发明领域
本发明涉及用于哺乳动物以及尤其是人的慢性创伤的分类和预后的方法和试剂盒，包括其部分。更具体地，该方法涉及识别一种或者多种基因表达谱，所述的基因表达谱使得能够区分“异常的或者非愈合性的”慢性创伤或者愈合性的慢性创伤。有利地，所述的基因表达谱使得能够对治疗的选择作出知情决定，以及能够预测使用给定的疗法之后的结果。此外本发明识别出了用于创伤疗法的新的靶。
发明背景
在一种或另一种形式上说，非愈合性的或者慢性的和愈合不良的创伤构成了英国卫生系统的主要负担。此外，在欧盟若干成员国中，与创伤愈合相关的医疗费用已经接近健康护理资金的第三位。
慢性足溃疡是糖尿病的主要并发症，其在所有糖尿病相关的入院中占高达25％，并且每年花费英国国民保健服务2亿5千万英镑。慢性足溃疡导致高发病率，损害生活的质量，并且是下肢截肢的主要原因。尽管对足部护理给予了细心的关注，仍有多达25％的糖尿病患者在其一生中发生足溃疡。在糖尿病患者中，下肢溃疡的原因是和非糖尿病患者一致的，也即神经病、缺血以及外伤。然而，这一“致病三部曲”使得创伤容易感染，这也助长了创伤的非愈合特性。
当前的治疗涉及从该区域消除压力、清创、包扎创伤并控制感染：在更为严重的疾病中，可能需要外科切除和血管重建，最终可能必须截肢。
除了糖尿病患者中的下肢溃疡外，医疗费用的另一主要来源是由压力创伤，或者未能提供常规护理或者医疗处理所导致的溃疡所产生的。在英国每年有412000人受此类创伤的影响，花费14-21亿英镑。
创伤的愈合受到复杂的生物过程的控制，该生物过程涉及：大量类型的细胞；细胞和组织之间的复杂相互作用；免疫系统的激活以及血管生成过程的激活。
典型的愈合过程可以分为5个不同的但是紧密相关的阶段：凝固阶段，急性炎症阶段，基质沉积阶段，毛细血管形成阶段和上皮重新形成阶段。这些阶段中的每个均受到多种因素的控制。在该过程的任意方面的缺陷都可以导致有缺陷的创伤愈合。因此，“正常”的愈合过程可以由于内在的或者外在的因素而有缺陷，所述的缺陷表现为”不正常的非愈合性的“或者”慢性的“创伤。正是这些“非愈合性的”或者慢性的创伤为患者的生活质量带来了最大的挑战，并增加了医疗护理系统的开支。
尽管一些共同的临床的/病理的因素对于预先判断创伤是“愈合性的”抑或“非愈合性”，或者急性的创伤是否变成慢性的有帮助，没有特定的实验室检测来区分创伤的类型。除此之外，尚未有清楚的方法能确定如何预测愈合过程，以及确定患者在创伤护理中对治疗可能的反应。
因此，我们开发了确定给定创伤的预后的方法，该方法在创伤的治疗之前或者在其治疗中相对地易于实施，有效地进行并且为可能的结果提供准确的指示。我们的方法使用虽少但具高度代表性的标记物样本，该标记物样本区分急性创伤、慢性创伤和非愈合性创伤，并且因此在为给定的创伤选择治疗时是尤其地相关的，并且在给定的创伤的治疗后在确定可能的结果中尤其地准确。
总而言之，我们确定了多种分子标记物，所述的分子标记物对于确定预测给定的创伤具有相关性。这些标记物共同地构成至少一个分子特征，并且这些标记物在来自患者的创伤组织中的表达构成了基因表达谱，该基因表达谱表明给定的创伤的类型和预后。除此之外，我们分析了所述的分子特征，从而识别哪些标记物是创伤类型和预后的最佳的指示剂，换言之，对所述的分子特征预测能力贡献最大的那些。标记物的这个子集统称为精制的分子特征以及这些标记物的表达构成了精制的基因表达谱。
除此之外，我们对此精制的分子特征进行了检查，以确定其是否含有基因的子集，所述的基因的子集可以用于提供进一步可接受的，创伤愈合的指示。标记物的该子集统称为超精制的分子特征，并且这些标记物的表达构成了超精制的基因表达谱。
在此所引用的术语标记物是指其完整身份可以在www.NCBI.LM.NIH.gov数据库中得到的已命名的基因，或者本领域技术人员所公知的，参见附录1。
对在此描述的分子特征的说明在第一个实例中，牵涉到系统和仔细的检查创伤组织的34个样品和110个遗传分子标记物，以及在进行验证研究的第二个实例中，牵涉到系统和仔细的检查创伤组织的71个样品以及在此描述的标记物的应用。
然而，在完成这一艰苦的任务之后，我们出乎意料地发现，事实上为了向给定的创伤组织样品提供准确的分类和预后需要对非常少的基因进行检查。更为出乎意料的是，我们能够通过识别出对我们的分子特征的预测能力贡献最多的那些分子标记物，来进一步地减少这一数目，例如仅有25个；或者更为理想地，14个；或者更为理想地只有4个基因需要被进行检查。这意味着我们的方法具有直接的应用，并且可以快速、常规地在临床的环境下实施。实际上，我们建议我们的方法构成创伤护理的标准治疗方案的部分，从而相关的医师可以在早期确定特定的创伤的分类和结果，从而相应地配合治疗。因此，例如，一名个体在表现出表示“异常的或者非愈合性的”慢性创伤的特征指示情况下，可以采取与表现出愈合性慢性创伤不同形式的治疗。因此，我们的方法不仅仅用于确保个体得到针对其创伤状态的治疗，通过确保侵入性疗法仅仅用于必须的情况，其还能够在治疗中改善患者的生活质量。
发明内容
在下述的本发明的陈述中，我们使用了14个经基因精制的基因特征来提供识别异常的或者非愈合性的慢性哺乳动物创伤组织的方法。
相应地，在本发明的一个方面，提供了用于识别异常的或者非愈合性的慢性哺乳动物创伤组织的方法，该方法包括：
(a)检查来自个体的创伤组织样品，从而确定编码以下分子标记物的基因的表达水平，所述的分子标记物为ARP2、CREBL1、VEGF-C、牛皮藓素、IL22R、TEM4、IL8RB、IL17BR、闭合蛋白-5、KAI1、PTPRK、CAR1、Endomucin-2和TEM7R；并且
(b)如果所有的下列基因都显示出上升的表达水平：
牛皮藓素、闭合蛋白-5、IL8RB、IL22R、PTPRK、TEM4、TEM7R、VEGF-C、ARP2和CAR1；
