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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810393842.6 (22)申请日 2018.04.27 (71)申请人 哈尔滨工业大学 地址 150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区西 大直街92号 申请人 哈药集团生物工程有限公司 (72)发明人 赵磊郭旭超盛涛任南琪 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 代理人 刘景祥 (51)Int.Cl. C12P 3/00(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种真菌预处理木质纤维素及直接微生物 转化发。
2、酵产氢的方法 (57)摘要 本发明公开了一种真菌预处理木质纤维素 及直接微生物转化发酵产氢的方法， 属于发酵工 程领域， 技术方案为： 一、 可食用真菌接种于待预 处理木质纤维素中进行预处理； 二、 干燥； 三、 配 置产氢菌的营养盐溶液， 加入干燥后的木质纤维 素， 组成培养基， 通入氮气， 接种产氢菌的种子 液， 发酵产氢。 本发明使用完全的生物方法完成 由木质纤维素到氢气的直接转化过程， 减少了木 质纤维素产氢过程中的能源消耗， 设备投入， 同 时在生物发酵产氢的过程中， 无需向培养基中投 加酵母粉及维生素液， 极大的降低了木质纤维素 发酵制氢成本。 本发明采用生物预处理木质纤维 素取得。
3、较好的效果， 木质素相对去除率达到 70.2， 产氢量达到94.5ml/g-预处理木质纤维 素。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 108531515 A 2018.09.14 CN 108531515 A 1.一种真菌预处理木质纤维素及直接微生物转化发酵产氢的方法， 其特征在于： 包括 以下步骤： 一、 预处理： 将可食用真菌接种于木质纤维素原料中进行预处理； 二、 干燥： 将步骤一中预处理后的木质纤维素烘干至恒重； 三、 发酵产氢： 配置产氢菌的营养盐溶液， 加入步骤二干燥后的预处理木质纤维素， 组 成微生物直接发酵产氢培养基， 向培养基中通入纯度为99.99的氮气半小时， 然后。
4、接种产 氢菌的种子液发酵产氢。 2.根据权利要求1所述方法， 其特征在于： 步骤一所述预处理条件为25-30、 有氧条 件， 预处理时间为10-20天。 3.根据权利要求2所述方法， 其特征在于： 步骤一中所述可食用真菌为逆型金钱菌 G.contrarius J2； 步骤一所述木质纤维素采用稻草， 麦秸， 或玉米秸秆中的一种或二种或 三种。 4.根据权利要求3所述方法， 其特征在于： 步骤一具体为： 木质纤维素风干， 粉碎， 过60 目筛， 所得粉末在105烘干至恒重； G.contrarius J2经平板PDA培养基活化， 于26下培 养一周； 将每5g木质纤维素粉末置于500mL三角瓶， 。
5、加入15mL无菌水(pH 7.0)， 每瓶接种 G.contrarius J2孢子静置培养； 可食用真菌接种采用孢子悬液， 浓度控制在约2106个孢 子/mL， 每瓶接种量为2107个孢子。 5.根据权利要求1所述方法， 其特征在于： 步骤二干燥温度为105。 6.根据权利要求1所述方法， 其特征在于： 步骤三所述干燥后的木质纤维素在培养基中 的含量为15-35g/L； 步骤三接种产氢菌种子液后的培养基初始pH为6.5； 发酵温度为60， 发酵过程中搅拌速度为150rpm/min， 发酵环境为厌氧， 发酵产氢时间为24-72h。 7.根据权利要求6所述方法， 其特征在于： 步骤三中所述产氢菌为。
