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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201010567613.5 (22)申请日 2010.12.01 (83)生物保藏信息 CCTCC NO: M 2010318 2010.11.25 (73)专利权人 张洁 地址 201208 上海市浦东新区俱进路285弄 幸福小镇140号502室 (72)发明人 张洁 (51)Int.Cl. C12N 15/09(2006.01) C12N 15/61(2006.01) C12N 9/90(2006.01) C12Q 1/533(2006.01) (56)对比文件 CN 1010。
2、67118 A,2007.11.07, 登录号.NP_000909. NCBI,Genbank .2010, Xiangdong Huo等.Co-expression of human protein disulfide isomerase (hPDI) enhances secretion of bovine follicle- stimulating hormone (bFSH) in Pichia pastoris. Protein Expression& Purification .2007,第54卷234-239. 审查员 高巍 (54)发明名称 用毕赤酵母分泌表达重组人蛋白质二硫键。
3、 异构酶 (57)摘要 用毕赤酵母分泌表达重组人蛋白二硫键异 构酶本发明属生物技术领域， 具体涉及一种重组 人蛋白 质二硫键异构酶( humanprotein disulphideisomerase， hPDI491)及其制备方法 和应用。 本发明应用RT-PCR方法， 扩增得到人蛋 白质二硫键异构酶(humanproteindisulphide isomerase， hPDI491)cDNA， 与甲醇酵母(Pichia pastoris)表达载体pPICZ 重组， 获得表达质粒 pPICZa-hPDI， 转化毕赤酵母菌X33， 筛选出高效 表达工程菌株。 实现在甲醇酵母中以分泌形式大 量表达。
4、重组人蛋白质二硫键异构酶。 工程菌经发 酵、 诱导表达， 分离纯化后， 纯度90以上。 实验 证明本发明产物具有在体外促进其它蛋白质正 确折叠的作用。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图5页 CN 102485890 B 2016.08.17 CN 102485890 B 1.一种制备有助于蛋白质折叠的分子伴侣， 即重组人蛋白质二硫键异构酶的方法， 所 述重组人蛋白质二硫键异构酶的氨基酸序列是SEQIDNO： 2， 其特征在于采取下列步骤： (1)以人蛋白质二硫键异构酶基因为模板， 用RT-PCR的方法克隆hPDI491cDNA基因， 所 述hPDI491cDNA基因编码如SEQID。
5、NO： 2所示的氨基酸序列； (2)hPDI491cDNA基因与表达载体重组； (3)用上述重组表达载体转化宿主细胞， 使hPDI491cDNA基因与宿主染色体发生重组； (4)培养宿主细胞， 从培养液中回收和纯化产物； (5)生物学方法鉴定重组人蛋白质二硫键异构酶； 所述表达载体为pPICZ ； 所述宿主细胞为甲醇营养型毕赤酵母细胞。 2.根据权利要求1所述的方法， 所述重组人蛋白质二硫键异构酶的整个分子是一条含 有491个氨基酸的多肽链， 其N-端前8个氨基酸残基是DAPEEEDH-， C-端末尾6个氨基酸残基 是-AVHDEL， 其氨基酸序列是SEQIDNO： 2。 3.根据权利要求1所。
6、述的方法， 其中所述的宿主细胞为甲醇营养型毕赤酵母菌株X33。 4.根据权利要求1所述的方法， 其中培养宿主细胞采用发酵方法。 5.根据权利要求1所述的方法， 其中重组人蛋白质二硫键异构酶通过宿主细胞发酵后 离心收集上清， 并依次经过阳离子层析、 阴离子层析、 超滤脱盐、 疏水层析的方法纯化所得。 6.根据权利要求1所述的方法， 其中被分子伴侣折叠的蛋白质不局限于任何特定的蛋 白， 只要它能够在重组人蛋白质二硫键异构酶的辅助下进行正确的折叠。 权利要求书 1/1 页 2 CN 102485890 B 2 用毕赤酵母分泌表达重组人蛋白质二硫键异构酶 技术领域 0001 本发明属生物技术领域， 具。