(c)推断该组织样品所取自的个体具有异常的或者非愈合性的慢性创伤。
在本发明进一步优选的方法中，进行了另外的研究，从而确定下列的标记物中的任意一种或多种是否显示出下降的或者正常的表达水平：
Endomucin-2、IL17BR、KaI1和CREBL1；并且
如果情况是这样，推断该组织样品所取自的个体具有非愈合性的慢性创伤。
理想地，所述的创伤组织样品来自慢性创伤。
在本发明的第二个方面，提供了识别愈合性慢性哺乳动物创伤组织的方法，该方法包括：
(a)检查来自个体的创伤组织样品，从而确定编码以下分子标记物的基因的表达水平，所述的分子标记物为ARP2、CREBL1、VEGF-C、牛皮藓素、IL22R、TEM4、IL8RB、IL17BR、闭合蛋白-5、KAI1、PTPRK、CAR1、Endomucin-2,和TEM7R；并且
(b)如果所有的下列基因都显示出下降的表达水平：
CREBL1、IL17BR、KAI1和Endomucin-2；
(c)推断该组织样品所取自的个体具有愈合性的慢性创伤。
在本发明的进一步优选的方法中，进行了另外的研究，从而确定下列的标记物中的任意一种或多种是否显示出上升的或者正常的表达水平：牛皮藓素、闭合蛋白-5、IL8RB、IL22R、PTPRK、TEM4、TEM7R、VEGF-C、ARP2和CAR1，并且如果情况是这样，推断该组织样品所取自的个体具愈合性的慢性创伤。
理想地，所述的创伤组织样品来自慢性创伤。
在下述的本发明的陈述中，我们使用了4个经基因超精制的基因特征来提供识别异常的或者非愈合性的慢性哺乳动物创伤组织的方法。然而，如本领域技术人员将意识到的，所述的14个经基因精制的基因特征和所述的4个经基因超精制的基因特征可以同时地或者连续地使用，并且实际上当使用14个经基因精制的基因特征时，其在其内部含有超精制的基因特征，并且因此实际上两种特征是同时地使用的，但是，如果使用4个经基因超精制的基因特征，其可以用于14个经基因精制的基因特征的分离，或者随后用于14个经基因精制的基因特征的分离。
相对应地，在本发明的另一个方面中，提供了识别异常的或者非愈合性的慢性哺乳动物创伤组织的方法，该方法包括：
(a)检查来自个体的创伤组织样品，从而确定编码以下分子标记物的基因的表达水平，所述的分子标记物为ARP2、CREBL1、PTPRK和TEM7R；并且
(b)如果所有的下列基因都显示出上升的表达水平：
PTPRK、TEM7R和ARP2；
(c)推断该组织样品所取自的个体具有异常的或者非愈合性的慢性创伤。
在本发明进一步优选的方法中，进行了另外的研究，从而确定下列的标记物是否显示出下降的或者正常的表达水平：
CREBL1；并且
如果情况是这样，推断该组织样品所取自的个体具有非愈合性的慢性创伤。
理想地，所述的创伤组织样品来自慢性创伤。
在本发明的上述各个方法中，检测理想地使用人组织进行。
根据本发明的一个方面，所述的基因表达水平通过测量RNA来测定。优选地，所述的RNA是mRNA。
根据本发明的另一个方面，所述的基因表达水平通过测量相应的编码的蛋白质来测定。其中所述的蛋白质使用抗体进行测量。优选地，所述的抗体是单克隆抗体。更优选地，使用标签标记所述的抗体，从而可以测定结合于靶蛋白质的抗体的存在。
根据本发明的再一个方面，所述的基因表达水平是对比参照基因进行测定的，并且因此上升或者下降的表达是指参照所述的参照基因的表达而上升或者下降的表达。优选地，所述的参照基因是在对照组织样品中表达的基因。更优选地，所述的对照样品是正常的皮肤组织。最优选地，所述的正常皮肤组织取自所述的创伤组织样品的相同肢或者区域。其中所述的参照基因优选是持家基因，更优选地，所述的参照基因是GAPDH。在本发明的另外一种优选方案中，所述的参照基因是用于健康个体中的一种或多种所述基因的表达的经认可的标准。
在本发明的上述各个方法中，理想地，检测所检查的组织样品中RNA的存在，优选地检测总RNA，以及更优选地检测mRNA的量。对于本领域技术人员而言明显的是，可以用于测量RNA含量的技术是熟知的并且是临床诊断领域的人员常规实施的。该技术可以包括RNA的反转录以产生cDNA，以及包括任选的扩增步骤，随后为cDNA或其产物的检测。
在本发明的一个可供选择的实施方案中，该方法涉及检测由各个所述的分子标记物所编码的蛋白，并且因此，通常地但是并非排他地涉及使用结合于相关的蛋白并且识别其的药剂。一般的药剂是抗体，并且最理想地为单克隆抗体，其有利地使用适合的标签进行标记，从而可以确定结合的抗体的存在。用于识别蛋白的检测技术对于本领域技术人员而言是公知的，并且实际上，由临床诊断领域的工作人员每天使用。该检测技术可以由技术工人实施，从而利用本发明。
在实施本发明的进一步优选的方法中，对比对照样品中的参照基因(例如，但不限于GAPDH)来测定给定的分子标记物的表达水平，其中所述的对照样品是正常的组织，理想地是正常的皮肤组织，更理想地是取自与创伤组织相同肢体或者相同区域的正常组织。因此，上升的表达是指选定的基因与相对应的组织中的GAPDH的表达相比而言的上升。相反地，下降的表达是指选定的基因的表达相对于各自组织中的GAPDH的表达相比而言的下降。可选地，给定的分子标记物的表达水平相对于参照基因进行测定，其中所述的参照基因可以是对照样品中相同的基因或者另一选定的基因(如持家基因)，其中所述的对照样品是已知是非愈合性的、慢性的或者急性的创伤组织的样品，其理想地来自与所检查的创伤组织相同肢体或者相同区域。再可选地，给定的分子标记物的表达水平相对于内标进行测定，其中使用了遗传构建物如质粒，所述的构建物表达已知量的参照基因。再次可供选择地，所述的对照在健康的个体中对于表达各个相关的基因而言，是经认可的标准。
在全部的情况下，5％或者更低的水平的正常、上升或者下降的表达在统计学上是相关的。
