技术领域
本发明涉及制备一种特异性位点生理活性多肽结合物的方法，更特别地涉及 一种通过将生理活性多肽和非肽基聚合物连接从而以高产率制备所述结合物的方 法。
背景技术
由于其低稳定性，肽类很容易变性，被蛋白酶体内降解，并由于其相对小的 尺寸而从肾脏中排泄出去。因此，为了以其活性形式维持肽药物在血液中的具体 浓度，需要频繁给予患者肽药物。然而，肽药物通常是以注射制剂形式给药的， 这种频繁给药引起患者的严重不适。为了解决此问题，已经开发了很多方法，例 如通过增加肽药物通过生物膜的渗透，经咽或经鼻吸入将肽药物转移的方法，通 过抑制酶促降解从而稳定肽，修饰对蛋白酶敏感的特定氨基酸序列(例如阻止由 二肽基肽酶引起的效价损失的GLP-1氨基酸序列)的方法，以及在肽的表面化学 添加一个高溶解度的非肽基聚合物，例如聚乙二醇(PEG)的方法。
PEG，已经被用作非肽基聚合物中的一种，它和靶向肽的一个特异性位点或多 个位点非特异性地结合，从而达到增加肽的分子量的效果，所得的PEG-肽复合物 耐受肾脏损失和酶水解，而无任何副作用。例如，国际专利公开文本WO 2006/076471描述了通过将用作充血性心力衰竭治疗剂的B-型利尿钠肽(BNP)和 PEG结合从而维持生理活性，美国专利US6,924,264描述了通过将PEG和其上 的赖氨酸残基结合而增加药物exendin-4的体内滞留时间。
这些方法通过增加PEG的分子量延长了肽的体内滞留时间，但是由于分子量 增加，肽药物的效价显著降低。此外，PEG的非特异性结合可能遮蔽生理活性多 肽的活性域从而显著降低多肽活性。
从而，需要开发一种改善的用于制备生理活性多肽和非肽基聚合物的结合物 的方法，其中聚合物以在不影响多肽活性的特异位点的方式和肽连接。
本发明人通过证实通过调节反应媒介的pH和醇含量以高产率制备出在特异 性位点连接有非肽基聚合物的生理活性多肽的结合物完成了本发明。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种高产率制备生理活性多肽结合物的方法， 在所述生理活性多肽结合物中非肽基聚合物在特异性位点和生理活性多肽相连 接。
与本发明的一个方面相一致，提供了一种制备特异性位点生理活性多肽结合 物的方法，包括步骤：i)将生理活性多肽和非肽基聚合物置于包含特定量的醇和 特定pH以使非肽基聚合物和生理活性多肽的靶向位点结合的反应媒介中进行反 应；ii)从步骤i)的反应混合物中使用醇并通过离子交换色谱分离和纯化生理活 性多肽结合物。
附图说明
当考虑到下文附带的附图时，下文对本发明的描述将使本发明的上述和其他 目的和特征变得明显，其各自如下：
图1：使用SOURCE S柱纯化DA-exendin-4-PEG的位置异构体的图谱；
图2：使用SOURCE S柱纯化CA-exendin-4-PEG的位置异构体的图谱；
图3：显示当在不同pH值下对CA-exendin-4聚乙二醇化时获得的第27位赖 氨酸聚乙二醇化的异构体的曲线图；
图4：显示当在45％乙醇中于不同pH值下对CA-exendin-4进行聚乙二醇化时 获得的第27位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的曲线图；
图5：显示当在不同量(％)乙醇中于7.5的pH值下对CA-exendin-4进行聚 乙二醇化时获得的第27位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的曲线图；
图6：显示当在不同量异丙醇(％)中于7.5的pH值下对CA-exendin-4进行 聚乙二醇化时获得的第27位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的曲线图；
图7：CA-exendin-PEG-免疫球蛋白Fc的SDS-PAGE分析；
图8：CA-exendin-PEG-第12位和第27位赖氨酸的SDS-PAGE分析；
图9：通过肽图分析的CA-exendin-4第12位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的分 析图谱；
图10：通过肽图分析的CA-exendin-4第27位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的 分析图谱；
图11：使用SOURCE S柱纯化胃泌酸调节素-PEG的位置异构体的图谱；
图12：使用SOURCE S柱纯化咪唑并-乙酰基胃泌酸调节素-PEG的位置异构 体的图谱；
图13：通过肽图分析的胃泌酸调节素的第30位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的 分析图谱；
图14：使用SOURCE Q柱纯化咪唑并-乙酰基胃泌酸调节素-PEG和免疫球蛋 白Fc的结合物的图谱；
图15：咪唑并-乙酰基胃泌酸调节素-PEG和免疫球蛋白Fc结合物的SDS-PAGE 分析；
图16：使用SOURCE S柱纯化胃泌酸调节素类似物-PEG的位置异构体的图 谱；
图17：通过肽图分析的胃泌酸调节素类似物的第27位赖氨酸聚乙二醇化的异 构体的分析图谱；
图18：使用SOURCE S柱纯化咪唑并-乙酰基胃泌酸调节素类似物-PEG的位 置异构体的图谱；
图19：通过肽图分析的咪唑并-乙酰基胃泌酸调节素类似物的第27位赖氨酸 聚乙二醇化的异构体的分析图谱；
图20：使用SOURCE Q柱纯化咪唑并-乙酰基胃泌酸调节素类似物-PEG和免 疫球蛋白Fc的结合物的图谱；
图21：咪唑并-乙酰基胃泌酸调节素类似物-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的 SDS-PAGE分析；
图22：使用SOURCE S柱纯化GLP-1-PEG的位置异构体的图谱；
图23：通过肽图分析的GLP-1的第34位赖氨酸-聚乙二醇化异构体的分析图 谱；
图24：使用SOURCE S柱纯化咪唑并-乙酰基-GLP-1-PEG的位置异构体的图 谱；
图25：通过肽图分析的咪唑并-乙酰基-GLP-1的第34位赖氨酸聚乙二醇化的 异构体的分析图谱
图26：使用SOURCE Phe柱纯化咪唑并-乙酰基-GLP-1-PEG和免疫球蛋白Fc 的结合物的图谱；
图27：咪唑并-乙酰基-GLP-1-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的SDS-PAGE分 析；
图28：使用SOURCE S柱纯化GLP-2-PEG的位置异构体的图谱；
图29：通过肽图分析的GLP-2的第30位赖氨酸聚乙二醇化的异构体的分析 图谱；
图30：使用SOURCE S柱纯化咪唑并-乙酰基-GLP-2-PEG的位置异构体的图 谱；
图31：使用SOURCE Phe柱纯化咪唑并-乙酰基-GLP-2-PEG和免疫球蛋白Fc 的结合物的图谱；
