一锅法连续发酵制备Δ111Α，17Α二羟基黄体酮的方法.pdf

本发明提出了一锅法连续发酵制备Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮的方法，属于中间体制备技术领域。具体包括：(1)将简单节杆菌的斜面培养物接种于第一培养基中，培养20-30小时，之后加入粉碎的17α-羟基黄体酮，转化；(2)将步骤(1)完成后的发酵液接种于第二培养基；将赭曲霉的斜面培养物接种于第二培养基中，培养，后处理即得Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮。本发明采用一锅法连续发酵制备Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮，减少了脱氢物的过滤、提取、精制、烘干的步骤，因此减少了50％污染物的排放，减轻了环境的压力，节约了时间，提高了收率和效率，简化了工艺，使得整个反应操作方便，适合于工业化推广应用。

权利要求书
1.  一锅法连续发酵制备Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮的方法，包括：
(1)将简单节杆菌Atcc6942的斜面培养物接种于第一培养基中，培养20-30小时，之后加入粉碎的17α-羟基黄体酮，转化；
(2)将步骤(1)完成后的发酵液接种于第二培养基；将赭曲霉的斜面培养物接种于第二培养基中，培养，后处理即得Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮。

2.  根据权利要求1所述的一锅法连续发酵制备Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮的方法，其特征在于，所述第一培养基的配比如下(重量百分比)：1％葡萄糖、1％玉米浆、0.3％蛋白胨、0.15％KH2PO4。

3.  根据权利要求1或2所述的一锅法连续发酵制备Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮的方法，其特征在于，所述第二培养基的配比如下(重量百分比)：2％葡萄糖、1％玉米浆、1％蛋白胨、0.2％硫酸铵。

4.  根据权利要求1所述的一锅法连续发酵制备Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮的方法，其特征在于，所述步骤(1)完成后的发酵液以5％-10％的接种量接入所述第二培养基中。

5.  根据权利要求1所述的一锅法连续发酵制备Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮的方法，其特征在于，所述步骤(1)的培养是在摇瓶中进行，温度为25-35℃。

6.  根据权利要求1所述的一锅法连续发酵制备Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮的方法，其特征在于，所述步骤(2)后处理的步骤如下：过滤取所述培养液中的固体菌丝饼，提取，加热，之后加入活性炭，再回流过滤，滤液浓缩即得粗品；所述粗品再过滤即得。

说明书一锅法连续发酵制备Δ1-11α,17α-二羟基黄体酮的方法
技术领域
本发明涉及中间体的制备技术领域，特别是指一种一锅法连续发酵制备Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮的方法。
背景技术
醋酸泼尼松龙传统生产工艺以双烯为原料，经过环氧、沃氏氧化、发酵羟化、氧化、上脱溴、碘代、置换、发酵脱氢、保护、还原、水解、酯化共13步反应生成。
具体的反应式如下：