在本发明可供选择的实施方案中，基因表达水平可以通过实时定量PCR，使用以下中所描述的方法进行测量：Jiang等人2003a和2004.JiangWG,WatkinsG,LaneJ,Douglas-JonesA,CunnickGH,MokbelM,ManselRE.PrognosticvalueofRhofamiltyandandrho-GDIsinbreastcancer.ClinicalCancerResearch,2003a,9,6432-6440；JiangWG,WatkinsG,FodstadO,Douglas-JonesA,MokbelK,ManselRE.DifferentialexpressionoftheCCNfamilymembersCyr61fromCTGFandNovinhumanbreastcancer.EndocrineRelatedCancers,2004,11:781-791。
根据本发明的再另一个方面，提供了实施前述任意一种或多种方法的试剂盒，所述的试剂盒包括：
(a)多个探针，所述的探针限于用于检测和定量所有以下的分子标记物的表达水平的那些，所述的分子标记物是ARP2、CREBL1、VEGF-C、牛皮藓素、IL22R、TEM4、IL8RB、IL17BR、闭合蛋白-5、KAI1、PTPRK、CAR1、Endomucin-2和TEM7R；以及
(b)任选地，与所述的探针的使用有关的试剂和说明。
根据本发明的再另一个方面，提供了实施前述任意一种或多种方法的试剂盒，所述的试剂盒包括：
(a)多个探针，所述的探针限于用于检测和定量所有以下分子标记物的表达水平的那些，所述的分子标记物是ARP2、VEGF-C、牛皮藓素、IL22R、TEM4、IL8RB、闭合蛋白-5、PTPRK、CAR1和TEM7R；以及
(b)任选地，与所述的探针的使用有关的试剂和说明。
根据本发明的再另一个方面，提供了实施前述任意一种或多种方法的试剂盒，所述的试剂盒包括：
(a)多个探针，所述的探针限于用于检测和定量所有以下分子标记物的表达水平的那些，所述的分子标记物是CREBL1、IL17BR、KAI1和Endomucin-2；并且
(b)任选地，与所述的探针的使用有关的试剂和说明。
根据本发明的再另一个方面，提供了实施前述任意一种或多种方法的试剂盒，所述的试剂盒包括：
(a)多个探针，所述的探针限于用于检测和定量所有以下分子标记物的表达水平的那些，所述的分子标记物是ARP2、CREBL1、PTPRK和TEM7R；并且
(b)任选地，与所述的探针的使用有关的试剂和说明。
根据本发明的再另一个方面，提供了确定哺乳动物创伤组织的预后的试剂盒，所述的试剂盒包括：
(a)多个探针，所述的探针限于用于检测和定量以下基因中的每一个的至少一种转录物或者多肽/蛋白质的表达水平的那些，所述的基因是ARP2、CREBL1、VEGF-C、牛皮藓素、IL22R、TEM4、IL8RB、IL17BR、闭合蛋白-5、KAI1、PTPRK、CAR1、Endomucin-2和TEM7R；并且
(b)任选地，与所述的探针的使用有关的试剂和说明。
根据本发明的再另一个方面，提供了确定哺乳动物创伤组织的预后的试剂盒，所述的试剂盒包括：
(a)多个探针，所述的探针限于用于检测和定量每一个以下基因的至少一种转录物或者多肽/蛋白质的表达水平的的那些，所述的基因是ARP2、VEGF-C、牛皮藓素、IL22R、TEM4、IL8RB、闭合蛋白-5、PTPRK、CAR1和TEM7R；并且
(b)任选地，与所述的探针的使用有关的试剂和说明。
根据本发明的再另一个方面，提供了确定哺乳动物创伤组织的预后的试剂盒，所述的试剂盒包括：
(a)多个探针，所述的探针限于用于检测和定量以下基因中的每一个的至少一种转录物或者多肽/蛋白质的表达水平的那些，所述的基因是CREBL1、IL17BR、KAI1和Endomucin-2；并且
(b)任选地，与所述的探针的使用有关的试剂和说明。
根据本发明的再另一个方面，提供了确定哺乳动物创伤组织的预后的试剂盒，所述的试剂盒包括：
(a)多个探针，所述的探针限于用于检测和定量以下基因中的每一个的至少一种转录物或者多肽/蛋白质的表达水平的那些，所述的基因是ARP2、CREBL1、PTPRK和TEM7R；并且
(b)任选地，与所述的探针的使用有关的试剂和说明。
理想地，在各个上述的方面中，说明显示了如何测定各个所述基因的表达水平。
在本发明的再另一个实施方案中，所述的试剂盒附加地包括：
(a)多个探针，所述的探针限于用于检测和定量在表1中说明而未示于表2中的全部分子标记物的表达水平的那些；并且
(b)任选地，与所述的探针的使用有关的试剂和说明。
在本发明的再另一个实施方案中，所述的试剂盒附加地包括：
(a)多个探针，所述的探针限于用于识别和定量显示于表1中而未显示于表2中的至少一种基因的至少一种转录物或者多肽/蛋白质的表达水平的那些；并且
(b)任选地，与所述的探针的使用有关的试剂和说明。
理想地，所述的说明显示了如何测定各个所述基因的表达水平。
在本发明的进一步的方面，提供了包含前述各套探针的任意选定的组合的试剂盒，所述的探针用于识别前述各套的分子标记物。
根据本发明再进一步的方面，提供了微阵列，该微阵列包括前述各套探针的任意一套或多套，所述的探针用于识别前述分子标记物的任意一种或多种的表达。
在本发明的另一个方面，提供了测定患者中创伤类型的试剂盒，该试剂盒包括：
(a)至少一种微阵列，该微阵列包括多个探针，该探针限于用于识别前述方法中所描述的分子标记物的至少一套的那些；并且任选地
(b)第二微阵列，该第二微阵列包括多个探针，该探针限于用于识别内标中的相同套的分子标记物的那些，该内标代表了所述标记物的正常表达水平。
本发明还提供了上文所述的一套探针。
