技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种快速灵敏的间日疟原虫检测方法。
背景技术
据WHO统计，全球107个国家和地区有疟疾的流行和传播，32亿人受疟疾威胁，每年有3亿-5亿人发病，死亡人数达100多万。疟疾是我国重点防治的五大寄生虫之一。疟疾(malaria)是由疟原虫感染引起的危害严重的寄生虫病。感染人类的疟原虫有4种：恶性疟原虫(Plasmodium falciparum,P.f)、间日疟原虫(Plasmodium vivax,P.v)、三日疟原虫(Plasmodium malariae,P.m)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale,P.o)。
在我国引起疟疾病的病原体主要是间日疟和恶性疟原虫。因此，有效的检测疟原虫是医学诊断和疟疾防治必不可少的手段。
目前镜检法仍然是“三热”病人监测和疟疾临床病例诊断的主要手段。随着疟疾发病率的下降及原虫耐药性的产生,感染人群外周血原虫密度较低且疟原虫形态不典型的情况变得较为普遍,采用传统的厚血膜镜检费时费力,检测效率低下。寻求灵敏特异、简便快速的疟疾诊断方法在当前疟疾的防治工作中显得非常重要。近年来分子核酸检测技术在疟疾诊断中得到应用,并显示了良好的发展前景。
以PCR技术为代表的分子生物学手段是现在广泛应用于疟原虫快速检测的技术。而由PCR技术发展起来的实时荧光PCR技术以及基因芯片技术等是目前在疟原虫检测中使用最广泛的分子生物学方法。实时荧光PCR技术是一种新的PCR方法，是在常规PCR反应的基础上增加了能与扩增模板特异性结合的探针，与传统PCR相比，该方法无需对PCR产物进行再处理，完全是在封闭状态下完成检测的全过程，具有实时、准确、快速等特点，但是由于对设备要求较高，对工作人员的操作技术难度大，所以不适合快速，准确的检测。
基因芯片是20世纪90年代发展起来的全新的微量分析技术，它采用微加工和微电子技术将大量的人工设计好的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上而得到的一种信息检测芯片。基因芯片可以同时固定大量的探针分子，理论上可以在一次实验中检出所有潜在的致病原，也可以用同一张芯片检测某一致病原的各种遗传学指标，这为平行检测多个菌种或同菌种内多个菌株提供了一条便捷的途径；同时检测的灵敏度、特异性和快速便捷性也很高，因而在致病原分析检测中有很好的发展前景。
基因芯片技术利用待检测样品的基因组序列设计针对各种微生物的特异探针，将该探针(寡核苷酸)点样于芯片表面，同时在探针两侧设计PCR引物，在引物合成过程中对其5’端进行荧光标记或在PCR过程中加入荧光标记的dNTP，这样利用PCR扩增的方法即可得到标记有荧光染料的待检测靶标，然后用含有待检测样品特异探针的微阵列芯片与标记的靶标杂交，荧光标记的DNA分子与芯片上相匹配的DNA序列发生杂交反应，使得芯片上的点呈现出荧光信号，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定疟原虫。
当前用于疟原虫检测的基因芯片检测已经有些应用于研究，但是这些基因芯片的探针点样多采用手工模式，操作复杂，并且增加了很多假阳性的机会。
本发明整合了聚合酶链式反应(PCR)和微阵列这两种强大的分子生物学技术，把PCR杂交的探针直接固定在微阵列中的杂交舱中，与PCR反应室在同一张芯片上。PCR反应结束后可以直接加入杂交液进行杂交，操作简单，节省时间，另外灵敏度可以达到几十个Copy的DNA分子。
本发明的检测方法可运用于间日疟原虫快速灵敏的检测，作为血清学试验及镜检法的可靠补充，提高检测的准确性和时效性，可大大地降低检测的周期。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏间日疟原虫的检测方法，本发明能对间日疟原虫基因进行快速灵敏的检测，通过本发明可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止疫情的发生和国外疟疾的传入。
