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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610395263.6 (22)申请日 2016.06.03 (83)生物保藏信息 CGMCC No.12218 2016.03.16 (71)申请人 青岛中达生物技术有限公司 地址 266700 山东省青岛市平度市新河生 态化工科技产业基地新昌路东首 (72)发明人 雍道敬牛赡光 (74)专利代理机构 北京联瑞联丰知识产权代理 事务所(普通合伙) 11411 代理人 张清彦 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A01N 63/00(2006.01。
2、) A01N 63/02(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种甲基营养型芽孢杆菌及其生物防治制 剂和应用 (57)摘要 本发明公开一种甲基营养型芽孢杆菌及其 生物防治制剂和应用， 属于生物防治植物病害技 术领域。 菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中 心 ， 保藏 编号为CGMCC No.12218。 实验表明， 本发明的甲基营养型芽孢 杆菌菌株ZDC-03具有生长速度快、 产孢量大、 抗 逆能力强且能够快速大量定殖等特点， 因此具有 良好的应用前景。 由该甲基营养型芽孢杆菌制备 的生物防治制剂， 。
3、不仅能够高效的防治由灰葡萄 孢菌引起的植物病害， 还能有效提高作物产量， 是一种极具应用前景的生物防治制剂。 该菌种的 生物防治制剂可以防治灰葡萄孢菌引起的植物 病害。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 CN 106119147 A 2016.11.16 CN 106119147 A 1.一种甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)菌株ZDC-03， 该菌株保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCCNo.12218。 2.根据权利要求1所述的一种甲基营养型芽孢杆菌菌株ZDC-03， 该甲基营养型芽孢杆 菌的16SrRNA基因序。
4、列为SEQ-1所示。 3.根据权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌菌株ZDC-03在生物防治灰葡萄孢菌引起 的植物病害中的应用。 4.一 种 生 物 防 治 制 剂 ， 包 括 权 利 要 求 1 所 述 的 甲 基 营 养 型 芽 孢 杆 菌 (Bacillusmethylotrophicus)菌株ZDC-03。 5.一种制备权利要求4所述的生物防治制剂的方法， 其特征是， 包括以下步骤： (1)将保存在试管斜面中的甲基营养型芽孢杆菌菌株ZDC-03用NA或LB培养基进行活 化， 并置于28-30恒温培养箱培养2-3d； 所述NA培养基配方为牛肉浸膏3g， 蛋白胨10g， 氯 化钠5g， 琼脂。
5、15-20g， 加水至1000mL， pH调至7.0-7.2； 所述LB培养基配方为胰蛋白胨10g， 酵 母提取物5g， 氯化钠10g， 琼脂15-20g， 蒸馏水1000mL， pH调至7.0-7.2； (2)将步骤(1)的甲基营养型芽孢杆菌菌株ZDC-03的孢子移植到NA或LB液体培养基中， 28-30摇床振荡培养24h得到种子液； 所述的NA液体培养基配方为牛肉浸膏3g， 蛋白胨 10g， 氯化钠5g， 加水至1000mL， pH调至7.0-7.2； 所述LB液体培养基配方为： 胰蛋白胨10g， 酵 母提取物5g， 氯化钠10g， 蒸馏水1000mL， pH调至7.0-7.2； (3)按。
6、3.0的体积比将种子液接种到大量发酵培养基中， 培养温度28-30， 培养时间 36h， 通风比1： 0.8； 发酵完成后得到发酵液； 所述的大量发酵培养基配方(重量比)为黄豆粉 3， 玉米粉3， NaCl0.1， CaCO30.2， 其余为水； (4)将步骤(3)的甲基营养型芽孢杆菌发酵液与基质进行混合均匀， 干燥； 所述发酵液 与发酵液基质的质量比为1:1。 6.权利要求4所述的生物防治制剂在防治灰葡萄孢菌引起的植物病害中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106119147 A 2 一种甲基营养型芽孢杆菌及其生物防治制剂和应用 技术领域 0001 本发明涉及生物防治植物病害技术领。
7、域， 特别涉及一种甲基营养型芽孢杆菌及其 生物防治制剂和应用。 背景技术 0002 灰葡萄孢菌属弱寄生植物病原真菌， 可以侵染200多种植物， 不仅在生长期侵染， 也可以在贮藏期危害。 灰葡萄孢菌具有繁殖快、 宿主范围广、 致病力强等的特性， 逐渐成为 保护地蔬菜生产的只要病害。 灰葡萄孢菌主要引起烂根、 枯萎病、 植物幼苗和插枝的腐烂病 以及茎杆的坏死等。 果实成熟前植株感染灰葡萄孢菌会导致果实组织软化腐烂， 严重影响 果实生长， 使农业生产受损。 果实成熟后在贮藏运输中感染灰葡萄孢菌会导致果实大量腐 烂， 造成巨大的经济损失。 因此， 由灰葡萄孢菌引起的灰霉病已成为严重影响植物生长及采 后。
8、保鲜的主要病害之一。 0003 多年来对灰霉病的防治主要依靠化学农药， 但随着化学药剂带来的环境污染和残 留量问题， 加之长期用药导致抗药性菌株的出现， 使防治难上加难。 且培育抗病品种周期 长， 效率低， 可利用的种质资源有限。 0004 生物防治对人畜安全， 不污染环境， 不易产生抗药性， 相关理论和技术的研究日益 为人们所关注。 本发明的甲基营养型芽孢杆菌具有生长速度快、 产孢量大、 抗逆能力强且能 够快速大量定殖等特征， 具有良好的应用前景。 发明内容 0005 本发明提供了一种甲基营养型芽孢杆菌及其生物防治制剂和应用， 解决由于化学 药剂的使用而带来的环境污染和残留量问题。 0006。