根据本发明进一步的方面，提供了治疗创伤的方法，该方法包括实施上述用于确定创伤组织的分类或者预后的方法中的任一种或多种，从而识别所述的创伤是非愈合性的慢性创伤组织，或者是愈合性的慢性创伤组织，并且然后根据对所述组织的所述分类或者预后，选择合适的疗程。
在本发明随后的权利要求中，以及在前面的发明描述中，除非上下文需要，否则由于表达语言或者必须的含义，词语“包括(comprises)”或者变体如“包括(comprises)”或者“包括(comprising)”以包括性的含义使用，也即规定所指出的特征的存在，而不排除在本发明的各种实施方案中进一步的特征的存在或者加入。
在本说明书中引用的全部的参考文献，包括任意的专利或者专利申请引入本文作为参考。未承认任意的参考文献构成现有技术。同时，未承认任意的现有技术构成本领域的一般公知常识的部分。
本发明各个方面的优选特征可以结合任意其他的方面进行描述。
本发明的其他特征在随后的实例中是显然的。一般来说，本发明扩展到在本说明书(包括所附的权利要求和附图)中所公开的任意新的一个特征或任意新的特征的组合。因此，结合本发明的具体方面、实施方案或者实例而描述的特征、整体、标记物或者基因应理解为适用于本文描述的任意其他方面、实施方案或者实例，除非与其不能共存。
此外，除非另外指出，本文公开的任意特征可以由可选的特征替代，所述的可选的特征用于相同或者相似的目的。
附图说明
图1显示了通过电子细胞传感(ECIS)监测治愈过程。将ECIS室中的单层细胞以5v30秒(如所示地)进行创伤。在创伤前后监测电阻抗的变化。创伤三小时之后，迁移/愈合达到其稳定期；
图2显示了使用基于ECIS的创伤检测的形态学评估。将电极上的融合的细胞在6v下创伤60秒，在此之后，在4小时内记录细胞向创伤空间中的迁移。在3小时后，创伤在很大程度上愈合；并且
图3显示了使用刮擦创伤检测进行创伤的形态学评估。将电极上的融合的细胞创伤，此后在6小时之内记录细胞向创伤空间中的迁移。在3小时后，创伤在很大程度上愈合。
具体实施方式
现在，通过随后的实施例，并具体参考表1-15和图1-3，描述本发明，其中：
表1显示了包含本发明的分子特征的25个基因。
表1b显示了用于将表1中所示的基因的表达进行定量的引物。
表2显示了包含本发明的精制的分子特征的14个基因。
表3-16显示了当使用25个基因分子特征，或者14个精制的基因分子特征，或者4个基因超精制的分子特征来分类创伤组织时所得到的数据。
图1显示了通过电子细胞传感(ECIS)监测治愈过程。将ECIS室中的单层细胞以5v30秒(如所示地)进行创伤。在创伤前后监测电阻抗的变化。创伤三小时之后，迁移/愈合达到其稳定期；
图2显示了使用基于ECIS的创伤检测的形态学评估。将电极上的融合的细胞在6v下创伤60秒，在此之后，在4小时内记录细胞向创伤空间中的迁移。在3小时后，创伤在很大程度上愈合；并且
图3显示了使用刮擦创伤检测进行创伤的形态学评估。将电极上的融合的细胞创伤，此后在6小时之内记录细胞向创伤空间中的迁移。在3小时后，创伤在很大程度上愈合。
材料和步骤
细胞(A431、HECV、MRC5、HaCaT)购自ATCC，InterLab，ECACC和GermanCancerInstitute，并且保存于补加了10％FCS和抗生素的组织培养基中。重组的人HGF来自本申请人的研究实验室(MetastasisandAngiogenesisResearchGroup,UniversityDepartmentofSurgery,CardiffUniversity,HeathPark，Cardiff，CF144XN,UK)。
组织处理
组织的制备，以及从人的创伤/皮肤组织构建cDNA库。
在恒冷箱(Leica)中将组织冷冻切片。将该切片的一部分保留用于组织学分析。使用从组织中提取RNA的步骤，将约20个切片合并并使用手持式均质器进行均质化。参见下文，将从该组织中提取出的RNA进行定量，并且从等量的RNA中产生cDNA库。
在得自急性或慢性创伤的患者以及正常皮肤的一队列样品上测量各组基因的转录物的表达水平。所述的组织和正常皮肤的采集是在当地伦理委员会的批准下进行的(伦理批准ID：05/WSE03/92)。从同意从其取得活体样品的各个患者处得到了书面知情同意书。慢性创伤组织来自具有慢性腿溃疡的患者。急性创伤组织来自在进行了藏毛病的切除术后具有急性外科创伤的患者。正常组织来自正常的志愿者的正常皮肤。
从细胞和组织中提取RNA以及cDNA的合成。
将组织的冷冻切片按照5-10μm的厚度进行切割，并且保存用于免疫组织化学和常规的组织学(JiangWG,WatkinsG,LaneJ,Douglas-JonesA,CunnickGH,MokbelM,ManselRE.PrognosticvalueofRhofamiltyandandrho-GDIsinbreastcancer.ClinicalCancerResearch,2003a,9,6432-6440)。使用手持均质机将另外的15-20个切片在冰冷的RNA提取溶液(RNA分离试剂，ABgene,Surrey,England)中进行均质。RNA的浓度使用UV分光光度计进行测定(JiangWG,WatkinsG,LaneJ,Douglas-JonesA,CunnickGH,MokbelM,ManselRE.PrognosticvalueofRhofamilyandrho-GDIsinbreastcancer.ClinicalCancerResearch,2003a,9,6432-6440)。使用AbGeneTM提供的RT试剂盒，在96孔板中使用1μg的总RNA进行反转录，所述的试剂盒具有锚定的寡聚dt引物。cDNA的量使用β-肌动蛋白引物进行证实。RNA提取试剂盒和RT试剂盒得自AbGeneLtd,Surrey,England,UK。PCR引物(参见表1b)使用BeaconDesigner(California,USA)进行设计，并且由InvitrogenTMLtd(Paisley,Scotland,UK)合成。分子生物学级的琼脂糖和DNAladder来自Invitrogen。用于传统的PCR和定量PCR的Mastermix来自AbGene。