本发明针对间日疟原虫特有基因，设计引物，在引物扩增区内设计能够区别其他疟原虫及亲缘关系较近的物种的特异性探针，通过探针特异性验证、探针灵敏度实验、方法特异性实验等证明该方法可以特异检测间日疟原虫，与常规PCR方法比较，检测灵敏度明显高于常规方法多重PCR扩增产物的检测最低检出限，不仅可以满足日常疫情安全检测的要求，甚至可以满足临床样品的检测要求。
本发明所提供的快速、灵敏的间日疟原虫检测方法，包括如下步骤：
(1)血液样本DNA液提取；
(2)PCR扩增：
a.PCR反应体系包括：PCR反应缓冲液,待测基因特异性正、反向引物，PCR Grade H2O,PCR Control,DNA提取液；
b.将PCR反应液加入已含有待测基因特异性探针的芯片内，将芯片放入反应室内进行扩增反应；特异性探针是根据特异性引物扩增区内设计，能够区别其他物种；特异性探针点入芯片上；。
(3)杂交：PCR扩增完后，将杂交反应液加入芯片，使杂交液和扩增液都进入到杂交舱内杂交反应；
(4)清洗：杂交后的芯片用洗液冲洗，直接用荧光扫描仪检测；
(5)结果判读。
步骤(1)中所述的DNA提取可使用血液样本基因组DNA提取试剂盒提取DNA。取50uL全血样本，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取DNA；
步骤(2)中所述的特异性引物和探针分别为：
SSUrRNA基因
Pv1-F:AGTTCGTGAATATGATTTGTC (SEQ ID NO 1)
Pv1-R:CTGCGCTTCTGTACTTGGC (SEQ ID NO 2)
Probe:GGGGATTGCAATTATACTTCGTGTCG (SEQ ID NO 3)
csp基因
Vp2-F:GGTGAGAACCCAGATGACGAGG (SEQ ID NO 4)
Vp2-R:TGGACTCCATGCAGTGTAACCTGT (SEQ ID NO 5)
Probe：GGTGATGGAGCAGCTGTACAG (SEQ ID NO 6)
18SrRNA基因
Lm2-F：GCAACGCTTCTAGCTTAATCCAC (SEQ ID NO 7)
Lm2-R：CAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCC (SEQ ID NO 8)
Probe：ACTTTGTGCGCATTTTGCTA (SEQ ID NO 9)
步骤(2)中所述的PCR反应体系为：2X Mater mix 12.5ul,PrimerD 2.5ul，PCR Grade H2O 4ul,PCR Control 1ul,Sample 5ul；
步骤(2)所述的PCR扩增的反应条件是：95℃预变性15min；95℃变性15s，60℃退火40s，72℃延伸30s，45个循环，72℃延伸1min。
步骤(3)所述的杂交反应条件是：注入的杂交液为14.5ul，反应时间为30min。杂交后的芯片用洗液3000rpm 2min冲洗，直接用荧光扫描仪检测。
步骤(2)所述的PCR扩增与步骤(3)所述的杂交在芯片仪上完成。
本发明与现有检测方法相比，将DNA杂交检测的扩增过程和杂交检测过程浓缩到一张芯片上检测，大大缩减了检测的时间和复杂性，检测设备简单易于携带。检测系统可以定量检测低达78copy DNA的疟原虫，大大提高了当前的检测能力。而从样品采集到检测总时间完全可以在3小时内完成，有益于快速准确的检测间日疟原虫。
附图说明
图1实施例1间日疟原虫镜检阳性结果。
图2实施例1间日疟原虫芯片检测特异性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1间日疟原虫的检测的特异性与灵敏性
一、实验步骤
1.血液样本的采集
取口岸检测病人的全血样本1.0ml。
2.血液样本的初步鉴定
采用胶体金法初步确定该病人是否感染间日疟原虫。