图32：咪唑并-乙酰基-GLP-2-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的SDS-PAGE分 析；
图33：使用SOURCE S柱纯化人类胰岛素-PEG(B1F)的位置异构体的图谱；
图34：使用SOURCE S柱纯化人类胰岛素-PEG(A1G)的位置异构体的图谱；
图35：使用SOURCE S柱纯化人类胰岛素-PEG(B29K)的位置异构体的图 谱；以及
图36：通过肽图分析的人类胰岛素的A1G-、B1F-或B29K-聚乙二醇化异构体 的分析图谱。
具体实施方式
下文中，将对本发明进行详细描述。
本发明提供了一种制备特异性位点生理活性多肽结合物的方法，包括步骤：
i)在包含特定量的醇和具有特定pH以使非肽基聚合物和生理活性多肽的靶 向位点结合的反应媒介中用非肽基聚合物处理生理活性多肽；并
ii)从步骤(i)的反应混合物中使用醇并通过离子交换色谱分离和纯化生理活 性多肽结合物。
基于本发明的生理活性多肽结合物指的是其中生理活性多肽和非肽基聚合物 的一个末端被共价地彼此连接的物质，且本发明的特征即在于将多肽和聚合物在 特定条件下连接，并将所得的具有在其靶向位点上连接的聚合物的多肽结合物分 离出来。
此处使用的术语“生理活性多肽或肽”指的是能够在体内显示生理活性的肽， 例如可以选自促胰岛素释放肽、血液因子、消化激素、促肾上腺皮质激素、甲状 腺激素、肠激素、细胞因子、酶、生长因子、神经肽、促垂体激素(hypophyseotropic hormone)、促垂体素(hypophysiotropic hormone)、抗肥胖肽、抗病毒肽，以及保 持生理活性性质的非天然肽衍生物，但不仅仅限于这些。更特别地，生理活性多 肽或肽选自促红细胞生成素、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、淀粉素、 胰高血糖素、胰岛素、生长激素抑制素、PPY(肽YY)、NPY(神经肽Y)、GLP-1、 GLP-2、exendin-4、胃泌酸调节素、饥饿激素(ghrelin)、血管紧张肽、血管舒缓 激肽、降钙素、促肾上腺皮质激素、唾液腺十一肽、胃泌素、瘦素、催产素、加 压素、LH(促黄体激素)、催乳激素、FSH(卵泡刺激素)、PTH(甲状旁腺激素)、 肠促胰液素、舍莫瑞林、hGH(人类生长激素)、生长激素释放肽、G-CSFs(粒细 胞集落刺激因子)、干扰素、白介素、催乳素释放肽、促食素、甲状腺释放肽、缩 胆囊素、胃泌素抑制肽、钙调蛋白、胃泌素释放肽、促胃动素、血管活性肠肽、 ANP(心房利钠肽)、BNP(脑钠肽)、CNP(C型利钠肽)、神经激肽A、神经介 肽、肾素、内皮素、角蝰毒素肽、酪啡肽、皮啡肽、强啡肽、内啡肽、蛋脑啡肽 (enkepalin)、T细胞因子、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子受体、尿激酶受体、肿 瘤抑制因子、胶原酶抑制剂、促胸腺生成素、胸腺九肽(thymulin)、胸腺五肽、 胸腺肽(tymosin)、胸腺体液因子、肾上腺髓质素、咽侧体抑制素、淀粉样β蛋白 片段、抗菌肽、抗氧化肽、铃蟾肽、骨钙素、CART肽、E-选择素、ICAM-1、VCAM-1、 白细胞激肽、kringle-5、层粘连蛋白、抑制素、甘丙肽、纤连蛋白、胰抑制素和恩 夫韦地。此外，生理活性多肽包括其前体、衍生物、片段或其变体。
本发明中使用的优选的生理活性多肽为exendin、胰岛素、GLP-1、GLP-2、胃 泌酸调节素、饥饿激素、血管紧张肽、缓激肽、降钙素或其衍生物。其衍生物可 以例如通过对氨基酸残基上的任何基团的化学取代(例如α-甲基化或α-羟基化)、 缺失(例如脱氨基或碳缺失)或修饰(例如N-甲基化)而制备，尤其是如韩国专 利申请No.2008-69234中详细描述的exendin衍生物的制备。
同时，此处使用的术语“非肽基聚合物”指的是包括由除肽键之外的共价键 连接彼此的两种或更多重复单元的生物可相容性聚合物。
可以用于本发明的非肽基聚合物可以选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇和丙 二醇的共聚物、聚氧乙基多醇(polyoxyethylated polyols)、聚乙烯醇、多糖、葡聚 糖、聚乙烯乙醚、生物可降解聚合物如PLA(聚(乳酸))和PLGA(聚乳乙醇酸)、 脂类聚合物、几丁质、透明质酸及其组合，且优选是聚乙二醇。本领域公知的或 基于本领域的技术可以容易制备出的衍生物也被包括在本发明的范围之内。可用 于本发明的非肽基聚合物功能是增加生理活性多肽的分子量从而阻止结合物通过 肾的流失。可以不受任何限制地使用任何非肽基聚合物，只要它能在体内耐受蛋 白酶。非肽基聚合物的分子量可以在0.5到100kDa的范围内，优选0.5到20kDa， 生理活性多肽和非肽基聚合物的适宜的摩尔比率可以选自1∶1到1∶50的范围。
本发明中使用的非肽基聚合物在一个末端或在两个末端具有反应基团。对于 在两个末端均具有反应基团的非肽基聚合物，它可以和生理活性载体以及帮助作 为长效制剂功能的蛋白药物结合。
非肽基聚合物的一个末端或两个末端的反应基团优选选自活性醛基、丙醛基、 丁醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺基。琥珀酰亚胺基的实例包括琥珀酰亚胺基 丙酸酯、琥珀酰亚胺基丁酸酯、羟基琥珀酰亚胺、羧甲基琥珀酰亚胺或琥珀酰亚 胺碳酸酯。尤其是，当非肽基聚合物在一个末端具有一个活性醛基或活性琥珀酰 亚胺基团时，它可有效地以最低的非特异性反应在两端和生理活性多肽和免疫球 蛋白连接。在低pH值下，醛基活性基团选择性地和N-末端结合，并能在高pH值 例如9.0的pH值下和赖氨酸残基结合从而形成胺键。此外，琥珀酰亚胺反应基团 能够在pH 7.0～9.0下和氨基末端或赖氨酸残基形成稳定的酰胺键。
进而，在非肽基聚合物两端的活性基团可以是相同的或不同的。当在其两端 均具有活性羟基的聚乙二醇用作非肽基聚合物时，可以使用已知的化学反应将羟 基活化成各种活性基团，或可使用可以商购的具有修饰的活性基团的聚乙二醇。
本发明的步骤(i)是为了在适宜反应媒介中通过使非肽基聚合物和生理活性 多肽通过特异性位点连接从而制备出生理活性多肽结合物。
此处使用的术语“位点特异的”或“位点特异地”指的是使非肽基聚合物连 接到生理活性多肽的特异的靶向氨基酸位点，优选赖氨酸残基或N-末端的胺基上。 特异性位点连接或结合可以阻止形成非肽基聚合物连接到生理重要的氨基酸残基 上的随机结合。例如，当非肽基聚合物和exendin-4的N-末端结合时，exendin-4 的体外活性变低，但当非肽基聚合物和赖氨酸残基结合时，体外活性得以保持。 尤其是，当非肽基聚合物和第27位赖氨酸残基而非第12位赖氨酸残基结合时， 观测到更高的体外活性(参见实施例10和表2)。