6、热解糖厌氧芽孢杆菌 M18(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum M18)。 8.根据权利要求7所述方法， 其特征在于： 步骤三中所述产氢菌的营养盐溶液， 由氯化 铵、 氯化钠、 磷酸氢二钾、 半胱氨酸、 MgCl26H2O、 氯化钾、 微量金属元素贮液、 0.1(g/L)的 刃天青水溶液制备而成； 其中所述的微量金属元素贮液包括氯化亚铁1.5g/L， 氯化锌70mg/ L， 硼酸6mg/L， MnCl24H2O 0.1g/L， CuCl22H2O 2mg/L， CoCl26H2O 0.19g/L， NiCl26H2O 24mg/L， Na2M。
7、O4H2O 36mg/L， 钨酸钠15mg/L， Na2SeO45H2O 15mg/L； 营养盐溶液中包括氯 化铵1.0g/L、 氯化钠的1.0g/L、 磷酸氢二钾1.5g/L、 磷酸二氢钾0.5g/L、 半胱氨酸0.5g/L、 MgCl26H2O 0.5g/L、 氯化钾0.2g/L、 刃天青0.1(g/L)； 微量金属元素贮液体积占微生物 直接发酵产氢培养基总体积的千分之一、 0.1(g/L)的刃天青水溶液体积占微生物直接发 酵产氢培养基总体积的千分之一。 9.根据权利要求8所述方法， 其特征在于： 步骤三所述产氢菌种子液的接种量是微生物 直接发酵产氢培养基体积的4， 接种的产氢菌种子液取生。
8、长至对数期的液体悬浊液。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108531515 A 2 一种真菌预处理木质纤维素及直接微生物转化发酵产氢的 方法 技术领域 0001 本发明属于发酵工程领域， 涉及一种真菌预处理木质纤维素及直接发酵产氢的方 法。 背景技术 0002 随着全球人口和经济规模的不断增长， 国际社会对保障能源安全、 保护生态环境、 应对气候变化等问题日益重视， 开发清洁低碳、 安全高效的可再生能源已成为世界各国关 注的焦点。 氢气被视为最具发展潜力的清洁能源载体， 在交通领域、 通信基站和物料搬运领 域的应用都持续升温， 是人类的战略能源发展方向。 经济高效的氢气生产是氢能技术路线 。
9、选择的关键， 发酵法生物制氢技术以其较高的产氢速率兼具发酵过程节能环保的优点， 受 到广泛的关注。 为了使发酵法生物制氢更具经济竞争力， 寻求一种可再生且廉价的基质至 关重要。 木质纤维素生物质是地球上最丰富的可再生资源， 但只有极少数被有效利用， 绝大 部分作为废物弃置在环境中， 造成环境污染和资源浪费。 利用工农业生产的木质纤维废弃 物发酵制取氢气， 在降低氢气生产成本的同时能够使废弃物得到资源化， 该技术的研究开 发及推广应用， 必将带来显著的环境效益和社会效益。 0003 由木质纤维素到氢气采用直接微生物转化(Direct microbial conversion, DMC)， 又可称。
10、为联合生物加工工艺(Consolidate Biological Processing)， 将纤维素酶的 产生过程与糖化、 产氢发酵由同一微生物完成， 可最大程度地降低生产过程的能量消耗， 有 效地降低生产成本， 是目前木质纤维素发酵产氢过程中最为经济且受关注的目标。 木质纤 维素中纤维素由半纤维素和木质素包裹， 同时由于纤维素具有一定结晶度使其致密结构引 起的反应惰性， 都会影响其后续生物转化效率。 因此， 需要对原料进行预处理以去除部分或 全部木质素， 溶解半纤维素， 同时破坏纤维素的晶体结构， 从而促进酶与底物相互接触。 传 统的物理、 化学、 或物理-化学联合预处理方法通常有较高的仪器。
11、或设备要求， 在预处理过 程中需消耗大量能源的同时伴随着大量的纤维素和半纤维素损失， 产生对后续发酵有抑制 作用的糠醛类物质， 残余的化学品对环境造成极大污染。 同时直接微生物发酵过程中需要 向产氢培养基中添加有机氮源及维生素液， 极大的增加了木质纤维素发酵产氢成本。 发明内容： 0004 本发明为解决现有发酵产氢过程木质纤维素预处理能源需求高， 污染环境以及产 生发酵抑制物等问题， 应用一种可食用真菌预处理木质纤维素同时为后续直接微生物发酵 提供有机氮源及维生素的生物预处理木质纤维素及发酵产氢方法。 0005 本发明提供的真菌预处理木质纤维素及直接微生物转化发酵产氢的方法， 是按以 下步骤实。