遗传标记物的定量分析
来自如上文制备的cDNA的所述基因(参见表1和表2)的转录水平使用实时定量PCR，基于AmplifuorTM技术进行测定(NazarenkoIA,BhatnagarSK,HohmanRJ.AclosedtubeformatforamplificationanddetectionofDNAbasedonenergytransfer.NucleicAcidsRes.1997Jun15；25(12):2516-21)；从此前报道的方法修改(JiangWG,WatkinsG,LaneJ,Douglas-JonesA,CunnickGH,MokbelM,ManselRE.PrognosticvalueofRhofamiltyandandrho-GDIsinbreastcancer.ClinicalCancerResearch,2003a,9,6432-6440；以及JiangWG,Douglas-JonesA,andManselRE.LevelofexpressionofPPAR-gammaanditsco-activator(PPAR-GCA)inhumanbreastcancer.InternationalJournalofCancer,2003b,106,752-757)。总地来说，使用BeaconDesigner软件(版本2，Biosoft,PaloAlto,California,USA)设计了一对PCR引物(参见表1b)。在引物之一(在我们的实验室里常规地在反义引物)中加入额外的序列，所述的序列已知为Z序列(5’actgaacctgaccgtaca’3)，该序列与广泛存在的Z探针互补(Nazarenko等人1997，同前文)(IntergenInc.,England,UK)。用于β-肌动蛋白的TaqmanTM检测试剂盒购自Perkin-ElmerTM。
该反应按照以下进行：Hot-startQ-mastermix(Abgene)，10pmol的特异性正向引物，1pmol的具有Z序列的反向引物，10pmol的FAM-标签的探针((IntergenInc.)以及来自约50ngRNA(按照RT反应中的起始RNA计算)的cDNA。该反应使用IcyclerIQTM(Bio-RadTM,HemelHamstead,England,UK)进行，其装配了允许实时检测96个反应的光学装置，使用了以下的条件：94℃下12分钟，94℃下15秒的50个循环，55℃下40秒以及72℃下20秒(JiangWG,Douglas-JonesA,andManselRE.LevelofexpressionofPPAR-gammaanditsco-activator(PPAR-GCA)inhumanbreastcancer.InternationalJournalofCancer,2003b,106,752-757以及JiangWG,GrimshawD,LaneJ,MartinTA,ParrC,DaviesG,LaterraJ,andManselRE.RetroviralhammerheadtransgenestocMETandHGF/SFinhibitedgrowthofbreasttumour,inducedbyfibroblasts.ClinicalCancerResearch,2003c,9,4274-4281)。从内标中得到转录物的水平(JiangWG,WatkinsG,LaneJ,Douglas-JonesA,CunnickGH,MokbelM,ManselRE.PrognosticvalueofRhofamilyandrho-GDIsinbreastcancer.ClinicalCancerResearch,2003a,9,6432-6440)，所述的内标与样品同时进行扩增。结果以两种方式显示于此：基于等量的RNA的转录物水平，或者显示为靶/GAPDH比例。
表达谱的解读和分子特征的推理
基因转录物的表达谱首先针对样品的特性，使用Minitab软件(MinitabInc.,StateCollege,PA16801,USA)进行分析。
“精制”——选择潜在的候选：这基于本发明人为了该研究队列而写的Macro(WD-SigMacro)进行，所述的Macro使得能在Minitab应用程序窗口中自动地统计分析不同组织类型中的表达水平。“最终列表的选择”：这是基于给定的基因转录物和其谨慎地将慢性的组和其他的组分开的能力进行的。这牵涉到Excel(微软Office2007版，用于分组和基本统计学计算)，SPSS(SPSSInc.,Chicago,Illinois,US，用于三次分组中的高级的统计分析)以及Minitab分析(用于非参数KriskulWallis检验)的使用。“表达特征的编制”。这再一次地基于“加一减一”程序，通过使用多格列表方法，使用为本研究写的macro进行。所述的macro使得能够在从列表中除去候选基因之后，自动及快速地在Minitab软件中进行统计学分析。然而，本领域技术人员应当认识到，其他形式的分析可以用于得到数据，并且因此确定哪些基因对于该检测的预测性的特性贡献最大。这些可选的分析的形式包括使用加权的或者非加权分析的logistic回归。在加权分析中，存在于更紧密地预测愈合性的特征或者“模型”中的那些基因与愈合关系较少的基因相比，对于预后分数的贡献更大。同时，如果基因的存在与“非愈合性的”相关而非“愈合性的”相关，其对于该分数具有负面的影响。除此之外，可以使用反向消除分析或者逐步消除分析。在前者的情况下，将基因按照其对特征或者“模型”的预测效力的贡献从预测特征中除去，一直到只有预先选择的统计上显著的基因留下为止。在后者的情况下，基于统计学上接受的标准，将基因包括到预测性的特征中或从其中除去。除此之外，以及任选地，可以使用缩减方法来调整各个基因在给定的数据集中的权重，当数据集小的时候，优选该后者的程序，例如所述的数据集包括少于10个事件的时候，例如少于10个愈合的创伤时。
