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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610770360.9 (22)申请日 2016.08.30 (71)申请人 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 地址 350013 福建省福州市晋安区新店埔 垱 (72)发明人 陈珍万春和施少华刘荣昌 黄瑜程龙飞傅光华傅秋玲 陈红梅 (74)专利代理机构 北京彭丽芳知识产权代理有 限公司 11407 代理人 彭丽芳 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 区别c。
2、lade2.3.4和clade2.3.4.4H5 AIV的 PCR-RFLP方法 (57)摘要 本发明公开一种区别clade2.3.4和clade 2.3.4.4H5AIV的PCR-RFLP方法。 包括以下步骤： 1)从检测样品中提取病毒基因组RNA； 2)用引物 P1和P2对clade2.3.4和clade2.3.4.4病毒进 行RT-PCR扩增， 得到相应的HA基因片段； 3)取RT- PCR扩增产物经BalI酶切后进行RFLP分析。 本发 明的方法仅需上游引物P1和下游引物P2， 并仅需 常规限制性内切酶BalI进行RFLP酶切后加以鉴 别， 无需复杂繁琐的条件优化过程， 本发明在 cl。
3、ade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV快速鉴别诊 断上快捷准确， 可填补国内外相关领域的研究空 白。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 106119422 A 2016.11.16 CN 106119422 A 1.一种区别clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV的PCR-RFLP方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： 1)从检测样品中提取clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV基因组RNA； 2)用引物P1和P2同时对clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV基因组RNA进行RT-PCR扩 增， 得到相应的HA基因片段， 。
4、扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测， 大小为538bp和529bp， 肉眼 无法进行区别； 3)取RT-PCR扩增产物， 经BalI酶切后进行RFLP分析。 2.根据权利要求1所述的区别clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV的PCR-RFLP方法， 其 特征在于， 所述步骤2)的扩增引物的序列为： 上游引物P1： 5 -TTTCCGTTGGGACATCAA-3 ， 下游引物P2： 5 -ACTCCATCTATTGCCTTTTG-3 。 3.根据权利要求1所述的区别clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV的PCR-RFLP方法， 其 特征在于， 所述步骤3)中， Ba。
5、lI酶切位点位于clade2.3.4.4分支的H5亚型禽流感病毒血 凝素基因HA的扩增产物的221-226位， clade2.3.4.4分支的H5亚型禽流感病毒血凝素基因 HA的扩增产物可被切成2段， 大小分别为223bp和306bp； 而clade2.3.4分支的H5亚型禽流 感病毒血凝素基因HA的扩增片段中没有BalI酶切位点， 被酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测 片段大小不变， 仍为538bp。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106119422 A 2 区别clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV的PCR-RFLP方法 技术领域 0001 本发明涉及兽医传染病快速诊断技术领。
6、域， 特别涉及一种区别clade2.3.4和 clade2.3.4.4H5AIV的PCR-RFLP方法。 背景技术 0002 禽流感(Avianinfluneza， AI)是由A型流感病毒引起的、 主要侵害家禽及野鸟的 一种急性、 高度接触性传染病。 高致病性H5亚型禽流感病毒(H5subtypeavianinfluenza virus,H5AIV)引起的感染目前已被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的动物传染病， 在我国被列为一类动物疫病。 0003 关于流感的最早记录可追溯到1878年来自意大利的一次报道， 随后世界各地陆续 发生流感的暴发和流行。 1996年， 在我国分离到的第一株H。