本发明人发现在步骤i)中反应媒介中醇的存在和反应媒介的pH值是非肽基 聚合物和生理活性多肽的特异性位点结合的关键因素。因此，在本发明的步骤i) 中，通过使用含有特定含量的醇和特定pH值的反应媒介使非肽基聚合物和生理活 性多肽的特异性位点连接。
在本发明的一个具体实施方式中，多肽结合物的特异性位置异构体的比率基 于反应媒介的pH值，或基于在相同pH值下的醇浓度(％)而变化。因此使非肽 基聚合物以特异性位点方式连接到生理活性多肽的期望的氨基酸上成为可能。
即，本发明的步骤i)在特定pH值下进行，从而使非肽基聚合物能够和期望 的(或靶向)位点也就是不影响多肽活性的位点结合。pH值范围可能依赖于生理 活性多肽的类型。例如，对于促胰岛素释放肽(例如exendin-4)，在反应媒介处于 低pH值下，观测到主要是聚合物和第12位赖氨酸连接的异构体，然而在反应媒 介处于高pH值下，观测到主要是不影响促胰岛素释放活性的聚合物和第27位赖 氨酸连接的异构体(参见实施例3和图3)。从而，步骤i)优选于pH值7.5到9.0 之间进行，从而使非肽基聚合物选择性地和第27位赖氨酸连接。
进而，本发明的步骤i)在包含醇的反应媒介中进行，从而使非肽基聚合物能 够结合到不影响多肽活性的位点。醇的实例包括伯醇、仲醇和叔醇，优选具有1 到10个碳原子的醇，更优选乙醇或异丙醇。对于促胰岛素释放肽(例如exendin-4)， 为了使非肽基聚合物能结合到不影响促胰岛素释放活性的第27位赖氨酸上，反应 媒介中的醇含量范围可以是基于反应媒介的总体积，从体积份为0.1％到100％，优 选从25％到90％，更优选从35％到60％。
在本发明的一个具体实施方式中，当生理活性多肽是exendin-4或其衍生物时， 步骤i)中使用的pH值可以是7.0到10.0，以增加非肽基聚合物结合到第27位赖 氨酸的比例。在本发明的另一个具体实施方式中，当生理活性多肽是降钙素时， 步骤i)中使用的pH值可以是4.0到6.0，以增加非肽基聚合物结合到N-末端的比 例。在本发明的另一个具体实施方式中，当生理活性多肽是胃泌酸调节素或其衍 生物时，步骤i)中使用的pH值可以是7.0到10.0，以增加非肽基聚合物结合到 第27位赖氨酸或第30位赖氨酸的比例。在本发明的另一个具体实施方式中，当 生理活性多肽是人胰岛素或其衍生物时，步骤i)中使用的pH值可以是4.0到6.0， 以增加非肽基聚合物结合到B链中Phe1(1位苯丙氨酸)N-末端的比例。在本发 明的另一个具体实施方式中，当生理活性多肽是人胰岛素或其衍生物时，步骤i) 中使用的pH值可以是7.0到10.0，以增加非肽基聚合物结合到A链中Gly1(1位 甘氨酸)N-末端，或B链中Lys29(第29位赖氨酸)的比例。在本发明的另一个 具体实施方式中，当生理活性多肽是GLP-1或其衍生物时，步骤i)中使用的pH 值可以是7.0到10.0，以增加非肽基聚合物结合到第34位赖氨酸的比例。在本发 明的另一个具体实施方式中，当生理活性多肽是GLP-2或其衍生物时，步骤i)中 使用的pH值可以是7.0到10.0，以增加非肽基聚合物结合到第30位赖氨酸的比 例。
从而，本发明的优选的特异性位点生理活性多肽结合物是将PEG连接到第27 位赖氨酸上的exendin-4结合物、将PEG连接到N-末端的降钙素结合物、将PEG 连接到第27位赖氨酸或第30位赖氨酸上的胃泌酸调节素结合物或其类似物、将 PEG连接到B链的Phe1的N-末端、A链的Gly1的N-末端、或B链的第29位赖 氨酸的人类胰岛素结合物或其类似物，或将PEG连接到第34位赖氨酸或第30位 赖氨酸的GLP-1或GLP-2结合物。
在本发明的一个优选方面中，可以使用一种肽衍生物(或类似物)来促进非 肽基聚合物和生理活性多肽之间的特异性位点键合。衍生物指的是具有任何其他 删除的或保护的非靶向氨基酸位点以防止不期望的连接。例如，对于促胰岛素释 放肽例如exendin，可以使用各种exendin衍生物，例如式(I)的脱-氨基-组氨酰 基(DA)-exendin-4(Des-amino-histidyl(DA)-exendin-4)、式(II)的β-羟基-咪 唑丙酰基(HY)-exendin-4、式(III)的咪唑并乙酰基-exendin-4 (Imidazoacetyl(CA)-exendin-4)，以及式(IV)的二甲基-组氨酰基-exendin-4 (Dimethyl-histidyl(DM)-exendin-4)，使用但并不仅限于如下方法制备它们：其中 N-末端氨基酸，组氨酸的α-胺基被缺失，N-末端胺基被羟基取代、组氨酸的N-末 端α-胺基用二个甲基修饰，或者N-末端组氨酸的α-碳和其上结合的胺基被缺失从 而留下咪唑并乙酰基。这样的实例性的exendin衍生物的结构和其制备方法记载在 韩国未审查的专利公报No.2009-0008151中，通过引用其被包括在本发明的范围 内。
类似地，具有以组氨酸作为第1位氨基酸的胃泌酸调节素、GLP-1和GLP-2 也可以用做具有选自式(I)到式(IV)的任意结构的衍生物。
在本发明的一个特别的具体实施方式中，本发明人研究了反应媒介的pH和醇 含量(％)对非肽基聚合物的特异性位点结合方面的影响，并证实了具有于第12 位赖氨酸/第27位赖氨酸连接的聚合物的促胰岛素释放肽结合物的比例特别依赖 于pH和乙醇或异丙醇的含量的变化而变化。尤其是，当在pH 7.5使用35％到55％， 更优选约45％的乙醇或异丙醇含量时，大量获得更优选的具有和第27位赖氨酸残 基结合的非肽基聚合物的异构体。
在步骤i)中通过调整到特定pH值和醇含量而增加期望的非肽基聚合物-生理 活性多肽结合物的比例之后，可以通过使用步骤ii)中的醇并通过离子交换色谱将 期望的结合物分离和纯化出来。
步骤ii)中使用的醇存在于纯化溶液中，其具体例子和步骤i)中确定的相同。 然而，步骤i)中使用的醇是为了通过对其二级结构或三级结构进行修饰而增加多 肽反应性和位点特异性的目的，而步骤ii)中使用的醇是为了通过降低在离子交换 柱和结合物之间的非特异性键而促进特异性位点生理活性多肽结合物高通量分离 和纯化的目的。分离和纯化可以使用各种本领域技术人员公知的方法进行，优选 通过离子交换色谱，更优选地通过高压离子交换色谱。
同时，为了促进位置异构体的分离和纯化，可以使离子交换色谱在特定pH值 下进行。对pH进行适宜地调整，从而增加步骤i)中结合物的位点特异性，反之 将其重新调整从而使结合物吸附到步骤ii)中的包含醇的纯化溶液中的离子交换柱 上并从其上分离。步骤ii)中使用的适宜pH值可以在从约2.0到约6.0的范围内。
进而，本发明的生理活性多肽可以进一步和生理活性载体连接。在这种情况 下，非肽基聚合物应当是具有双末端的非肽基聚合物，以和生理活性载体结合。 即，生理活性载体和未与生理活性多肽共价连接的非肽基聚合物的一个末端共价 结合，因此能够制备出一种非肽基聚合物两端和生理活性多肽和生理活性载体连 接的结合物。