制造“精制的”试剂盒。在完成基因特征之后，我们基于所述的特征制造了试验试剂盒，首先配制全部用于测试基因的测试物质，并且然后自动地将其移取到96孔板中，所述的板准备好用于试验临床的和细胞的材料。所述的试剂盒是在实验室中制备的并于使用之前保存于-20oC下。
体外的创伤试验和验证研究
使用电子细胞传感(ECIS)监测愈合过程。
在此研究中，使用ECIS1600R型仪器和8W10阵列(AppliedBiophysicsInc,NJ,US)。将阵列表面使用半胱氨酸溶液处理之后，将所述的阵列使用完全培养基培养1小时。在各个孔中加入同样数量的肺癌细胞、HaCat、A431和HECV(每孔200,000个)(使用无细胞作为对照)。随后，将所述的细胞立即使用1600R型仪器中整合的上升场模块进行创伤(5v，每孔30秒)。在创伤之后立刻记录细胞阻抗的改变(400，4000和40000Hz)。将数据使用ECISRbA建模软件进行分析，所述的软件是由生产商提供的。在代表性的时间点，得到来自细胞的图像，从而证实细胞的愈合状态。
使用时间延迟的摄像法监测愈合的过程
为了确定在ECIS中及在刮擦创伤检测中所观察到的愈合过程，使用以下的两种方法，在时间延迟的影像中从形态学上监测创伤，所述的两种方法是电诱导的创伤和刮擦创伤检测。前者是基于ECIS模型，其中将融合的单层细胞用电创伤，并且对愈合(细胞向电极上的创伤空间中的迁移)进行监测(在创伤之前和之后)。后者基于使用精制的塑料刮刀刮擦单层的细胞，随后进行监测。所述的监测持续多达6小时，直到创伤闭合。
使用体外细胞模型进行验证研究
使用了人的内皮细胞，成纤维细胞，黑色素瘤细胞和角质细胞。使细胞或者细胞的混合物在6孔板中达到融合。随后，将其使用塑料刮刀进行创伤。在各个孔中产生多处创伤(20)。使受创伤的细胞层在1小时、2小时、4小时和7小时的时间内恢复，代表了研究中“急性的”(1和2小时)和“愈合的”(4和7小时)阶段(从图1中推知)。按照上文提取RNA并产生cDNA。在这些样品上测试创伤特征的表达谱。
统计学分析
使用Minitab，SPSS和在线的Chi-square服务工具(http://www.people.ku.edu/～preacher/chisq/chisq.htm)完成。
第1部分
创伤特征的鉴定
使用了34个人的组织，其包括14个慢性创伤组织，10个急性创伤组织和10个正常的皮肤。
3套基因特征得自：
WDsig-1:其具有25个基因的列表，所述的基因使得能够评估给定的创伤的命运，并且对治疗有指导(在表1中的基因列表)
WDsig-2:该精制的分子特征从WDsig-1中导出，并且具有14个基因的列表，其形成了第一个产物的最终列表，并且使得能够预测创伤的命运(在表2中的基因列表)。
WDsig-3:超精制的分子特征从WDsig-2中导出，并且具有4个基因的列表，其形成了第二个产物的最终列表，并且使得能够预测创伤的命运(在表2a中的基因列表)。
创伤特征和创伤的愈合
精制的分子特征WDsig-2使得能够清楚地将慢性创伤与急性创伤及正常的皮肤分开。
我们使用两套标准来区分创伤：
为了通过将慢性创伤与急性创伤及正常的皮肤以接近“0”的交叠区分开，从而预测创伤的特性，得到了计算谱(在此表示为A10)，所述的计算谱返回25.33(p＝0.00000316)的卡方值。预测了100％的慢性创伤和90％的急性创伤(表3)。
为了通过将慢性创伤与急性创伤以接近“0”的交叠区分开，从而预测创伤的特性，得到了计算谱(在此表示为AO123d)，所述的计算谱返回25.868(p＝0.00000268)的卡方值。预测了100％的慢性创伤和100％的急性创伤(表4)。
在表5中，我们显示了使用F5>5格式的数据分析，如何清楚地将急性创伤与慢性创伤区分开(表5)。精制的特征针对两种创伤的类型给出了清楚的区分(p＝0.00000676)。
在表6中，我们显示了如何将急性创伤与正常皮肤进行区分(表6a)以及将慢性创伤与正常皮肤进行区分(表6b)。如各个表中所显示的，精制的分子特征还使得正常皮肤和急性或者慢性创伤之间分别进行区分，尽管正常/慢性创伤的统计功效较小。
此外，使用WDsig-1的工作还使得能够清楚地区分慢性创伤、急性创伤和正常的皮肤。
我们使用两套标准来区分所述的创伤。
为了将急性创伤与慢性创伤和正常的皮肤分开，我们使用了两组形式(表7)。
为了将慢性创伤与急性创伤和正常的皮肤分开，我们还使用了三组形式(表8)。
使用体外创伤愈合模型验证特征
首先，使用ECIS和创伤检测进行验证，从而得到此项研究的最佳时间点，在所述的研究之后，使用所制造的精制分子特征试剂盒进行分析。
体外创伤模型和监测的点
该试验用于测定“急性的”和“慢性的/愈合的”阶段的合适的时间点。将细胞单层电创伤，并记录其愈合过程。如图1中所示的，在创伤后1-2.5小时，愈合过程处于其线性期中，因此代表了快速(急性的)愈合过程的最佳时间点。在3小时之后，所述的愈合过程达到了其稳定期，并因此代表了其“愈合的/稳定的”阶段。未创伤的细胞；选择2小时以及4小时来代表愈合的三个可能的阶段：未创伤急性的和愈合的。电信号完全地受到细胞形态学上的变化的支持(图2和图3).