12、现： 0006 一、 预处理： 将可食用真菌接种于待预处理木质纤维素中进行预处理； 0007 二、 干燥： 将步骤一中预处理后的木质纤维素烘干至恒重； 说明书 1/5 页 3 CN 108531515 A 3 0008 三、 发酵产氢： 配置产氢菌的营养盐溶液， 加入步骤二干燥后的木质纤维素， 组成 微生物直接发酵产氢培养基， 向培养基中通入纯度为99.99的氮气， 然后接种产氢菌的种 子液， 发酵产氢。 0009 优选的， 步骤一所述预处理条件为26-29、 有氧条件， 预处理时间为10-20天， 更 优选15天。 0010 优选的， 步骤一中所述可食用真菌为逆型金钱菌(G.contrari。
13、us J2)(在硕士学位 论文 纤维素乙醇生产中木质素生物预处理工艺研究 中公开)， 该株菌目前保藏在哈尔滨 工业大学环境生物技术实验室， 申请人可以提供20年向社会公众提供该菌的声明。 0011 优选的， 步骤一所述木质纤维素采用稻草， 麦秸， 或玉米秸秆中的一种或二种或三 种。 0012 优选的， 步骤一具体为： 木质纤维素风干， 粉碎， 过60目筛， 所得粉末在105烘干 至恒重。 G.contrarius J2经平板PDA培养基活化， 于26下培养一周。 采用每5g木质纤维素 粉末置于500mL三角瓶， 加入15mL无菌水(pH 7.0)， 每瓶接种G.contrarius J2孢子静。
14、置培 养。 可食用真菌接种采用孢子悬液， 浓度控制在约2106个孢子/ml， 每瓶接种量约为2107 个孢子。 0013 优选的， 步骤二干燥温度为105。 0014 优选的， 步骤三所述干燥后的木质纤维素在培养基中的含量为15-35g/L， 更优选 20g/L。 0015 优选的， 步骤三接种产氢菌种子液后的培养基初始pH为6.5； 发酵温度为60， 发 酵过程中搅拌速度为150rpm/min， 发酵环境为厌氧， 发酵产氢时间为24-72h， 更优选48h。 0016 优选的， 步骤三中所述产氢菌为热解糖厌氧芽孢杆菌M18 0017 (The rm oa na e ro ba c te ri。
15、 um the rm osa ccha roly ti c um M1 8) ， Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum M18在 Biotechnology for Biofuels 中刊登的名称为 “Single-step bioconversion of lignocellulose to hydrogen using novel moderately thermophilic bacteria” 的文章中公开， 该株菌目前保藏在哈尔滨工 业大学环境生物技术实验室， 申请人可以提供20年向社会公众提供该菌的声明。 0018 优选的， 步骤三。
16、中所述产氢菌的营养盐溶液， 由氯化铵、 氯化钠、 磷酸氢二钾、 半胱 氨酸、 MgCl26H2O、 氯化钾、 微量金属元素贮液、 0.1(g/L)的刃天青水溶液制备而成； 0019 其中所述的微量金属元素贮液包括氯化亚铁1.5g/L， 氯化锌70mg/L， 硼酸6mg/L， MnCl24H2O 0.1g/L， CuCl22H2O 2mg/L， CoCl26H2O 0.19g/L， NiCl26H2O24mg/L， Na2MO4H2O 36mg/L， 钨酸钠15mg/L， Na2SeO45H2O 15mg/L； 0020 营养盐溶液中包括氯化铵1.0g/L、 氯化钠的1.0g/L、 磷酸氢二钾1。
17、.5g/L、 磷酸二氢 钾0.5g/L、 半胱氨酸0.5g/L、 MgCl26H2O 0.5g/L、 氯化钾0.2g/L、 刃天青0.1(g/L)。 微量 金属元素贮液体积占微生物直接发酵产氢培养基总体积的千分之一、 0.1(g/L)的刃天青 水溶液体积占微生物直接发酵产氢培养基总体积的千分之一。 0021 产氢菌种子液的接种量是微生物直接发酵产氢培养基体积的4， 接种的产氢菌 种子液取生长至对数期的液体悬浊液。 0022 有益效果 0023 本发明使用完全的生物方法完成由木质纤维素到氢气的直接转化过程， 减少了木 说明书 2/5 页 4 CN 108531515 A 4 质纤维素产氢过程中的。