如上所述，步骤ii)中制备出来的生理活性多肽结合物可以进一步和生理活性 载体结合，所得的多肽-聚合物-载体结合物显示出与多肽-聚合物结合物完全不同 的活性，也就是，优异的生理活性例如生理活性多肽药效出色的延长的持续时间、 对特异性位点例如待处理的病变或坏死的诱导的靶向。
此处使用的术语“生理活性载体”指的是显示出不同于天然多肽的生理活性 的额外活性的生理活性物质，它能通过和非肽基聚合物以及生理活性多肽的结合 维持多肽的生理活性例如药效，或诱导对特异位点或坏死部位的诱导靶向。
本发明使用的生理活性载体不受任何限制地包括具有前述活性的物质，例如 白蛋白、免疫球蛋白Fc区域、转铁蛋白、适配子、毒素、胶原蛋白、葡聚糖、多 糖、脂肪酸、纤维蛋白原等。优选地，生理活性载体可选自白蛋白、免疫球蛋白 Fc区域和转铁蛋白，更优选地是免疫球蛋白Fc区域。
本发明的免疫球蛋白Fc区域指的是免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重 链恒定区3(CH3)，不包括重链和轻链的可变区、重链恒定区1(CH1)和轻链恒 定区1(CL1)。其还可进一步包括重链恒定区的铰链区。另外，本发明的免疫球 蛋白Fc区域可以是一个包含Fc区域的一部分或全部的延伸形式，包括重量恒定 区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)，不包括重链和轻链可变区，只要其具有 大致相同于天然免疫球蛋白Fc或比其更好的生理功能，可以包括由磷酸化、硫酸 化、酰化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等修饰的免疫球蛋白Fc 区域。免疫球蛋白Fc的范围、其制备方法以及使免疫球蛋白Fc和非肽基聚合物- 生理活性多肽结合物共价连接的方法公开于韩国专利No.775343、725314、725315 和824505，其被通过引用包括在本专利的范围之内。
根据本发明的方法，可以通过非肽基聚合物和生理活性多肽的特定氨基酸的 特异性位点连接以高产率制备出期望的具有优异生理活性的多肽结合物，同时使 其他结合物的形成最小化。
下列实施例被用来进一步阐释本发明但并非用以限定其范围。
实施例1：聚乙二醇化DA-exendin-4(第27位赖氨酸)结合物的制备和分离
<1-1>聚乙二醇化DA-exendin-4(第27位赖氨酸)结合物的制备
为了通过多肽中的赖氨酸和PEG共价连接制备聚乙二醇化肽结合物，使脱氨 基组氨酰-exendin-4(DA-exendin-4，AP，U.S.)和3.4K的PropionALD(2)PEG(具有两 个丙醛基的PEG，IDB Inc.，韩国)以1∶30的摩尔比在4℃反应12小时，其中肽的 浓度为3mg/mL。同时，使用包含45％异丙醇的100mM HEPES缓冲液(pH 7.5)作 为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<1-2>位置异构体的分离
从实施例<1-1>中的反应混合物中使用SOURCE Q离子交换色谱(XK 16mL， GE healthcare，韩国)在下述条件下初步纯化单-聚乙二醇化肽，使用SOURCE S 离子交换色谱(XK 16mL，GE healthcare，韩国)在下述条件下分离位置异构体。 在此过程中，通过将乙醇包含在纯化溶液中，使用乙醇来促进异构体的分离。通 过肽图的方法从洗脱峰证实聚乙二醇化的位点。
柱：SOURCE Q
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM Tris，pH 8.5)和B(A+0.5M NaCl)；梯度A 0→40％，80min
柱：SOURCE S
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM柠檬酸，pH 3.0+45％乙醇)和B(A+45％乙醇+0.5M KCl)；梯度A 0→100％，45min
从位置异构体的纯化图谱分析发现，第12位赖氨酸聚乙二醇化的 DA-exendin-4的峰较早洗脱，然后在最后部分洗脱的是第27位赖氨酸聚乙二醇化 的峰(图1)。
实施例2：聚乙二醇化CA-exendin-4(第27位赖氨酸)结合物的制备和分离
重复实施例1中的程序，除了使用咪唑并-乙酰基-exendin-4(CA-exendin-4， Bachem，美国)代替实施例1中的DA-exendin-4，以获得聚乙二醇化CA-exendin-4 (第27位赖氨酸)结合物。从位置异构体的纯化图谱分析发现第12位赖氨酸聚乙 二醇化的CA-exendin-4的峰较早洗脱，然后在最后部分洗脱的是第27位赖氨酸聚 乙二醇化的峰(图2)。
实施例3：聚乙二醇化CA-exendin-4(第27位赖氨酸)结合物比例基于反应媒 介pH值的变化
为了研究由pH而导致的在特定位点上聚乙二醇化多肽的比例变化，使 CA-exendin-4和3.4K的PropionALD(2)PEG以1∶30的摩尔比在4℃通过使肽和 PEG反应12小时而聚乙二醇化，其中肽的浓度为3mg/mL。同时，分别使用100mM 柠檬酸(pH 3.0)、100mM NaOAc(pH 4.5)、100mM Na-P(pH 7.5)、100mM Na-P (pH 8.5)、100mM HEPES(pH 8.0)和100mM硼酸钠(pH 9.2)的缓冲液作为反应媒 介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。每种反应混合物都是用实施例1 中描述的方法进行纯化，然后分析第27位赖氨酸-聚乙二醇化结合物的比例。如图 3中所示，第27位赖氨酸-聚乙二醇化结合物的比例基于pH值的增加而增加，证 实最适宜的pH值为7.0到10.0。
实施例4：聚乙二醇化CA-exendin-4(第27位赖氨酸)结合物比例基于包含乙醇 的反应媒介pH值的变化
为了研究由乙醇和pH值导致的在特定位点上聚乙二醇化的多肽比例变化，使 CA-exendin-4和3.4K的PropionALD(2)PEG以1∶30的摩尔比在4℃通过使多肽 和PEG反应12小时而聚乙二醇化，其中肽的浓度为3mg/mL。同时，分别使用100 mM柠檬酸(pH 3.0)/45％乙醇、100mM NaOAc(pH 4.5)/45％乙醇、100mM Na-P (pH 7.5)/45％乙醇、100mM HEPES(pH 8.0)/45％乙醇和100mM Na-P(pH 8.5)/45％ 乙醇的缓冲液作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。每种 反应混合物都是用实施例1中描述的方法进行纯化，然后分析第27位赖氨酸聚乙 二醇化的结合物的比例。如图4中所示，第27位赖氨酸聚乙二醇化的结合物的比 例基于包含45％乙醇的反应媒介的pH值的增加而增加，证实最适宜的pH值为7.0 到9.0。