A431细胞模型
创伤和监测的时间点。最初的验证是在可以反映人创伤的愈合特性的细胞模型上进行的：共培养的内皮细胞、成纤维细胞和表皮细胞。在此情况下，以HECV内皮细胞，MRC5成纤维细胞和A431黑素细胞的比例为20:10:100使其达到融合。将所述的细胞进行创伤。使其恢复1、2和4小时。我们将未创伤的单层作为非创伤的，创伤之后2小时作为急性创伤的，在此急性创伤阶段修复正处于最活跃的阶段，以及使用4小时作为接近完全愈合(随着创伤大部分闭合)。
精制的分子特征显示了在“急性的”阶段中表达谱的快速上升。表达特征返回到正常的“非创伤”的水平。如在随后的表中所示的，“体外创伤愈合”的表达谱和预测功效与在人伤口中所见的类似(p＝0.00000374，表9)。
HaCat细胞模型
与A431模型类似，在HaCaT细胞模型中观察到了类似的谱。角质细胞的迁移节奏更慢。愈合的阶段因此划分为急性的(3小时)和愈合的(6小时)。基因谱的改变导致未创伤的、急性的和愈合的之间的显著差别(p＝0.003887，表10)。
内皮细胞模型
使用内皮细胞创伤模型，也发现精制特征的变化具有高度显著性(表11)。
我们进一步地通过将HECV和MRC5细胞以5:1点板，采用了内皮细胞/成纤维细胞共培养模型。使用此细胞模型的创伤检测显示出类似的基因表达谱变化(表12)。
第2部分
使用基因特征进行验证研究
为了证实基因特征的有效性，以及所述的特征是否能够将慢性的愈合的创伤和慢性的非愈合性创伤分开，我们在独立的队列中测试了我们的14个基因特征，在此试验中包括了51例慢性的非愈合性创伤和20例慢性的愈合的创伤。
新鲜的冷冻创伤组织全部都是静脉溃疡的病因。其在就诊的时候活体取样(时间零点)，在此之后在我们的诊所中对患者进行治疗和定期随访。在最初的来访之后3个月内愈合的创伤被分类为“慢性愈合的”，并且在此时间区间内未愈合的分类为“慢性非愈合性的”。也记录了具有临床感染迹象的患者。在加工之前，对样品设盲，并且仅在最后的测试之后才进行解盲。
遗传材料如前文类似地进行提取。
对此独立的队列的测试基于14个基因特征，其使用如前所述的实时定量RT-PCR进行。
14个基因特征显著地将慢性愈合的与慢性非愈合性的创伤区分开。
对表6a中所显示的使用类似的双向划分，在98％(50/51)的具有非愈合性的创伤的患者中以及在40％(8/20)的慢性愈合性的创伤的患者中观察到非愈合性的特征(表13)。
对表6b中所显示的使用类似的三向划分，在慢性愈合的和慢性非愈合的创伤之间观察到类似的显著差别。以此方式，47％(24/51)的具有慢性非愈合性创伤的患者具有非愈合性特征，以及没有具有慢性愈合的创伤的患者具有非愈合性特征(表14)。
通过14个基因的特征区分愈合的和非愈合性的慢性创伤与感染的存在是独立的
在具有慢性的非愈合性创伤的51例患者中，7例具有感染的临床迹象。我们因此进一步地分析了该样品，以观察具有不同基因特征的样品之间的区别是否取决于感染的存在。没有感染迹象的44名患者中仅有1例患者具有愈合性的特征，44例患者中剩下的43例患者具有非愈合性的特征。所有那些具有感染的患者具有非愈合性的特征(7/7).这表明愈合性和非愈合性的预测与感染是独立的(表15)。
统计学分析：该分析如此前所描述。按照遗传特征将患者划分为“双向分组”或者“三向分组”。统计学检验是卡方检验。
4-基因特征显著地将慢性愈合的创伤与慢性非愈合性创伤区分开
对表6a中所显示的使用类似的双向划分，在90％(46/5)的具有非愈合性创伤的患者中，以及在35％(7/20)的具有慢性愈合性创伤的患者中观察到了非愈合性的特征(表16)。
讨论
本发明提供了两种新型的工具来区分非愈合性的慢性创伤，或者愈合性的慢性创伤。据信，在本文中所描述的分子特征是第一个从临床环境下得到的该特征。除此之外，使用体外细胞模型进行的验证研究显示了所述的特征在评估治愈过程中的有效性。
所述的特征的生物影响可以从各个特征的候选基因中得知。特征列表包括了涉及以下的簇：细胞迁移(ARP2、KAI1、CAR-1)、血管再生/淋巴管再生(VEGF-C、TEM-4、TEM7R)、基因转录调节(CREBL1)，免疫功能(IL-8RB、IL-22R,IL17BR)、细胞黏附行为调节(PTPRK、闭合蛋白-5)和涉及皮肤症状的基因(牛皮藓素)。列表的多样性和复杂性因此反映了在创伤的愈合过程中的复杂生物过程。
在独立队列的验证研究中，进一步揭示了我们的遗传学预后测试在预测创伤愈合的特性中的关键性应用。通过使用单一病因(静脉溃疡)的慢性创伤组织的此队列，以及双盲测试，测试清楚地将愈合的创伤与非愈合性的(3个月内)创伤区分开。综上所述，推断在此报道的基因特征在预测愈合的特性的临床结果(愈合或者成为慢性的)，以及愈合的长期结果(慢性的但是在3个月内愈合的，或者慢性的但是不能在3个月内愈合的(非愈合性的))中，提供关键的信息。
因此，临床应用是明显的。使用特征对给定的创伤组织进行测试能使得立刻区分该创伤的命运。
在此研究中，为了评估在人创伤中所见到的分子特征中的变化是否在体外有体现，我们采用体外创伤检测。我们使用两种模型来产生细胞创伤；从而得到愈合过程的动态。使用ECIS模型，ECIS示踪及形态学上的观察都表明在特定的条件下，创伤的愈合在创伤之后的0.5-3小时之间处于其线性期。在创伤之后的4小时，所述的创伤实际上闭合“愈合的”。这当然取决于细胞的类型，也即内皮细胞和黑色素瘤细胞的愈合比角质细胞节奏更快。这被传统的刮擦创伤测试(图1和2)完全地支持。使用此细胞模型，我们显示了在人的创伤中所观察到的特征可以在体外有体现。
总之，本发明描述了新的分子特征，所述的分子特征使得能够将人创伤的特性进行分类和预后：创伤最终是愈合性的或者将成为非愈合性的慢性创伤。
表-1.25个基因特征的列表
分子名称 在人创伤中的变化 ARP2 在慢性创伤中降低而在急性创伤中上升 VEGF-D 在慢性创伤中降低而在急性创伤中上升 IL17C 在慢性创伤中降低而在急性创伤中上升 VEGF-C 在慢性创伤中降低 beta-联蛋白 在慢性创伤中降低 RON 在慢性创伤中降低而在急性创伤中上升 Endomucin-2 在慢性创伤中降低 IL22R 在急性和慢性创伤中均上升 WAVE2 在急性中高 IL8RB 在慢性创伤中降低而在急性创伤中上升 闭合蛋白-5 在慢性创伤中降低而在急性创伤中上升 TEM7R 在急性和慢性创伤中均上升 PTPRK 在急性和慢性创伤中均上升 BMP15 在慢性创伤中降低 PEDF 在人创伤中下降 RhoGDI-G 在人创伤中下降 N-WASP 在慢性创伤中降低而在急性创伤中上升 AMFR 在急性中高 牛皮藓素 在急性和慢性创伤中均上升 Par4 在急性中高 TEM4 在急性中高 IL17BR 在慢性创伤中降低而在急性创伤中上升 KAI1 在急性和慢性创伤中均上升 CAR1 在慢性创伤中降低而在急性创伤中上升 CREBL1 在慢性创伤中降低而在急性创伤中上升
