在1530， 可保持较高的酶活性和酶催化效率。 0005 为解决上述技术问题， 本发明采用如下所述的技术方案是： （1） 依次称取100200g玉米淀粉和35g酵母粉， 加入盛有3050mL去离子水的密闭 反应釜中， 升温至4050， 启动搅拌器， 以400600r/min转速搅拌反应13h， 得糊状发 酵淀粉浆料， 备用； （2） 称取300500g活蜗牛， 经人工除杂后， 用去离子水洗涤35次， 再将其转入培养皿 中， 停止供食23天后， 人工敲碎并除去其外壳， 随后顺消化道剪开体。
9、壁， 剥离出消化道， 用 聚乙烯塑料包装袋密封包装， 并立即转入-20-18冰箱中冰冻处理24h； （3） 用切片机将上述冰冻处理后的消化道切成厚为1.01.2cm薄片， 随后转入高速组 织捣碎机中， 以10001500r/min转速捣碎处理1020min， 得消化道匀浆， 再将其转入密闭 容器中， 启动搅拌器， 设定转速为300500r/min， 在搅拌作用下， 将2030g步骤 （1） 备用糊 说明书 1/4 页 3 CN 106119227 A 3 状发酵淀粉浆料和6080mL质量浓度为3040%乙醇溶液加入至密闭容器中， 继续搅拌反 应3060min； （4） 待搅拌结束后， 过滤除去。
10、滤渣， 并将所得滤液移至烧杯中， 并将烧杯置于磁力搅拌 器上， 设定转速为200400r/min， 在搅拌状态下， 加入1020g壳聚糖， 继续搅拌反应10 20min后， 进行离心分离， 除去上清液， 将沉淀物转入盛有1020mL丙酮的烧杯中， 用玻璃棒 搅拌510min， 过滤除去滤液， 得沉淀湿料； （5） 将上述所得沉淀湿料转入-20-18冰箱中冰冻处理35h， 再将其转入3040 真空干燥箱中， 干燥处理1012h， 即得低温纤维素酶。 0006 本发明的应用方法： 将本发明制备的低温纤维素酶与酒精酵母按质量比1:1进行 搅拌混合均匀后， 置于密封发酵罐中进行发酵处理， 控制发酵温度。
11、为2628， 发酵34天 后， 收集纤维素酶发酵液， 再按质量比3:1:4， 将粉碎的玉米秸秆粉末、 发酵液以及酒精酵母 混合， 进行发酵， 控制发酵温度为2628， 待发酵液中的乙醇浓度达到512， 即可生产 得到乙醇。 经检测， 该纤维素酶在2628时， 酶的活性较高， 酶活性大于9550IU/g， 同时具 有较高的催化作用， 大大减少了生产乙醇所需要的时间。 0007 本发明与其他方法相比， 有益技术效果是： （1） 本发明制备的低温纤维素酶在1530， 可保持较高的酶活性和酶催化效率， 酶活 性大于9550IU/g以上， 酶催化效率提高1725； （2） 本发明所采用的原材料成本低， 。
12、且制备步骤简单。 具体实施方式 0008 首先依次称取100200g玉米淀粉和35g酵母粉， 加入盛有3050mL去离子水的 密闭反应釜中， 升温至4050， 启动搅拌器， 以400600r/min转速搅拌反应13h， 得糊 状发酵淀粉浆料， 备用； 再称取300500g活蜗牛， 经人工除杂后， 用去离子水洗涤35次， 再将其转入培养皿中， 停止供食23天后， 人工敲碎并除去其外壳， 随后顺消化道剪开体 壁， 剥离出消化道， 用聚乙烯塑料包装袋密封包装， 并立即转入-20-18冰箱中冰冻处理 24h； 接着用切片机将上述冰冻处理后的消化道切成厚为1.01.2cm薄片， 随后转入高速 组织捣碎机。