实施例5：聚乙二醇化CA-exendin-4(第27位赖氨酸)结合物比例基于反应媒 介中乙醇浓度的变化
为了研究反应媒介中乙醇浓度导致的在特定位点上聚乙二醇化的多肽比例变 化，使CA-exendin-4和3.4K的PropionALD(2)PEG以1∶30的摩尔比在4℃通过 使多肽和PEG反应12小时而聚乙二醇化，其中肽的浓度为3mg/mL。同时，分别 使用100mM HEPES(pH 7.5)/0％乙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/25％乙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/35％乙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/45％乙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/55％乙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/75％乙醇和100mM HEPES(pH 7.5)/90％ 乙醇的缓冲液作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。每种 反应混合物都是用实施例1中描述的方法进行纯化，然后分析第27位赖氨酸聚乙 二醇化的结合物的比例。如图5中所示，第27位赖氨酸聚乙二醇化的结合物的比 例直至乙醇含量达到约50％时都增加，而当乙醇超过50％后开始降低，证实乙醇 最适宜的量是35％到60％。
实施例6：聚乙二醇化CA-exendin-4(第27位赖氨酸)结合物比例基于反应媒 介中异丙醇浓度的变化
为了研究在反应媒介中使用异丙醇代替乙醇导致的在特定位点上聚乙二醇化 的多肽比例变化，使CA-exendin-4和3.4K的PropionALD(2)PEG以1∶30的摩尔 比在4℃通过使多肽和PEG反应12小时而聚乙二醇化，其中肽的浓度为3mg/mL。 同时，分别使用100mM HEPES(pH 7.5)/0％异丙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/30％ 异丙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/45％异丙醇、100mM HEPES(pH 7.5)/60％异丙 醇的缓冲液作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。每种反 应混合物都是用实施例1中描述的方法进行纯化，然后分析第27位赖氨酸聚乙二 醇化的结合物的比例。如图6中所示，第27位赖氨酸聚乙二醇化的结合物的比例 直至乙醇含量达到约50％时仍增加，而当乙醇超过50％后开始降低，证实乙醇最 适宜的量是35％到60％。
实施例7：CA-exendin-4(第27位赖氨酸)-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的制 备
结合物和片段以1∶8的摩尔比在4℃下进行反应16小时，其中肽的浓度为 20mg/mL，从而使CA-exendin-4(第27位赖氨酸)-PEG和免疫球蛋白Fc片段(Hanmi Pharm.Co.Ltd.，韩国)相结合。同时，使用100mM K-P缓冲液(pH 6.0)作为反应媒 介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。在结合反应后，使用SOURCE phe 和SOURCE Q柱基于下述条件进行两步纯化。
柱：SOURCE Phe(XK 16mL，GE healthcare)
流速：2.0mL/min
洗脱溶液：A(20mM Tris，pH 7.5)和B(A+1.5M NaCl)；梯度A 0→40％，80min
柱：SOURCE Q(XK 16mL，GE healthcare)
流速：2.0mL/min
洗脱溶液：A(20mM Tris，pH 7.5)和B(A+1.5M NaCl)；梯度A 0→40％，80min
使用SDS-PAGE分析上面制备的结合物。如图7所示，在非还原性条件下观 察到一条单独的60K的带，而在还原性条件下观察到35K和25K的两条带。
实施例8：CA-exendin-4(第27位赖氨酸)-PEG结合物的聚乙二醇化位点的鉴 别
为了鉴别PEG和CA-exendin-4的结合位点，使用赖氨酸-C蛋白酶消化 CA-exendin-4(第27位赖氨酸)-PEG结合物，使用反相色谱分析。
特别地，使用SDS-PAGE分析CA-exendin-4-PEG异构体(图8)，然后将纯化 的CA-exendin-4-PEG结合物和CA-exendin-4溶解于三乙胺-盐酸缓冲液(10mmol/L； pH 7.5)，向其中加入10μL的酶(0.1mg/mL)，在37℃下反应4小时。反应终止后， 利用反相色谱(HPLC(Agilent)，Jupiter C18(Phenomenex))分析反应混合物。分析结 果显示于图9和图10。如图9中所显示，#1和#2的同时消失证实了第12位赖氨 酸聚乙二醇化的CA-exendin-4异构体，并如图10中所显示，#2和#3的同时消失 证实了第27位赖氨酸聚乙二醇化的CA-exendin-4异构体。
实施例9：利用异丙醇浓度鉴别在N-末端聚乙二醇化的聚乙二醇化产率的
为了使甲氧基聚乙二醇5K ALD(NOF Inc.，日本)聚乙二醇化到鲑鱼降钙素 (Bachem，美国)的N-末端，使鲑鱼降钙素和PEG以1∶1的摩尔比在4℃下进行反 应1小时进行聚乙二醇化，其中肽的浓度为1mg/mL。同时，分别使用100mM NaAc pH 5.2/0％异丙醇、100mM NaAc pH 5.2/45％异丙醇的缓冲液作为反应媒介，将 20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。使用SOURCE S柱(XK 16mL，GE healthcare，韩国)在下述条件下纯化每种反应混合物的单-聚乙二醇化肽。结果显示 于下表1。
柱：SOURCE S
流速：2.5mL/min
洗脱液：A(20mM醋酸盐，pH 5.2)and B(A+1M NaCl)；梯度A 0→40％，60 min
<表1>
反应缓冲液 单-聚乙二醇化降钙素-5K的产率(％) 0.1M NaAc pH 5.2 36 0.1M NaAc pH 5.2/45％ IPA 51.3