18、能源消耗， 设备投入， 同时在生物发酵产氢的过程中， 无需向培养基 中投加酵母粉及维生素液， 极大的降低了木质纤维素发酵制氢成本。 本发明采用生物预处 理木质纤维素取得较好的效果， 木质素相对去除率达到70.2， 产氢量达到94.5ml/g-预处 理木质纤维素。 附图说明 0024 图1： 可食用真菌降解木质纤维素扫描电镜图； (a)为未处理稻草秸秆扫描电镜图， (b)为可食用真菌处理15d后稻草秸秆扫描电镜图。 具体实施方式 0025 实施例中所述可食用真菌为逆型金钱菌(G.contrarius J2)(在硕士学位论文 纤 维素乙醇生产中木质素生物预处理工艺研究 中公开)。 所述产氢菌为热解。
19、糖厌氧芽孢杆菌 M18(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum M18)， Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum M18在 Biotechnology for Biofuels 中刊登的名称为 “Single- step bioconversion of lignocellulose to hydrogen using novel moderately thermophilic bacteria” 的文章中公开。 0026 实施例1配置产氢菌的营养盐溶液 0027 产氢菌的营养盐溶液由氯化铵、 氯。
20、化钠、 磷酸氢二钾、 半胱氨酸、 MgCl26H2O、 氯化 钾、 微量金属元素贮液、 0.1(g/L)的刃天青水溶液制备而成； 0028 其中所述的微量金属元素贮液包括氯化亚铁1.5g/L， 氯化锌70mg/L， 硼酸6mg/L， MnCl24H2O 0.1g/L， CuCl22H2O 2mg/L， CoCl26H2O 0.19g/L， NiCl26H2O24mg/L， Na2MO4H2O 36mg/L， 钨酸钠15mg/L， Na2SeO45H2O 15mg/L； 0029 营养盐溶液中包括氯化铵1.0g/L、 氯化钠的1.0g/L、 磷酸氢二钾1.5g/L、 磷酸二氢 钾0.5g/L、 。
21、半胱氨酸0.5g/L、 MgCl26H2O 0.5g/L、 氯化钾0.2g/L、 刃天青0.1(g/L)。 微量 金属元素贮液体积占微生物直接发酵产氢培养基总体积的千分之一、 0.1(g/L)的刃天青 水溶液体积占微生物直接发酵产氢培养基总体积的千分之一。 0030 实施例2真菌预处理木质纤维素及直接微生物转化发酵产氢 0031 一、 预处理： 将可食用真菌接种于待预处理木质纤维素中进行预处理； 0032 二、 干燥： 将步骤一中预处理后的木质纤维素105烘干至恒重； 0033 三、 发酵产氢： 配置产氢菌的营养盐溶液， 加入步骤二干燥后的木质纤维素， 组成 微生物直接发酵产氢培养基， 向培养。
22、基中通入纯度为99.99的氮气， 然后接种产氢菌的种 子液， 发酵产氢。 0034 步骤一所述木质纤维素采用麦秸。 0035 步骤一具体为： 木质纤维素风干， 粉碎， 过60目筛， 所得粉末在105烘干至恒重。 G.contrarius J2经平板PDA培养基活化， 于26下培养一周。 采用每5g木质纤维素粉末置 于500mL三角瓶， 加入15mL无菌水(pH 7.0)， 每瓶接种G.contrarius J2孢子静置于有氧条 件下， 26下培养10天。 可食用真菌接种采用孢子悬液， 浓度控制在约2106个孢子/ml， 每 瓶接种量约为2107个孢子。 0036 步骤三所述干燥后的木质纤维素在。