7、体涉及一种重组人蛋白质二硫键异构酶(human proteindisulphideisomerase， hPDI491)工程菌株的构建， 发酵， 表达产物的纯化等制备方 法和应用。 背景技术 0002 在用基因工程研发和生产蛋白类药物的过程中， 常常会遇见包涵体(Inclusion Bodies， IB)问题， 即大量被工程菌表达的外源蛋白致密地集聚， 形成水不溶性的结构。 包涵 体中的蛋白质是没有生物活性的， 需要经过重新折叠才能成为有活性的蛋白质。 包涵体的 形成很重要一个原因就是重组蛋白中的含硫氨基酸较多， 无法进行正确折叠。 然而二硫键 对蛋白质的三维结构的稳定性又起着十分重要的作用，。
8、 据查， 近三分之一的人源蛋白质含 有二硫键， 而人源蛋白质又是基因工程药物的重要来源， 因此， 蛋白质折叠一直是生物学研 究热点之一。 新合成的多肽链并没有生物活性， 必须经过一系列的折叠、 重折叠和组装等过 程才能形成有活性的功能蛋白质。 多数蛋白在体内的折叠无法自发的完成， 需要依靠其它 蛋白因子或折叠酶的辅助作用， 这类蛋白因子或折叠酶被称作分子伴侣(foldaseand chaperone)。 同样在体外， 折叠酶和分子伴侣也能提高变性蛋白质的复性率。 蛋白质二硫键 异构酶(proteindisulfideisomerase， PDI)是折叠酶中的一种， 它的家族成员广泛存在 于哺乳。
9、动物中， 它们常见于细胞内质网， 主要职能是催化内质网中新生肽链的二硫键的形 成、 异构及还原， 进而帮助肽链正确折叠成有活性三级结构。 它是目前发现帮助蛋白质折叠 活性最高的折叠酶。 另外在内质网相关的蛋白质降解途径ERAD蛋白质转运、 钙稳态、 抗原提 呈及病毒入侵等方面它们也起重要作用。 (ELLGAARDL， RUDDOCKLW.EMBORep， 2005， 6： 28- 32.) 0003 基于蛋白质二硫键异构酶家族的重要作用， 国内外各种来源于哺乳动物中的蛋白 质二硫键异构酶被陆续发现(Huangjin， etal.JBioMedEng， 2002； 19(3)： 459-462.。
10、)。 作 为分子伴侣， 相比于家族众多其它成员来说， 来源于人的蛋白质二硫键异构酶显得更加重 要， 它显然更适合于辅助同样来源于人体的大分子蛋白类药物的正确折叠， 更有利于解决 用基因工程研究和生产蛋白类药物的过程中经常出现的包涵体问题， 使后者能够减少因包 涵体造成的生产损失， 大幅提高生产效率。 0004 目前， 国内外尚无报道用基因克隆的方式， 借助甲醇酵母工程菌生产人源蛋白质 二硫键异构酶(humanproteindisulphideisomerase， hPDI491)的相关报道。 本发明描述了 利用甲醇酵母表达系统(Pichiapastoris)， 以分泌表达的方式， 成功地大量表。
11、达了完整的 人源二硫键异构酶蛋白， 并通过活性检测证实了该重组蛋白能够在一定的体外环境， 辅助 粒单系集落刺激因子(GM-CSF)进行正确折叠， 显著减少了GM-CSF蛋白包涵体的形成。 因此， 本发明描述的重组人源蛋白质二硫键异构酶对包涵体蛋白的复性有辅助作用， 在工业生产 上具有一定的应用价值。 说明书 1/4 页 3 CN 102485890 B 3 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种制备重组人蛋白质二硫键异构酶(r-hPDI491)的方法， 其 中包括， 1)制备能表达、 具有生物活性的hPDI491cDNA基因； 2)与表达载体重组； 3)用所述载 体转染宿主细胞； 4)培养。
12、所述宿主细胞； 5)纯化hPDI491蛋白。 0006 本发明用基因工程方法对r-hPDI491进行生产， 所得产品具有高效的体外蛋白折叠 酶活性， 与已知的方法相比， 不仅活性更高， 表达量更高， 而且成本更低， 制备工艺简便、 安 全。 0007 本发明还提供r-hPDI491在体外辅助大分子蛋白的复性的应用。 0008 本发明从人肝脏cDNA文库中用PCR的方法克隆hPDI491cDNA基因。 所述hPDI491cDNA 基因序列如序列表SEQIDNO： 1所示。 获得的cDNA与质粒pPICZ 重组， DNA限制性内切酶酶 切鉴定筛选阳性克隆， 核苷酸序列分析验证cDNA基因。 本发明。