13、中， 以10001500r/min转速捣碎处理1020min， 得消化道匀浆， 再将其转入密 闭容器中， 启动搅拌器， 设定转速为300500r/min， 在搅拌作用下， 将2030g糊状发酵淀 粉浆料和6080mL质量浓度为3040%乙醇溶液加入至密闭容器中， 继续搅拌反应30 60min； 待搅拌结束后， 过滤除去滤渣， 并将所得滤液移至烧杯中， 并将烧杯置于磁力搅拌器 上， 设定转速为200400r/min， 在搅拌状态下， 加入1020g壳聚糖， 继续搅拌反应10 20min后， 进行离心分离， 除去上清液， 将沉淀物转入盛有1020mL丙酮的烧杯中， 用玻璃棒 搅拌510min， 过。
14、滤除去滤液， 得沉淀湿料； 最后将上述所得沉淀湿料转入-20-18冰箱 中冰冻处理35h， 再将其转入3040真空干燥箱中， 干燥处理1012h， 即得低温纤维素 酶。 0009 实例1 首先依次称取200g玉米淀粉和5g酵母粉， 加入盛有50mL去离子水的密闭反应釜中， 升 温至50， 启动搅拌器， 以600r/min转速搅拌反应3h， 得糊状发酵淀粉浆料， 备用； 再称取 500g活蜗牛， 经人工除杂后， 用去离子水洗涤5次， 再将其转入培养皿中， 停止供食3天后， 人 说明书 2/4 页 4 CN 106119227 A 4 工敲碎并除去其外壳， 随后顺消化道剪开体壁， 剥离出消化道， 。
15、用聚乙烯塑料包装袋密封包 装， 并立即转入-18冰箱中冰冻处理4h； 接着用切片机将上述冰冻处理后的消化道切成厚 为1.2cm薄片， 随后转入高速组织捣碎机中， 以1500r/min转速捣碎处理20min， 得消化道匀 浆， 再将其转入密闭容器中， 启动搅拌器， 设定转速为500r/min， 在搅拌作用下， 将30g糊状 发酵淀粉浆料和80mL质量浓度为40%乙醇溶液加入至密闭容器中， 继续搅拌反应60min； 待 搅拌结束后， 过滤除去滤渣， 并将所得滤液移至烧杯中， 并将烧杯置于磁力搅拌器上， 设定 转速为400r/min， 在搅拌状态下， 加入20g壳聚糖， 继续搅拌反应20min后， 。
16、进行离心分离， 除 去上清液， 将沉淀物转入盛有20mL丙酮的烧杯中， 用玻璃棒搅拌10min， 过滤除去滤液， 得沉 淀湿料； 最后将上述所得沉淀湿料转入-18冰箱中冰冻处理5h， 再将其转入40真空干燥 箱中， 干燥处理12h， 即得低温纤维素酶。 0010 将本发明制备的低温纤维素酶与酒精酵母按质量比1:1进行搅拌混合均匀后， 置 于密封发酵罐中进行发酵处理， 控制发酵温度为28， 发酵4天后， 收集纤维素酶发酵液， 再 按质量比3:1:4， 将粉碎的玉米秸秆粉末、 发酵液以及酒精酵母混合， 进行发酵， 控制发酵温 度为28， 待发酵液中的乙醇浓度达到12， 即可生产得到乙醇。 经检测，。
17、 该纤维素酶在28 时， 酶的活性较高， 酶活性为9600IU/g， 同时具有较高的催化作用， 大大减少了生产乙醇 所需要的时间。 0011 实例2 首先依次称取100g玉米淀粉和3g酵母粉， 加入盛有30mL去离子水的密闭反应釜中， 升 温至40， 启动搅拌器， 以400r/min转速搅拌反应1h， 得糊状发酵淀粉浆料， 备用； 再称取 300g活蜗牛， 经人工除杂后， 用去离子水洗涤3次， 再将其转入培养皿中， 停止供食2天后， 人 工敲碎并除去其外壳， 随后顺消化道剪开体壁， 剥离出消化道， 用聚乙烯塑料包装袋密封包 装， 并立即转入-20冰箱中冰冻处理2h； 接着用切片机将上述冰冻处理。