23、培养基中的含量为15g/L。 步骤三接种产氢菌 说明书 3/5 页 5 CN 108531515 A 5 种子液后的培养基初始pH为6.5； 发酵温度为60， 发酵过程中搅拌速度为150rpm/min， 发 酵环境为厌氧， 发酵产氢时间为24h。 步骤三所述氢菌种子液的接种量是微生物直接发酵产 氢培养基体积的4， 接种的产氢菌种子液取生长至对数期的液体悬浊液。 0037 步骤一预处理结果理想， 经计算木质素相对去除率达到57.6。 本实施例产氢量 达到81.3ml/g-预处理木质纤维素。 0038 实施例3真菌预处理木质纤维素及直接微生物转化发酵产氢 0039 一、 预处理： 将可食用真菌接种。
24、于待预处理木质纤维素中进行预处理； 0040 二、 干燥： 将步骤一中预处理后的木质纤维素105烘干至恒重； 0041 三、 发酵产氢： 配置产氢菌的营养盐溶液， 加入步骤二干燥后的木质纤维素， 组成 微生物直接发酵产氢培养基， 向培养基中通入纯度为99.99的氮气， 然后接种产氢菌的种 子液， 发酵产氢。 0042 步骤一所述木质纤维素为稻草。 0043 步骤一具体为： 木质纤维素风干， 粉碎， 过60目筛， 所得粉末在105烘干至恒重。 G.contrarius J2经平板PDA培养基活化， 于26下培养一周。 采用每5g木质纤维素粉末置 于500mL三角瓶， 加入15mL无菌水(pH 7。
25、.0)， 每瓶接种G.contrarius J2孢子静置于有氧条 件下， 27下培养15天。 可食用真菌接种采用孢子悬液， 浓度控制在约2106个孢子/ml， 每 瓶接种量约为2107个孢子。 0044 步骤三所述干燥后的木质纤维素在培养基中的含量为20g/L。 步骤三接种产氢菌 种子液后的培养基初始pH为6.5； 发酵温度为60， 发酵过程中搅拌速度为150rpm/min， 发 酵环境为厌氧， 发酵产氢时间为48h。 步骤三所述氢菌种子液的接种量是微生物直接发酵产 氢培养基体积的4， 接种的产氢菌种子液取生长至对数期的液体悬浊液。 0045 图1为本实施例可食用真菌降解木质纤维素扫描电镜图；。
26、 (a)为未处理稻草秸秆扫 描电镜图， (b)为可食用真菌处理15天后稻草秸秆扫描电镜图。 从图中可以看出， 预处理结 果理想， 经计算木质素相对去除率达到70.2。 本实施例产氢量达到94.5ml/g-预处理木质 纤维素。 0046 实施例4真菌预处理木质纤维素及直接微生物转化发酵产氢 0047 一、 预处理： 将可食用真菌接种于待预处理木质纤维素中进行预处理； 0048 二、 干燥： 将步骤一中预处理后的木质纤维素105烘干至恒重； 0049 三、 发酵： 配置产氢菌的营养盐溶液， 加入步骤二干燥后的木质纤维素， 组成微生 物直接发酵产氢培养基， 向培养基中通入纯度为99.99的氮气， 然。
27、后接种产氢菌的种子 液， 发酵产氢。 0050 步骤一所述木质纤维素采用玉米秸秆。 0051 步骤一具体为： 木质纤维素风干， 粉碎， 过60目筛， 所得粉末在105烘干至恒重。 G.contrarius J2经平板PDA培养基活化， 于26下培养一周。 采用每5g木质纤维素粉末置 于500mL三角瓶， 加入15mL无菌水(pH 7.0)， 每瓶接种G.contrarius J2孢子静置于有氧条 件下， 29下培养20天。 可食用真菌接种采用孢子悬液， 浓度控制在约2106个孢子/ml， 每 瓶接种量约为2107个孢子。 0052 步骤三所述干燥后的木质纤维素在培养基中的含量为35g/L。 步骤三接种产氢菌 种子液后的培养基初始pH为6.5； 发酵温度为60， 发酵过程中搅拌速度为150rpm/min， 发 说明书 4/5 页 6 CN 108531515 A 6 酵环境为厌氧， 发酵产氢时间为72h。 步骤三所述氢菌种子液的接种量是微生物直接发酵产 氢培养基体积的4， 接种的产氢菌种子液取生长至对数期的液体悬浊液。 0053 步骤一预处理结果理想， 经计算木质素相对去除率达到62.8。 本实施例产氢量 达到90.3ml/g-预处理木质纤维素。 说明书 5/5 页 7 CN 108531515 A 7 图1 说明书附图 1/1 页 8 CN 108531515 A 8 。