7、5N1亚型HPAIVA/Goose/ Guangdong/1/96(H5N1)， GS/GD/96， 紧接着香港于1997年发生H5N1亚型禽流感病毒直接感 染人事件， 这是第一个禽源流感病毒未经中间宿主而直接感染人的证据。 由于从祖源病毒 GS/GD/96进化出多个谱系且命名不统一， 为此WHO、 FAO和OIE联合制定了H5N1HPAIV统一分 类准则将H5N1HPAIV分为09共计10个不同clade， 其中clade2.3.4最早于20032006年 间流行于中国、 越南、 泰国、 老挝和马来西亚等地的病毒株， 20062009年clade2.3.4分支 在我国很多地区是优势流行株。 。
8、近年来， clade2.3.4分支出现了新的分支clade2.3.4.4的 H5N6亚型、 H5N8亚型病毒， 并广泛流行于我国多个省市。 针对clade2.3.4H5AIV的疫苗(Re- 5株)和clade2.3.4.4H5AIV的疫苗(Re-8株)已研制成功， 对clade2.3.4和clade2.3.4.4H5 AIV进行鉴别诊断有助于指导H5AIV相应疫苗的科学使用。 0004 然而， clade2.3.4和clade2.3.4.4二者之间的基因序列同源率为94.4(以经典 参考毒株比较为例)， 很难通过常规的分子生物学方法进行鉴别， 限制性内切酶片段长度多 态性(Restrictio。
9、nfragmentlengthpolymorphism， RFLP)是近年来以基因位点差异而引 起内切酶位点不同的一种分子生物学标记技术， 已广泛应用于真核细胞基因组种群内、 种 群间(基因差异往往很小)的分型研究工作中， 应用RFLP技术可对DNA链中发生单个碱基的 突变， 且突变导致一个原有酶切位点的丢失或形成一个新的酶切位点进行分析。 0005 目前， 仅需要1组引物并结合clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV血凝素HA基因的 核苷酸特征， 利用BalI酶进行RFLP酶切分析对clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV进行鉴 别诊断。 本发明检测方法快捷准。
10、确， 可填补国内外相关领域的研究空白。 发明内容 0006 本发明所要解决的技术问题是提供一种区别clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV 的PCR-RFLP方法， 该方法能有效区分clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV感染， 为水禽业健 康养殖提供技术保证。 0007 一种区别clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV的PCR-RFLP方法， 包括以下步骤： 0008 1)从检测样品中分别提取H5亚型禽流感病毒clade2.3.4分支和clade2.3.4.4分 说明书 1/5 页 3 CN 106119422 A 3 支病毒基因组RNA； 0。
11、009 2)用引物P1和P2同时对clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV核酸RNA进行RT-PCR扩 增， 得到相应的HA基因片段， 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测， 大小为538bp和529bp， 肉眼 无法进行区别； 0010 3)取RT-PCR扩增产物， 经BalI酶切后进行RFLP分析。 0011 优选地， 上述技术方案中， 所述步骤2)的扩增引物的序列为： 0012 上游引物P1： 5 -TTTCCGTTGGGACATCAA-3 ， 0013 下游引物P2： 5 -ACTCCATCTATTGCCTTTTG-3 。 0014 优选地， 上述技术方案中， 所述步骤3)中，。
12、 BalI酶切位点位于clade2.3.4.4分支 的H5亚型禽流感病毒血凝素基因HA的扩增产物的221-226位， clade2.3.4.4分支的H5亚型 禽流感病毒血凝素基因HA的扩增产物可被切成2段， 大小分别为223bp和306bp； 而 clade2.3.4分支的H5亚型禽流感病毒血凝素基因HA的扩增片段中没有BalI酶切位点， 经 酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变， 仍为538bp。 0015 本发明上述技术方案， 具有如下有益效果： 0016 本发明鉴定方法简单， 快捷和准确率高： 本发明对78份临床采集的流感症状死亡 鸭病料进行检测， 提取核酸RNA后进行RT-PCR检测。