如表1中所示，通过添加异丙醇增加了聚乙二醇化降钙素的产率。
实施例10：通过聚乙二醇化和聚乙二醇化位点测量exendin-4体外活性
为了测量通过聚乙二醇化和聚乙二醇位点制备的exendin-4长效制剂的功效， 使用了测量体外活性的方法。GLP-1的体外活性的测量是一种经过将GLP-1处理 到克隆了GLP-1受体的CHO细胞系上后，测量细胞内cAMP’s是否增加的方法。
特定地，用GLP-1、exendin-4和表1中描述的测试材料在不同浓度下处理 CHO/GLP-1R-一种其中克隆了GLP-1的细胞系。测量到产生了cAMP’s，从而比 较彼此的EC50值。作为对照，使用商购的Byetta(Eli Lilly)。基于测试材料处理的 体外活性(％)显示于表2。
<表2>
如表2中所示，当PEG修饰位于第27位赖氨酸时，相对于第12位赖氨酸， 肽的生理活性较少受到影响。
实施例11：聚乙二醇化胃泌酸调节素(第30位赖氨酸)结合物的制备和分离
<11-1>聚乙二醇化胃泌酸调节素(第30位赖氨酸)结合物的制备
为了制备聚乙二醇化胃泌酸调节素结合物，3.4K的PropionALD(2)PEG和胃 泌酸调节素(Anygen，韩国)通过使肽和PEG以1∶15的摩尔比在4℃反应4.5小时 聚乙二醇化，其中肽的浓度为3mg/mL。同时，使用包含45％异丙醇的100mM硼 酸钠缓冲液(pH 9.0)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<11-2>位置异构体的分离
使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)从反应混合物中纯化 第30位赖氨酸聚乙二醇化的位置异构体。在此过程中，在纯化溶液中使用乙醇从 而促进异构体的分离(图11)。
柱：SOURCE S
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM柠檬酸钠，pH 3.0+45％乙醇)和B(A+1M KCl)；梯度A 0→3％，1min，梯度B 0→40％，222min
实施例12：聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素(第30位赖氨酸)结合 物的制备和分离
除了使用咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素(Anygen，韩国)代替胃泌酸调节素并使 用实施例11中的包含45％异丙醇的100mM HEPES缓冲液(pH 7.5)之外，重复实 施例11的程序，从而获得聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素(第30位赖氨 酸)结合物。
使用SOURCE Q柱纯化的异构体显示于图12，使用Asp-N蛋白酶进行的肽图 分析显示于图13。如图13所示，通过在第30位赖氨酸的PEG-修饰，一部分 #4：Asp(22)-(37)消失了。
实施例13：咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素(第30位赖氨酸)-PEG和免疫球 蛋白Fc结合物的制备
使咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素-PEG(第30位赖氨酸)结合物和免疫球蛋白 Fc(Hanmi Pharm.Co.Ltd.，韩国)以1∶10的摩尔比在4℃反应16小时，总蛋白浓 度为20mg/mL。同时，使用100mM磷酸钾(pH 6.0)作为反应媒介，将20mM的 NaCNBH3作为还原剂加入其中。反应终止后，使用SOURCE 15Q柱在下述条件下 纯化反应混合物。
柱：SOURCE Q
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM Tris-HCl，pH 7.5)和B(A+1M NaCl)；梯度A 0→20％，100 min
通过第30位赖氨酸-聚乙二醇化的CA-胃泌酸调节素和免疫球蛋白Fc的连接 和使用SOURCE Q纯化结合物得到的色谱图显示于图14，CA-胃泌酸调节素(第 30位赖氨酸)-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的SDS-PAGE结果显示于图15。如 图15所示，在非还原性条件下观察到60K的单带，而在还原性条件下观察到35K 和25K的两条带。
实施例14：聚乙二醇化胃泌酸调节素类似物(第27位赖氨酸)结合物的制备 和分离
<14-1>聚乙二醇化胃泌酸调节素类似物(第27位赖氨酸)结合物的制备
为了使3.4K的PropionALD(2)PEG聚乙二醇化到胃泌酸调节素类似物([20Asp， 24Ala，28Ser]-胃泌酸调节素-[缺失30-37])的赖氨酸上，使PEG和胃泌酸调节素类 似物(Anygen，韩国)以1∶15的摩尔比在4℃下进行反应3.5小时，其中肽的浓度 为3mg/mL。同时，使用包含45％异丙醇的100mM硼酸钠缓冲液(pH 9.0)作为反 应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<14-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化 第27位赖氨酸聚乙二醇化的位置异构体。纯化和分离条件与实施例11中描述的 相同。在该过程中，在纯化溶液中使用乙醇以促进异构体的分离(图16)。使用 Lys-C蛋白酶通过肽图分析的方法证实了纯化的单-聚乙二醇化胃泌酸调节素类似 物的赖氨酸选择性(图17)。如图17中所示，通过在第27位赖氨酸的PEG修饰， #2部分消失了。
实施例15：聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素类似物(第27位赖氨酸) 结合物的制备和分离
<15-1>聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素类似物(第27位赖氨酸)结合 物的制备
为了使3.4K的PropionALD(2)PEG聚乙二醇化到咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节 素类似物([20Asp，24Ala，28Ser]-胃泌酸调节素-[缺失30-37])的第27位赖氨酸上， 使咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素类似物(Anygen，韩国)和PEG以1∶10的摩尔比在 4℃下进行反应2.5小时，其中总蛋白浓度为3mg/mL。同时，使用包含45％异丙 醇的100mM HEPES(pH 7.5)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加 入其中。