9、 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案为： 0007 本发明提供的菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)ZDC- 03， 是从山东省青岛市红岛沿海滩涂的土壤中分离获得， 已于2016年3月16日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号 院3号， 中国科学院微生物研究所)， 保藏号为CGMCCNo.12218。 其具有以下生物学特性： 菌 体长杆状， 大小为(3.75.2) m(1335) m， 能运动， 产芽孢， 革兰氏染色呈阳性。 在LB 培养基上25培养48h， 菌落呈灰白色， 圆形， 。
10、边缘凸起， 不透明， 菌落直径大小为11.5mm。 0008 一种甲基营养型芽孢杆菌菌株ZDC-03， 该甲基营养型芽孢杆菌的16SrRNA基因序 列为SEQ-1所示。 0009 本发明并提供了甲基营养型芽孢杆菌菌株ZDC-03在生物防治灰葡萄孢菌引起的 植物病害中的应用。 0010 本发明并提供了一种生物防治制剂， 包括权利要求1所述的甲基营养型芽孢杆菌 (Bacillusmethylotrophicus)菌株ZDC-03。 0011 本发明并提供了一种生物防治制剂的方法， 包括以下步骤： 说明书 1/5 页 3 CN 106119147 A 3 0012 (1)将保存在试管斜面中的甲基营养。
11、型芽孢杆菌菌株ZDC-03用NA或LB培养基进行 活化， 并置于28-30恒温培养箱培养2-3d； 所述NA培养基配方为牛肉浸膏3g， 蛋白胨10g， 氯化钠5g， 琼脂15-20g， 加水至1000mL， pH调至7.0-7.2； 所述LB培养基配方为胰蛋白胨10g， 酵母提取物5g， 氯化钠10g， 琼脂15-20g， 蒸馏水1000mL， pH调至7.0-7.2； 0013 (2)将步骤(1)的甲基营养型芽孢杆菌菌株ZDC-03的孢子移植到NA或LB液体培养 基中， 28-30摇床振荡培养24h得到种子液； 所述的NA液体培养基配方为牛肉浸膏3g， 蛋白 胨10g， 氯化钠5g， 加水至。
12、1000mL， pH调至7.0-7.2； 所述LB液体培养基配方为： 胰蛋白胨10g， 酵母提取物5g， 氯化钠10g， 蒸馏水1000mL， pH调至7.0-7.2； 0014 (3)按3.0的体积比将种子液接种到大量发酵培养基中， 培养温度28-30， 培养 时间36h， 通风比1： 0.8； 发酵完成后得到发酵液； 所述的大量发酵培养基配方(重量比)为黄 豆粉3， 玉米粉3， NaCl0.1， CaCO30.2， 其余为水； 0015 (4)将步骤(3)的甲基营养型芽孢杆菌发酵液与基质进行混合均匀， 干燥； 所述发 酵液与发酵液基质的质量比为1:1。 0016 本发明并提供了生物防治制剂。
13、在防治灰葡萄孢菌引起的植物病害中的应用。 该方 法是在植物生长过程中进行喷雾处理； 所述喷雾为该甲基营养型芽孢杆菌的菌悬液或发酵 液或代谢产物或制备的生物防治制剂。 0017 本发明的有益效果： 0018 实验表明， 本发明的甲基营养型芽孢杆菌菌株ZDC-03具有生长速度快、 产孢量 大、 抗逆能力强且能够快速大量定殖等特点， 因此具有良好的应用前景。 由该甲基营养型芽 孢杆菌制备的生物防治制剂， 不仅能够高效的防治由灰葡萄孢菌引起的植物病害， 还能有 效提高作物产量， 是一种极具应用前景的生物防治制剂。 具体实施方式 0019 下面对本发明的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 所描述的。
14、内容仅仅是本发 明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没 有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。 0020 实施案例1 0021 1、 甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)ZDC-03的分离与纯化 0022 本发明的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)ZDC-03采用平板划 线法分离获得的， 具体分离方法为： 称取1g土样于99mL无菌水中， 置于摇床振荡5-10min， 使 土样与水充分混合， 即获得10-2土壤稀释液。 取1ml上述土壤稀释液至。
15、9ml无菌水中， 摇匀即 获得10-3土壤稀释液。 相同的方法配置10-4、 10-5、 10-6的土壤稀释液。 用接种环蘸取不同浓度 的土壤稀释液在平板上划线， 每个浓度重复3次。 培养皿置于28-30的恒温箱中培养24h， 将培养基上的不同形态的菌落在空白NA培养皿中进行划线， 纯化芽孢杆菌菌株， 分别编号 保存。 0023 2、 菌株鉴定 0024 (1)微生物特性： 菌体长杆状， 大小为(3.75.2) m(1335) m， 能运动， 产芽 孢， 革兰氏染色呈阳性。 在LB培养基上25培养48h， 菌落呈灰白色， 圆形， 边缘凸起， 不透 明， 菌落直径大小为11.5mm。 (2)分子。
16、生物学特性 说明书 2/5 页 4 CN 106119147 A 4 0025 该菌株的16SrRNA基因序列测定结果(SEQ-1)如下： 0026 ATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAAC TCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCAC TTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGC。
17、CGACCTG AGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAA TGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGA ACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCG CGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGG。