13、不限于特定的表达质粒。 在一 优选实施方案中， 本发明使用真核表达载体， 例如pPICZ 等。 0009 上述重组表达载体按常规方法导入适宜宿主细胞。 本发明不局限于任何特定的宿 主细胞， 只要它能够表达所述基因。 在一优选实施方案中， 本发明使用甲醇营养型毕赤酵母 菌株如X33等。 0010 本发明的表达产物分泌到胞外， 存在于宿主细胞培养液上清内。 离心去除宿主细 胞， 可从培养液上清分离和纯化所需产品。 所述表达产物重组人蛋白质二硫键异构酶(r- hPDI491)蛋白质氨基酸序列如序列表SEQIDNO： 2所示。 0011 本专利设及到的大肠杆菌已于2010年11月25日提交保藏。 保藏。
14、单位名称： 中国典 型培养物保藏中心； 保藏地址： 中国、 湖北省武汉市、 武汉大学； 菌种保藏号为： CCTCCM 2010318； 分类命名为： 大肠埃希氏菌K-12/pPICZalpha-hPDI(s-)B6； EscherichiacoliK- 12/pPICZalpha-hPDI(s-)B6。 0012 本发明上述技术方法中分子生物学操作均参照 分子克隆实验指南 (第三版， 科 学出版社， 2002)。 附图说明 0013 图1： 上游质粒构建过程图示 0014 图2： 上游质粒的酶切鉴定(筛选) 0015 电泳结果上看， 质粒1号和6号被切下了一条500bp， 一条900bp左右的。
15、条带， 与实验 预期相符， 是阳性克隆。 0016 图3： 测序结果1 0017 构建的重组质粒pPICZ -hPDI， 用5 AOX引物的测序结果。 0018 图4： 测序结果2 0019 构建的重组质粒pPICZ -hPDI， 用3 AOX引物的测序结果。 0020 结果显示插入基因是hPDI全长基因， 序列正确， 插入位点是载体上alphafactor 后面的XhoI和载体多克隆位点上的NotI位点。 0021 图5： 蛋白纯化结果 0022 纯化的hPDI蛋白走15SDS-PAGE非还原电泳， 图片显示， 在4566KDa之间有明 说明书 2/4 页 4 CN 102485890 B 。
16、4 显的目的条带， 纯度较高。 具体实施方式 0023 实施例1： 设计、 构建重组质粒， 制备r-hPDI491蛋白 0024 (1)克隆hPDI491cDNA基因， 构建表达质粒pPICZ -hPDI491 0025 按照hPDI491基因序列， 设计引物序列。 用PCR方法， 从人肝脏cDNA文库中扩增目的 基因。 扩增产物从限制性内切酶位点切出， 与毕赤酵母表达质粒pPICZ 重组， 构建表达质粒 pPICZ -hpDI491， 转化NovaBlue宿主菌。 抽提质粒， 再通过相应的限制性内切酶位点酶切分 析， 以特征片段筛选质粒， 然后用核苷酸序列分析， 证实基因重组的位置以及序列正。
17、确， 获 得阳性克隆。 0026 本发明所采用的限制性内切酶购自Takara公司， 甲醇营养型毕赤酵母菌株X33、 毕 赤酵母多拷贝表达载体pPICZ 购自Invitrogen公司 0027 (2)筛选高拷贝表达菌株 0028 重组的甲醇酵母表达质粒pPICZ -hPDI491用SacI线性化后， 电穿孔转化法毕赤酵 母菌株X33， 使其与酵母染色体发生重组， Zeocin抗性筛选高表达菌株。 0029 挑取上述阳性单克隆， 接种至BMGY培养基， 其中含1酵母提取物， 2蛋白胨， 100mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)， 1.34YNB， (410-5)生物素和1甘油， 30培养至菌体光 密度。
18、OD600nm达到26时， 离心去除培养液， 将菌体沉淀用甲醇复合型培养基BMMY稀释至 OD600nm到1， 培养基BMMY含有1酵母提取物， 2蛋白胨， 100mM磷酸缓冲液(pH6.0)， 1.34 YNB， (410-5)生物素， 0.5甲醇。 30诱导培养72小时， 每12小时取样并补加甲醇维持 其浓度0.5， 保留培养液上清， 用上清做15SDS-PAGE非还原电泳， 考马斯亮蓝R-250染色 后， 扫描定纯度， 分子量。 结果显示， 甲醇诱导后， 上清液在相应的分子量位置有浓集的条 带。 经扫描大致确定目的蛋白占上清液菌体表达总蛋白的50以上。 选择表达量高的菌株 为工程菌株。 。