<15-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化 第27位赖氨酸-聚乙二醇化位置异构体。纯化和分离条件与实施例11中描述的相 同。在该过程中，在纯化溶液中使用乙醇以促进异构体的分离(图18)。使用Lys-C 蛋白酶通过肽图分析的方法证实了纯化的单-聚乙二醇化胃泌酸调节素类似物的赖 氨酸选择性(图19)。如图19中所示，通过在第27位赖氨酸的PEG修饰，#2部 分消失了。
实施例16：聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-胃泌酸调节素类似物(第27位赖氨酸) 和免疫球蛋白Fc结合物的制备和分离
使实施例15中制备得到的第27位赖氨酸聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-胃泌酸调 节素类似物-PEG和免疫球蛋白Fc以1∶10的摩尔比在4℃反应16小时，肽浓度 为20mg/mL。同时，使用100mM磷酸钾(pH 6.0)作为反应媒介，将20mM的 NaCNBH3作为还原剂加入其中。反应终止后，使用SOURCE 15Q柱在下述条件下 纯化反应混合物。
柱：SOURCE Q
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM Tris-HCl，pH 7.5)和B(A+1M NaCl)；梯度A 0→20％，100 min
通过第27位赖氨酸-聚乙二醇化的CA-胃泌酸调节素类似物和免疫球蛋白Fc 的连接以及使用SOURCE Q纯化该结合物所得到的色谱图显示于图20，CA-胃泌 酸调节素类似物(第27位赖氨酸)-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的SDS-PAGE结 果显示于图21。如图21所示，在非还原性条件下观察到60K的单带，而在还原 性条件下观察到35K和25K的两条带。
实施例17：聚乙二醇化GLP-1(第34位赖氨酸)结合物的制备和分离
<17-1>聚乙二醇化GLP-1(第34位赖氨酸)结合物的制备
为了使3.4K的PropionALD(2)PEG聚乙二醇化到GLP-1的赖氨酸残基上，使 GLP-1和PEG以1∶15的摩尔比在4℃下进行反应3.5小时，其中总蛋白浓度为 3mg/mL。同时，使用包含45％异丙醇的100mM硼酸钠(pH 9.0)作为反应媒介， 将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<17-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化 第34位赖氨酸聚乙二醇化的位置异构体。在该过程中，在纯化溶液中使用乙醇以 促进异构体的分离(图22)。使用Lys-C蛋白酶通过肽图分析的方法证实了纯化的 单-聚乙二醇化胃泌酸调节素类似物的赖氨酸选择性(图23)。
柱：SOURCE S
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM柠檬酸钠，pH 3.0+45％乙醇)和B(A+1M KCl)；梯度A 0→3％，1min，梯度B 3→40％，150min
如图23中所示，通过在第34位赖氨酸的PEG修饰，#2部分消失了。
实施例18：聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-GLP-1(第34位赖氨酸)结合物的制 备和分离
<18-1>聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-GLP-1(第34位赖氨酸)结合物的制备
为了使3.4K的PropionALD(2)PEG聚乙二醇化到咪唑并-乙酰基GLP-1的赖 氨酸残基上，使咪唑并-乙酰基GLP-1和PEG以1∶10的摩尔比在4℃下进行反应 4小时，其中总蛋白浓度为3mg/mL。同时，使用包含45％异丙醇的100mM HEPES (pH 7.5)作为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<18-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化 第34位赖氨酸-聚乙二醇化位置异构体。在该过程中，在纯化溶液中使用乙醇以促 进异构体的分离(图24)。使用Glu-C蛋白酶通过肽图分析的方法证实了纯化的单 -聚乙二醇化胃泌酸调节素类似物的赖氨酸选择性(图25)。
柱：SOURCE S
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM柠檬酸钠，pH 3.0+45％乙醇)和B(A+1M KCl)；梯度A 0→3％，1min，梯度B 3→40％，150min
如图25中所示，通过在第34位赖氨酸的PEG修饰，#4部分消失了。
实施例19：聚乙二醇化咪唑并-乙酰基-GLP-1(第34位赖氨酸)和免疫球蛋白 Fc结合物的制备和分离
使实施例18中制备得到的第34位赖氨酸聚乙二醇化的咪唑并-乙酰基 -GLP1-PEG和免疫球蛋白Fc以1∶8的摩尔比在4℃反应17小时，肽浓度为 50mg/mL。同时，使用100mM磷酸钾(pH 6.0)作为反应媒介，将20mM的 NaCNBH3作为还原剂加入其中。反应终止后，利用SOURCE Phe柱在下述条件下 纯化反应混合物。
柱：SOURCE Phe
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM Tris-HCl，pH 7.5)和B(A+1M NaCl)；梯度A 100→0％，100 min
通过第34位赖氨酸聚乙二醇化的CA-GLP-1异构体和免疫球蛋白Fc的连接 以及使用SOURCE Phe纯化该结合物所得到的色谱图显示于图26，CA-GLP-1(第 34位赖氨酸)-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的SDS-PAGE结果显示于图27。如 图27所示，在非还原性条件下观察到一条60K的单带，而在还原性条件下观察到 35K和25K的两条带。
实施例20：聚乙二醇化GLP-2(第30位赖氨酸)结合物的制备和分离
<20-1>聚乙二醇化GLP-2(第30位赖氨酸)结合物的制备