表-1b.用于25种基因特征列表的引物
表-2.14种基因精制的特征列表
ARP2
CREBL1
VEGF-C
牛皮藓素
IL22R
TEM4
IL8RB
IL17BR
闭合蛋白-5
KAI1
PTPRK
CAR1
Endomucin-2
TEM7R
表-2a.4种基因超精制的特征列表
ARP2
CREBL1
PTPRK
TEM7R
表-3.使用AO>10预测创伤愈合
(注:在纵向的栏中:1＝慢性的创伤；2-正常的皮肤,3＝急性的创伤；在横向的行中:0,1是特征的Id)
表-4.使用AO123d三套形式预测创伤愈合
(注:在纵向的栏中:1＝慢性的创伤；2-正常的皮肤,3＝急性的创伤；)在横向的行中:1，2，3是特征的Id)
表-5.使用精制的F5>5形式，将慢性与急性进行区分
(注:在纵向的栏中:1＝慢性的创伤；2-正常的皮肤,3＝急性的创伤；)在横向的行中:0,1是特征的Id)
表-6a.在双套形式(6a-1左,F5-5)和三套形式(右ao123)下，使用精制的特征将急性的与正常的皮肤区分开
(注:在纵向的栏中:1＝慢性的创伤；2-正常的皮肤,3＝急性的创伤；)在横向的行中:0,1是特征的Id)
表-6a1
表-6a2
表-6b.在双套形式(6b1,F2-8)或者三套形式(6b2bd123)下，使用精制的特征将慢性的与正常的皮肤区分开
(注:在纵向的栏中:1＝慢性的创伤；2-正常的皮肤,3＝急性的创伤；)在横向的行中:0，1，2，3是特征的Id)
表-6b1
表-6b2
表-7.使用特征All19的完整列表预测愈合性创伤
(注:在纵向的栏中:1＝慢性的创伤；2-正常的皮肤,3＝急性的创伤；)在横向的行中:0,1是特征的Id)
表-8.使用特征All19abc的完整列表预测愈合性的创伤
(注:在纵向的栏中:1＝慢性的创伤；2-正常的皮肤,3＝急性的创伤；)在横向的行中:1，2，3是特征的Id)
表-9.使用精制的特征试剂盒对于体外的创伤愈合进行的验证研究：A431/H/M模型.
表-10.使用精制的特征试剂盒对于体外的创伤愈合进行的验证研究:HaCaT模型.
表-11.使用精制的特征试剂盒对于体外的创伤愈合进行的验证研究:HECV内皮细胞模型(套-2).
表-12.使用精制的特征试剂盒对于体外的创伤愈合进行的验证研究:HECV-成纤维细胞模型(套-2).
表-13.14个基因的特征清楚地将慢性愈合的创伤与慢性非愈合性的创伤区分开(注：在纵向的列中：愈合的特性，在横向的行中，0，1是特征的ID)
表-14.按照14种基因的特征，三种方式分类的创伤清楚地将慢性愈合的创伤与慢性非愈合性的创伤区分开。(注：在纵向的列中：愈合的特性，在横向的行中：1＝非愈合性的特征,3＝愈合性的特征,2＝特征‘不确定’.
表-15.按照14种基因的特征，非愈合性的创伤的区分是不依赖于感染的(注：0＝非愈合性的特征，1＝愈合性的特征).
表-16.4种基因，PTPRK、Creb1、ARP2和TEM7R特征:
Fisher提取检验(在此情况下更为合适):p<0.001
卡方检验:卡方值＝20.03,p<0.001
附录-1
所测试的基因转录物、名称和登记号的列表
名称 登记号 Cyr61 AF307860 CCN2 NM_001901 CCN3 NM_002514 肌动蛋白 NM_001101 GAPDH NM_002046 ARP2 AF006082 TEM4 AF378754 IL8RB NM_001557 TEM8 NM_032208 TEM7R AF378757 WAVE1 AF134303 WAVE2 AB026542 NOTICH1 AF308602 AMFR L35233 IL8R U58828 CMG2 AY040326 IL17A NM_002190 PAR4 AB108448 IL17B NM_014443 BMP7 BC004248 CD24 BC064619 PlGF1 X54936 Chordinv2 AF209930 VEGF-D D89630 IL17BR AF212365 VEGF-R E13256
N-WASP D88460 HGFL NM_020998 RGMa NM_020211 VEGF-R2 AF063658 RGMc BC085604 IL13 U70981 BMP15 NM_005448 Kiss1R NM_032551 LYN BC068551 L1CAM M77640 VEGF E14233 CD49F NM_002203 RON NM_002447 闭合蛋白-5 NM_003277 BMP9 AF188285 CD34 M81104X60172 CMG1 AY040325 KAI1 U20770 OSP-C NM_001040060 SATB1 NM_002971 COM1 NM_012385 IL17C NM_013278 TEM1 XM_006495 IL4 M13982 OSPA NM_001040058 WAVE3 AB026543 TEM6 AF378756 PEDF M76979 BMP8 NM_181809 RHO GDI-G AF498928 JAK1 M64174M35203
AAMP M95627 SSTR1 L14865 SATB2 NM_015265 GDF9A NM_005260 SHH L38518 BMP10 NM_014482 CAR1 NM_001338 SDF1 XM_165565 PTPRK AF533875 ROCK1 D87931 EHM2 AB032179 IL24 BC009681 KISS1 AY117143 VEGF-C AF244813 Chordin V1 AF209929 STYK1 NM_018423 Chordin V3 AF283325 牛皮藓素 M86757 β-联蛋白 P35222 Endomucin-2 AB034695 SNAIL AF131208 RHO-C L25081 CREBL1 NM_004381 RHO-8 AF498969 IL22R BC029273 FAP U09278 DRIM NM_014503