19、0030 (3)工程菌株的发酵表达 0031 取上述高表达的工程菌株种子， 接种至BMGY培养基中， 30摇菌培养， 至菌液 OD600nm达到26时， 按120的接种比例接种到9L发酵罐， 用全盐培养基进行高密度发酵。 所 述全盐培养基需用氨水调初始pH值到6.0。 待培养基中甘油耗尽后， 继续流加甘油， 并维持 溶氧不低于20。 0032 待菌密度达到要求后， 维持培养基pH为6.0， 暂停碳源补给约30分钟后， 流加甲醇 进行诱导表达， 甲醇补料速度从1mL/L/h逐渐升高至12mL/L/h， 维持此速度。 本发明发酵参 数为： 温度30， 氧容量控制在不低于20， pH6.0， 搅拌速。
20、度与氧容量连动。 0033 经过高密度培养和诱导， 结果表明hPDI491蛋白获得了高表达。 甲醇诱导45h后， 停 止发酵， 离心分离发酵液， 收集上清进行纯化。 经测试， 发酵工程菌的表达水平不低于70。 0034 (4)阳离子柱层析(CMSepharoseFastFlow) 0035 用50mMHAc-NaAc(pH3.9)平衡柱子， 把含有目的蛋白的样液稀释到电导与平衡 缓冲液一致， 并调节pH至3.9， 开始上样， 上样结束后用平衡缓冲液冲洗6个柱体积， 再用 50mMHAc-NaAc(pH3.9)+D.5MNaCl洗脱， 收集2个柱体积。 0036 (5)超滤浓缩脱盐 说明书 3/。
21、4 页 5 CN 102485890 B 5 0037 用MilliporeNMWL10000的膜超滤， 用50mMTris-HCl(pH7.0)来更换缓冲体系。 0038 (6)阴离子柱层析(DEAESepharoseFastFlow) 0039 用50mMTris-HCl(pH7.0)平衡柱子， 把超滤液的电导和pH调节到与平衡缓冲液一 致， 开始上样， 上样结束后用平衡缓冲液冲洗6个柱体积， 再用50mMTris-HCl(pH7.0)+ 0.3MNaCl洗脱， 收集2个柱体积。 0040 (7)疏水柱层析(PhenylSepharoseFastFlow) 0041 用50mMTris-H。
22、Cl(pH7.0)+1.2MNaCl平衡柱子， 把DEAE洗脱液的电导和pH调节到 与平衡缓冲液一致， 开始上样， 上样结束后用平衡缓冲液冲洗6个柱体积， 再用50mMTris- HCl(pH7.0)+0.5MNaCl洗脱， 收集5个柱体积。 0042 (8)超滤浓缩脱盐 0043 Phenyl洗脱液用MilliporeNMWL10000的膜超滤除盐。 0044 (9)蛋白纯度鉴定及分子量测定 0045 取纯化样品进行15SDS-PAGE非还原和还原电泳， 考马斯亮蓝R-250染色后， 凝胶 成像仪扫描测定纯度， 所得产品纯度95以上， 分子量约为55.3KDa。 0046 实施例2： r-h。
23、PDI491蛋白生物活性测定 0047 r-hPDI491蛋白催化粒单系集落刺激因子(GM-CSF)折叠实验。 用尿素抽提的GM-CSF 包涵体蛋白经SephacrylS-200纯化后， 以1mg/mL的浓度加入TKM缓冲液中， 然后加入4mg/ mLr-hPDI491和105mol/LDTT， 25作用10h， 测定活性并以不加r-hPDI491作用的上述体系 中的GM-CSF活性作对照， 凝胶排阻HPLC检测分子状态。 在GM-CSF1mg/mL的浓度下用Cu2-氧 化复性， GM-CSF比活性为4.2106u/mg， 单体峰面积占62， r-hPDI491蛋白催化下， 可使比 活性提高到8.5106u/mg， 单体峰面积增加到92。 说明书 4/4 页 6 CN 102485890 B 6 0001 序列表 1/2 页 7 CN 102485890 B 7 0002 序列表 2/2 页 8 CN 102485890 B 8 图1 说明书附图 1/5 页 9 CN 102485890 B 9 图2 说明书附图 2/5 页 10 CN 102485890 B 10 图3 说明书附图 3/5 页 11 CN 102485890 B 11 图4 说明书附图 4/5 页 12 CN 102485890 B 12 图5 说明书附图 5/5 页 13 CN 102485890 B 13 。