18、后的消化道切成厚 为1.0cm薄片， 随后转入高速组织捣碎机中， 以1000r/min转速捣碎处理10min， 得消化道匀 浆， 再将其转入密闭容器中， 启动搅拌器， 设定转速为300r/min， 在搅拌作用下， 将20g糊状 发酵淀粉浆料和60mL质量浓度为30%乙醇溶液加入至密闭容器中， 继续搅拌反应30min； 待 搅拌结束后， 过滤除去滤渣， 并将所得滤液移至烧杯中， 并将烧杯置于磁力搅拌器上， 设定 转速为200r/min， 在搅拌状态下， 加入10g壳聚糖， 继续搅拌反应10min后， 进行离心分离， 除 去上清液， 将沉淀物转入盛有10mL丙酮的烧杯中， 用玻璃棒搅拌5min， 。
19、过滤除去滤液， 得沉 淀湿料； 最后将上述所得沉淀湿料转入-20冰箱中冰冻处理3h， 再将其转入30真空干燥 箱中， 干燥处理10h， 即得低温纤维素酶。 0012 将本发明制备的低温纤维素酶与酒精酵母按质量比1:1进行搅拌混合均匀后， 置 于密封发酵罐中进行发酵处理， 控制发酵温度为26， 发酵3天后， 收集纤维素酶发酵液， 再 按质量比3:1:4， 将粉碎的玉米秸秆粉末、 发酵液以及酒精酵母混合， 进行发酵， 控制发酵温 度为26， 待发酵液中的乙醇浓度达到5， 即可生产得到乙醇。 经检测， 该纤维素酶在26 时， 酶的活性较高， 酶活性为9555IU/g， 同时具有较高的催化作用， 大大。
20、减少了生产乙醇所 需要的时间。 0013 实例3 首先依次称取150g玉米淀粉和4g酵母粉， 加入盛有40mL去离子水的密闭反应釜中， 升 温至45， 启动搅拌器， 以500r/min转速搅拌反应2h， 得糊状发酵淀粉浆料， 备用； 再称取 说明书 3/4 页 5 CN 106119227 A 5 400g活蜗牛， 经人工除杂后， 用去离子水洗涤4次， 再将其转入培养皿中， 停止供食2天后， 人 工敲碎并除去其外壳， 随后顺消化道剪开体壁， 剥离出消化道， 用聚乙烯塑料包装袋密封包 装， 并立即转入-19冰箱中冰冻处理3h； 接着用切片机将上述冰冻处理后的消化道切成厚 为1.1cm薄片， 随后。
21、转入高速组织捣碎机中， 以1200r/min转速捣碎处理15min， 得消化道匀 浆， 再将其转入密闭容器中， 启动搅拌器， 设定转速为400r/min， 在搅拌作用下， 将25g糊状 发酵淀粉浆料和70mL质量浓度为35%乙醇溶液加入至密闭容器中， 继续搅拌反应50min； 待 搅拌结束后， 过滤除去滤渣， 并将所得滤液移至烧杯中， 并将烧杯置于磁力搅拌器上， 设定 转速为300r/min， 在搅拌状态下， 加入15g壳聚糖， 继续搅拌反应15min后， 进行离心分离， 除 去上清液， 将沉淀物转入盛有15mL丙酮的烧杯中， 用玻璃棒搅拌7min， 过滤除去滤液， 得沉 淀湿料； 最后将上述。
22、所得沉淀湿料转入-19冰箱中冰冻处理4h， 再将其转入35真空干燥 箱中， 干燥处理11h， 即得低温纤维素酶。 0014 将本发明制备的低温纤维素酶与酒精酵母按质量比1:1进行搅拌混合均匀后， 置 于密封发酵罐中进行发酵处理， 控制发酵温度为27， 发酵4天后， 收集纤维素酶发酵液， 再 按质量比3:1:4， 将粉碎的玉米秸秆粉末、 发酵液以及酒精酵母混合， 进行发酵， 控制发酵温 度为27， 待发酵液中的乙醇浓度达到10， 即可生产得到乙醇。 经检测， 该纤维素酶在27 时， 酶的活性较高， 酶活性为9750IU/g， 同时具有较高的催化作用， 大大减少了生产乙醇 所需要的时间。 说明书 4/4 页 6 CN 106119227 A 6 。