为了使3.4K的PropionALD(2)PEG聚乙二醇化到GLP-2(Anygen，韩国)的赖 氨酸残基上，使GLP-2和PEG以1∶12的摩尔比在4℃下进行反应3小时，其中 总蛋白浓度为5mg/mL。同时，使用包含45％异丙醇的100mM硼酸钠(pH 9.0)作 为反应媒介，将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<20-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化 第30位赖氨酸聚乙二醇化的位置异构体。在该过程中，在纯化溶液中使用乙醇以 促进异构体的分离(图28)。使用-胰蛋白酶通过肽图分析的方法证实了赖氨酸选 择性(图29)。
柱：SOURCE S
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM柠檬酸钠，pH 3.0+45％乙醇)和B(A+1M KCl)；梯度A 0→3％，1min，梯度B 3→40％，150min
如图29中所示，通过在第30位赖氨酸的PEG修饰，#2部分消失了。
实施例21：聚乙二醇化咪唑并-乙酰基GLP-2(第30赖氨酸)结合物的制备和 分离
<21-1>聚乙二醇化咪唑并-乙酰基GLP-2(第30位赖氨酸)结合物的制备
为了使3.4K的PropionALD(2)PEG聚乙二醇化到咪唑并-乙酰基 GLP-2(Anygen，韩国)的第30位赖氨酸残基上，使咪唑并-乙酰基GLP-2和PEG以 1∶20的摩尔比在4℃下进行反应6小时，其中总蛋白浓度为3mg/mL。同时，使 用包含45％异丙醇的100mM HEPES(pH 7.5)作为反应媒介，将20mM的 NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<21-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化 第30位赖氨酸聚乙二醇化的位置异构体。在该过程中，在纯化溶液中使用乙醇以 促进异构体的分离(图30)。
柱：SOURCE S
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM柠檬酸钠，pH 3.0+45％乙醇)和B(A+1M KCl)；梯度A 0→3％，1min，梯度B 3→40％，150min
实施例22：聚乙二醇化咪唑并-乙酰基GLP-2(第30位赖氨酸)和免疫球蛋白 Fc结合物的制备和分离
使实施例21中制备得到的第30位赖氨酸聚乙二醇化的咪唑并-乙酰基 GLP2-PEG和免疫球蛋白Fc以1∶15的摩尔比在4℃反应16小时，肽浓度为 20mg/mL。同时，使用100mM磷酸钾(pH 6.0)作为反应媒介，将20mM的 NaCNBH3作为还原剂加入其中。反应终止后，利用SOURCE Phe柱在下述条件下 纯化反应混合物。
柱：SOURCE Phe
流速：2.0mL/min
洗脱液：A(20mM Tris-HCl，pH 7.5)和B(A+2M NaCl)；梯度A 100→0％，100 min
通过第30位赖氨酸聚乙二醇化的CA-GLP-2异构体和免疫球蛋白Fc的连接 以及使用SOURCE Phe纯化该结合物所得到的色谱图显示于图31，CA-GLP-2(第 30位赖氨酸)-PEG和免疫球蛋白Fc的结合物的SDS-PAGE结果显示于图32。如 图32所示，在非还原性条件下观察到一条60K的单带，而在还原性条件下观察到 35K和25K的两条带。
实施例23：聚乙二醇化人类胰岛素(B1Phe)结合物的制备和纯化
<23-1>聚乙二醇化人类胰岛素(B1Phe)结合物的制备
为了使5K的PropionALD(1)甲氧基PEG(具有一个丙醛基的PEG，NOF.，日 本)聚乙二醇化到人类胰岛素(Sigma)的B链上首位氨基酸苯丙氨酸的N-末端 上，使PEG和人类(hyman)胰岛素以1∶2的摩尔比在4℃下进行反应12小时， 其中肽浓度为2.3mg/mL。同时，使用100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)作为反应媒介， 将20mM的NaCNBH3作为还原剂加入其中。
<23-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化 位置异构体。在该过程中，在纯化溶液中使用乙醇以促进异构体的分离(图33)。 通过SDS-PAGE分析证实了单-聚乙二醇化的洗脱峰，使用Glu-C蛋白酶通过肽图 分析方法证实了赖氨酸的选择性(图36)。
柱：SOURCE S
洗脱速率：2.0mL/min
洗脱溶液：A(20mM柠檬酸钠，pH 2.0+60％乙醇)和B(A+0.5M KCl)；梯度 A 0→3％，1min，梯度B 0→50％，80min
如图36中所示，通过在B1F的PEG修饰#2部分消失了。
实施例24：聚乙二醇化人类胰岛素(A1Gly)结合物的制备和分离
<24-1>聚乙二醇化人类胰岛素(A1Gly)结合物的制备
为了使5K的甲氧基PEG-琥珀酰亚胺丁酸酯(1)(具有一个SBA活性基团的 PEG，NOF.，日本)聚乙二醇化到人类胰岛素(Sigma)的A链上首位氨基酸甘氨酸 的N-末端上，使PEG和人类胰岛素以1∶4的摩尔比在25℃下进行反应3小时， 其中肽浓度为2mg/mL。同时，使用包含35％异丙醇的100mM硼酸钠缓冲液(pH 9.0)作为反应媒介。
<24-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化 位置异构体。纯化过程与实施例23中描述的方法相同。在该过程中，在纯化溶液 中使用乙醇以促进异构体的分离(图34)。通过SDS-PAGE分析证实了洗脱峰的 单-聚乙二醇化，使用Glu-C蛋白酶通过肽图分析方法证实了赖氨酸选择性(图36)。
如图36中所示，通过在A1G的PEG修饰#1部分消失了。
实施例25：聚乙二醇化人类胰岛素(B29Lys)结合物的制备和分离
<25-1>聚乙二醇化人类胰岛素(B29Lys)结合物的制备
为了使5K的甲氧基PEG-琥珀酰亚胺丁酸酯(1)聚乙二醇化到人类胰岛素 (Sigma)的B链上第29位氨基酸赖氨酸上，使PEG和人类胰岛素以1∶2的摩 尔比在25℃下进行反应1小时，其中肽浓度为2mg/mL。同时，使用包含45％异 丙醇的100mM硼酸钠缓冲液(pH 9.0)作为反应媒介。
<25-2>位置异构体的分离
从反应混合物中使用SOURCE 15S柱(XK 16mL，Amersham Bioscience)纯化 位置异构体。纯化过程与实施例23中描述的方法相同。在该过程中，在纯化溶液 中使用乙醇以促进异构体的分离(图35)。通过SDS-PAGE分析证实了洗脱峰的 单-聚乙二醇化，使用Glu-C蛋白酶通过肽图分析方法证实了赖氨酸选择性(图36)。
如图36中所示，通过在B29K的PEG修饰，#4部分消失了。
尽管本发明已经用上述具体实施方式进行了描述，应当明白对于本技术领域 技术人员来说，对本发明所作的各种修饰和改变仍将落入如所附的权利要求所限 定的发明的保护范围之内。