13、， 经琼脂糖凝胶电泳进行胶回收后进行 BalI酶切， 其中clade2.3.4H5AIV分支4份阳性， 阳性率为5.13(4/78)； clade2.3.4.4H5 AIV分支7份阳性， 阳性率为8.97(7/78)， 检测到clade2.3.4分支和clade2.3.4.4分支H5 AIV共感染2份， 阳性率为2.56(2/78)。 0017 本发明在操作中， 仅需上游引物P1和下游引物P2， 并仅需常规限制性内切酶BalI 进行RFLP酶切后加以鉴别， 无需复杂繁琐的条件优化过程， 本发明在clade2.3.4分支和 clade2.3.4.4分支H5AIV快速鉴别诊断检测上快捷准确， 可填。
14、补国内外相关领域研究空 白。 当前， 针对clade2.3.4H5AIV的疫苗(Re-5株)和clade2.3.4.4H5AIV的疫苗(Re-8株) 已研制成功， 对clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV进行鉴别诊断有助于指导H5AIV相应疫 苗的科学使用。 附图说明 0018 图1为根据本发明的区别clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV的PCR-RFLP方法的上 下游引物扩增区域对两种病毒血凝素HA基因的扩增区域存在核苷酸差异图。 0019 图2为根据本发明的区别clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV的PCR-RFLP方法的电 泳图。 0。
15、020 其中： 泳道M-DNA分子量标准2000， 1-clade2 .3 .4H5AIV的RT-PCR产物， 2- clade2.3.4.4H5AIV的RT-PCR产物， 3-clade2.3.4H5AIV的RT-PCR产物的酶切图， 4- clade2.3.4.4H5AIV的RT-PCR产物的酶切图， 5-clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV共感染 的RT-PCR产物的酶切图， 6-阴性对照。 0021 图3为根据本发明的区别clade2.3.4和clade2.3.4.4H5AIV的PCR-RFLP方法的阳 性样品的RT-PCR产物克隆测序图。 具体实施方式 说明书 2。
16、/5 页 4 CN 106119422 A 4 0022 下面对本发明的具体实施例进行详细描述， 以便于进一步理解本发明。 0023 以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0024 以下实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可通过商业途径获得。 0025 实施例1 0026 1、 提取病毒的核酸RNA； 0027 (1)病毒来源： 0028 H5亚型禽流感病毒clade2.3.4分支(CX1株)和clade2.3.4.4分支(DK10株)均由福 建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。 0029 (2)提取病毒RNA： 0030 用常规方法分别提取clade2.3。
17、.4分支(CX1株)和clade2.3.4.4分支(DK10株)H5 AIV的基因组RNA， 以备RT-PCR扩增使用。 0031 2、 RT-PCR扩增 0032 (1)扩增引物的设计和选择： 0033 根据clade2.3.4H5AIV和clade2.3.4.4H5AIV的HA基因特征设计上游引物P1和 下游引物P2， 其中， 引物的序列如下： 0034 上游引物P1： 5 -TTTCCGTTGGGACATCAA-3 ， 0035 下游引物P2： 5 -ACTCCATCTATTGCCTTTTG-3 。 0036 如图1所示： 本发明设计的上下游引物扩增区域对clade2.3.4和clade。
18、2.3.4.4H5 AIV血凝素HA基因的扩增区域存在核苷酸差异(H5亚型禽流感病毒clade2.3.4血凝素基因 HA核苷酸序列为TGGTAA， 而H5亚型禽流感病毒clade2.3.4.4血凝素HA基因HA核苷酸序列为 TGGCCA(BalI酶切识别位点)。 0037 (2)RT-PCR扩增： 0038 用上述设计的特异性引物P1和P2进行RT-PCR扩增， 扩增反应体系如下： 0039 采用TransScriptOne-StepRT-PCRSuperMix(购自北京全式金生物技术 有限公司)推荐的RT-PCR扩增反应体系(40 L， 见表1)。 其中， 提取的病毒RNA模板2 L、 上游。