3.基因组DNA的提取
使用血液样本基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，Qiagen公司)提取间日疟DNA。取50uL全血样本，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取DNA。
4.DNA浓度的测定
使用ABI的实时荧光检测仪通过实时定量PCR的方法定量疟原虫DNA浓度。
5.靶基因的扩增
5.1引物和探针的设计
针对间日疟原虫特有基因，设计引物，在引物扩增区内设计能够区别其他菌株的特异性探针。本实施例针对间日疟原虫特有基因SSUrRNA基因、csp基因、18sRNA基因设计了三对引物和探针，分别是：
SSUrRNA基因
Pv1-F:AGTTCGTGAATATGATTTGTC (SEQ ID NO 1)
Pv1-R:CTGCGCTTCTGTACTTGGC (SEQ ID NO 2)
Probe:GGGGATTGCAATTATACTTCGTGTCG (SEQ ID NO 3)
csp基因
Vp2-F:GGTGAGAACCCAGATGACGAGG (SEQ ID NO 4)
Vp2-R:TGGACTCCATGCAGTGTAACCTGT (SEQ ID NO 5)
Probe：GGTGATGGAGCAGCTGTACAG (SEQ ID NO 6)
18SrRNA基因
Lm2-F：GCAACGCTTCTAGCTTAATCCAC (SEQ ID NO 7)
Lm2-R：CAAGCCGAAGCAAAGAAAGTCC (SEQ ID NO 8)
Probe：ACTTTGTGCGCATTTTGCTA (SEQ ID NO 9)
特异性探针点入芯片上。
5.2反应平台
在威特芯片仪上进行PCR扩增与杂交反应。为防止引物间的互相作用，分两个反应室进行PCR反应，两个反应室都可以联通到杂交室，PCR后的扩增液可以通过注射压力方式使其流入杂交室进行杂交反应。
PCR反应体系为：2X Mater mix 12.5ul,PrimerD 2.5ul，PCR Grade H2O 4ul,PCR Control 1ul,Sample 5ul.
反应条件相同：95℃预变性15min；95℃变性15s，60℃退火40s，72℃延伸30s，45个循环，72℃延伸1min。
6.杂交反应
分别注入PCR反应室14.5ul杂交夜，使杂交夜和扩增液都进入到杂交舱内，反应30min。杂交后的芯片用washing buffer 3000rpm 2min冲洗，直接用威特荧光扫描仪检测。
7.检测体系的灵敏度与特异性
镜检法确定样本的阳性：
体系灵敏度检测：将DNA提取液稀释成10-1、10-2、10-3、10-4，以每种稀释液为模板，通过Real-time PCR的方法，判断DNA的浓度。根据DNA浓度将各个菌的DNA稀释到大约10，100，1000copy/ul。取各个梯度DNA作为模板加入到芯片中进行检测。
8.现场样品特异性检测
在云南疟疾疫区，取经过镜检确认为恶性疟原虫的样本10份，间日疟样本10份，疟原虫阴性样本10份，提取DNA，进行芯片测定。
二、结果
1.镜检结果显示阳性结果，见图1
2.芯片的检测能力
用口岸检测到的间日疟阳性样品进行了芯片实验，结果见图2。
图2显示，通过芯片实验，在芯片的相应位置会出现明显的阳性信号。阳性样本位置出现明显的杂交信号，阴性样本不出现杂交信号。这表明芯片的检测性能良好。
3.芯片的灵敏性
通过real-time PCR的方法确定DNA模板浓度为：
不同浓度DNA样品芯片检测表明，该芯片检测下限为78copyDNA分子。
表1实时定量荧光PCR检测模板稀释后芯片检测
疟原虫SSUrDNA 定量(copies/ul) 101稀释 102稀释 103稀释 104稀释 间日疟(Pv) 7.8*103 + + + -
4.样品特异性试验：
对云南现场样品芯片检测结果，显示30份样本，20份均无检测信号，间日疟阳性样本检测到10份，且样本号与镜检结果相符。