18、CGGTTTCTTAAGTCTGATG TGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCA CGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTG AGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTA GGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCC。
19、GCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACT CAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGG TCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGT CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGG GCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAG。
20、GAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTG GGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCT CAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGA ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTT TTAGGAGCCAGCC 0027 根据G。
21、en-Bank序列同源性比较， 菌株ZDC-03与Bacillusmethylotrophicus序列相 似性为100， 故将菌株ZDC-03鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)。 0028 实施例2甲基营养型芽孢杆菌菌株ZDC-03对番茄灰霉病室内效果验证 0029 1、 实验方法 0030 采用平板对峙培养法， 将供试的番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)菌饼(8mm)移 至平板中央， 四周2cm处接种ZDC-03菌株， 将其置于28-30恒温培养箱培养， 以不接种芽孢 杆菌的培养皿作对照， 每个处理重复3次。 待对照菌丝长满平板时， 采用。
22、十字交叉法测量菌 落直径、 抑菌带直径， 计算平均值和相对抑制率。 0031 2、 结果 0032 由表1可以看出， 甲基营养型芽孢杆菌菌株ZDC-03对番茄灰霉病菌菌丝生长有较 强的抑制作用， 抑菌带直径为1.45cm， 菌丝生长抑制率为87.38。 0033 表1甲基营养型芽孢杆菌菌株ZDC-03对番茄灰霉病菌室内抑菌活性测定 0034 0035 实例3甲基营养型芽孢杆菌ZDC-03发酵液对番茄灰霉病田间效果验证 0036 1.1供试药剂 说明书 3/5 页 5 CN 106119147 A 5 0037 甲基营养型芽孢杆菌ZDC-03发酵液； 50腐霉利可湿性粉剂(市售)。 0038 1。
23、.2供试作物与防治对象： 0039 供试作物： 番茄， 品种为农博粉霸3号 0040 防治对象： 灰霉病 0041 1.3试验地情况 0042 试验地设在山东寿光市番茄保护地， 于2015年在寿光市番茄保护地大棚内进行防 治番茄灰霉病试验。 所有试验小区的栽培条件(土壤类型、 施肥数量、 浇水等)均匀一致， 并 符合当地农业生产实际。 0043 1.4试验设计及安排 0044 本试验设计了甲基营养型芽孢杆菌ZDC-03发酵液400倍、 600倍、 800倍， 50腐霉 利可湿性粉剂800倍及清水对照共5个处理， 每个小区10m2， 重复3次， 共15个小区， 各小区随 机排列。 0045 1.。
24、5试验调查及计算方法 0046 于打药前、 施药后7天调查调查病情基数， 整个试验调查2次。 调查方法采用随机抽 样法进行调查。 每小区随机5株， 每株选2个枝编号挂牌， 药前药后均从完全展开叶往下数5 片叶进行调查， 每小区共调查50片。 用Duncan新复极差法对试验数据进行统计分析。 在施药 期间， 观察各处理对番茄有无药害产生。 0047 分级方法： 0048 0级： 无病斑； 0049 1级： 病斑面积占整个叶面积5以下； 0050 3级： 病斑面积占整个叶面积610； 0051 5级： 病斑面积占整个叶面积1120； 0052 7级： 病斑面积占整个叶面积2150 0053 9级：。
25、 病斑面积占整个叶面积的51以上。 0054 按下列公式计算病情指数和防治效果： 0055 0056 0057 2.结果 0058 2.1供试药剂对番茄灰霉病的防治效果 0059 表2甲基营养型芽孢杆菌ZDC-03发酵液对番茄灰霉病的田间药效试验 说明书 4/5 页 6 CN 106119147 A 6 0060 0061 试验结果表明， 施药后7天， 甲基营养型芽孢杆菌ZDC-03发酵液稀释400倍时的防 治效果最好， 为76.46； ZDC-03发酵液稀释600倍和800倍时防效不存在显著性差异， 分别 为73.62、 72.85； 50腐霉利可湿性粉剂稀释800倍时防效最差， 仅为67.08， 显著低 于甲基营养型芽孢杆菌ZDC-03发酵液的处理。 0062 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精 神和原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 5/5 页 7 CN 106119147 A 7 0001 序列表 1/1 页 8 CN 106119147 A 8 。