19、 引物P1(10 M)1 L、 下游引物P2(10 M)1 L、 2One-StepReactionMix20 L、 Trans ScriptOne-StepEnzymeMix1 L， 补充灭菌去离子水15 L至终体积40 L。 0040 表1RT-PCR反应体系 0041 0042 RT-PCR扩增反应条件为： 50反转录30min后进行PCR扩增。 条件为： 94预变性 4min； 94变性30s， 55退火30s， 72延伸30s， 共35个循环， 72延伸10min， 4保存备 用。 说明书 3/5 页 5 CN 106119422 A 5 0043 (3)凝胶电泳检测： 0044 扩。
20、增产物用常规的琼脂糖凝胶电泳检测， 凝胶成像， 结果如图2所示。 0045 如图2所示： 在上述条件下， clade2.3.4H5AIV(泳道1)和clade2.3.4.4H5AIV(泳 道2)的样品分别扩增出大小为538bp和529bp的片段。 0046 3、 RFLP分析 0047 将RT-PCR产物经胶回收后， 利用RFLP进行BalI酶切分析。 酶切体系如下： 0048 采用BalI(购自宝生物工程(大连)有限公司)推荐的酶切反应体系(30 L， 见表 2)， 其中RT-PCR胶回收产物20 L、 10BalI3 L、 BalI酶1 L， 0.1BSA0.3 L， 补充灭菌去 离子水5。
21、.7 L至终体积30 L。 0049 反应条件： 37水浴反应60min。 0050 表2酶切反应体系 0051 0052 反应结束后， 进行常规琼脂糖凝胶电泳分析， 对检测样品进行分析clade2.3.4和 clade2.3.4.4H5AIV类型， 结果如图2所示。 0053 如图1所示： BalI酶切位点位于clade2.3.4.4病毒血凝素基因HA的扩增产物的 221-226位(TGGCCA)； clade2.3.4H5AIV血凝素基因HA的扩增片段中没有BalI酶切位点， 此处序列为TGGTAA。 0054 如图2所示： clade2.3.4H5AIV血凝素基因HA的扩增片段中没有Ba。
22、lI酶切位点， 被酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小不变， 仍为538bp(泳道3)， 而clade2.3.4.4H5 AIV可被切成2段， 大小分别为223bp和306bp(泳道4)。 0055 4、 临床应用 0056 本发明对78份临床采集的流感症状死亡鸭病料进行检测， 提取核酸RNA后进行RT- PCR检测， 经琼脂糖凝胶电泳进行胶回收后进行BalI酶切， 其中clade2.3.4H5AIV分支4份 阳性， 阳性率为5.13(4/78)； clade2.3.4.4H5AIV分支7份阳性， 阳性率为8.97(7/78)， 检测到clade2.3.4分支和clade2.3.4.4分支H5A。
23、IV共感染2份， 阳性率为2.56(2/78)。 0057 随机选取检测为H5亚型禽流感病毒clade2.3.4阳性1个样品(clade2.3.4阳性1)、 H5亚型禽流感病毒clade2 .3 .4 .4阳性1个样品(clade2 .3 .4 .4阳性1)以及检测为 clade2.3.4分支和clade2.3.4.4分支H5AIV共感染1个样品(记为clade2.3.4混合阳性1和 clade2.3.4.4混合阳性1)的RT-PCR产物进行克隆测序， 结果符合预期。 clade2.3.4阳性1在 此处核苷酸序列为TGGTAA； clade2.3.4.4阳性1在此处核苷酸序列为TGGCCA； 。
24、检测为 说明书 4/5 页 6 CN 106119422 A 6 clade2.3.4分支和clade2.3.4.4分支H5AIV共感染1个样品中记为clade2.3.4混合阳性1 在此处核苷酸序列均为TGGTAA且记为clade2.3.4.4混合阳性1在此处核苷酸序列均为 TGGCCA， 均符合引物设计时的基因特征， 结果如图3所示。 0058 本发明的优点在于， 其仅需上游引物P1和下游引物P2， 并仅需限制性内切酶BalI 进行RFLP酶切后进行鉴别， 无需复杂繁琐的条件优化过程。 0059 本发明在H5亚型禽流感病毒clade2.3.4分支和clade2.3.4.4分支快速鉴别诊断 检。
25、测上快捷准确， 可填补国内外相关领域研究空白。 当前， 针对clade2.3.4H5AIV的疫苗 (Re-5株)和clade2 .3 .4 .4H5AIV的疫苗(Re-8株)已研制成功， 对clade2 .3 .4和 clade2.3.4.4H5AIV进行鉴别诊断有助于指导H5AIV相应疫苗的科学使用。 0060 虽然本发明已以实施例公开如上， 然其并非用于限定本发明， 任何本领域技术人 员， 在不脱离本发明的精神和范围内， 均可作各种不同的选择和修改， 因此本发明的保护范 围由权利要求书及其等同形式所限定。 说明书 5/5 页 7 CN 106119422 A 7 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 8 CN 106119422 A 8 。