上述制备过程中的很重要的中间体Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮是采用两步发酵分开进行的，每一步反应都必须通过发酵、过滤、提取、精制、烘干、包装等步骤，过程中的处理存在收率损失，而且增加污水排放，消耗大量能源和人力资源并且增加大量设备，导致成本上升很大。由此可知上述生产工艺复杂，步骤繁琐，同时生产过程中需要使用一些有毒试剂如盐酸氨基脲等，导致生产成本高，环境压力大，经济效益差等缺点。
发明内容
本发明提出一种一锅法连续发酵制备Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮的方法，解决了现有技术中醋酸泼尼松龙的关键中间体制备工艺复杂、环境污染严重、收率损失的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一锅法连续发酵制备Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮的方法，包括：
(1)将简单节杆菌Atcc6942的斜面培养物接种于第一培养基中，培养20-30小时，之后加入粉碎的17α-羟基黄体酮，转化；
(2)将步骤(1)完成后的发酵液接种于第二培养基；将赭曲霉Aspergill us ochraceus的斜面培养物接种于第二培养基中，培养，后处理即得Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮。
作为优选的技术方案，所述第一培养基的配比如下(重量百分比)：1％葡萄糖、1％玉米浆、0.3％蛋白胨、0.15％KH2PO4。
作为优选的技术方案，所述第二培养基的配比如下(重量百分比)：2％葡萄糖、1％玉米浆、1％蛋白胨、0.2％硫酸铵。
作为优选的技术方案，所述步骤(1)完成后的发酵液以5％-10％的接种量接入所述第二培养基中。
作为优选的技术方案，所述步骤(1)的培养是在摇瓶中进行，温度为25-35℃。
作为优选的技术方案，所述步骤(2)后处理的步骤如下：过滤取所述培养液中的固体菌丝饼，提取，加热，之后加入活性炭，再回流过滤，滤液浓缩即得粗品；所述粗品再过滤即得。
本发明的技术方案与现有技术相比，具有如下有益效果：
(1)本发明通过连续发酵使得总收率较之现有技术，总收率达到81.97％，提升了近10个百分点。
(2)本发明采用一锅法连续发酵制备Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮，减少了脱氢物的过滤、提取、精制、烘干的步骤，因此减少了50％污染物的排放，减轻了环境的压力，节约了时间，提高了收率和效率，简化了工艺，使得整个反应操作方便，适合于工业化推广应用。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一锅法连续发酵制备Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮的方法，本发明的技术主要使两步发酵反应在不进行中间提取精制的过程的情况下直接进行第二次发酵，在两种菌的共同作用下同时进行两步反应。
实施例1
在500毫升摇瓶中装有200ml第一培养基，第一培养基包括1％(重量百分比)葡萄糖、1％(重量百分比)玉米浆、0.3％(重量百分比)蛋白胨、0.15％(重量百分比)KH2PO4；将培养基在高压灭菌锅中120℃灭菌30分钟；冷却至30±1℃，然后将简单节杆菌的斜面培养物接种于培养基中；将接种有菌株的培养基在摇床中30±1℃下于165rpm培养24小时。投入12g经过气流粉碎的17α-羟基黄体酮，转化48小时。
然后以10％的接种量加入800ml经过灭菌的第二培养基，第二培养基包括2％ (重量百分比)葡萄糖、1％(重量百分比)玉米浆、1％(重量百分比)蛋白胨、0.2％(重量百分比)硫酸铵；然后将赭曲霉的斜面培养物接种于培养基中；将接种有菌株的培养基在摇床中28±1℃下于200rpm培养48小时。
收获培养液，过滤取固体菌丝饼，用20倍丙酮提取4次，合并浓缩至20-30倍量，合并萃取液，加热溶清后加入0.04倍活性炭，回流半小时过滤，滤液浓缩干后得到粗品。使用氯仿-甲苯＝10:1，全溶粗品后常压浓缩至无氯仿，冷却到40℃过滤，重复3次可以得到含量98％的Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮精品8.73g，母液浓缩干后皂化，得到母液物1.35g。总收率81.97％。
实施例2
在500毫升摇瓶中装有200ml第一培养基，第一培养基包括1％(重量百分比)葡萄糖、1％(重量百分比)玉米浆、0.3％(重量百分比)蛋白胨、0.15％(重量百分比)KH2PO4；将培养基在高压灭菌锅中120℃灭菌30分钟；冷却至30±1℃，然后将简单节杆菌的斜面培养物接种于培养基中；将接种有菌株的培养基在摇床中30±1℃下于165rpm培养24小时。投入12g经过气流粉碎的17α-羟基黄体酮，转化48小时。
然后以5％的接种量加入800ml经过灭菌的第二培养基，第二培养基包括2％(重量百分比)葡萄糖、1％(重量百分比)玉米浆、1％(重量百分比)蛋白胨、0.2％(重量百分比)硫酸铵；然后将赭曲霉的斜面培养物接种于培养基中；将接种有菌株的培养基在摇床中28±1℃下于200rpm培养48小时。
收获培养液，过滤取固体菌丝饼，用20倍丙酮提取4次，合并浓缩至20-30倍量，合并萃取液，加热溶清后加入0.04倍活性炭，回流半小时过滤，滤液浓缩干后得到粗品。使用氯仿-甲苯＝10:1，全溶粗品后常压浓缩至无氯仿，冷却到40℃过滤，重复3次可以得到含量98％的Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮精品 8.81g，母液浓缩干后皂化，得到母液物1.12g。总收率80.97％。
实施例3
在500毫升摇瓶中装有200ml第一培养基，第一培养基包括1％(重量百分比)葡萄糖、1％(重量百分比)玉米浆、0.3％(重量百分比)蛋白胨、0.15％(重量百分比)KH2PO4；将培养基在高压灭菌锅中120℃灭菌30分钟；冷却至30±1℃，然后将简单节杆菌的斜面培养物接种于培养基中；将接种有菌株的培养基在摇床中30±1℃下于165rpm培养24小时。投入12g经过气流粉碎的17α-羟基黄体酮，转化48小时。
然后以10％的接种量加入800ml经过灭菌的第二培养基，第二培养基包括2％(重量百分比)葡萄糖、1％(重量百分比)玉米浆、1％(重量百分比)蛋白胨、0.2％(重量百分比)硫酸铵；然后将赭曲霉的斜面培养物接种于培养基中；将接种有菌株的培养基在摇床中28±1℃下于200rpm培养48小时。
收获培养液，过滤取固体菌丝饼，用20倍丙酮提取4次，合并浓缩至20-30倍量，合并萃取液，加热溶清后加入0.04倍活性炭，回流半小时过滤，滤液浓缩干后得到粗品。使用氯仿-甲苯＝10:1，全溶粗品后常压浓缩至无氯仿，冷却到40℃过滤，重复3次可以得到含量98％的Δ1-11α，17α-二羟基黄体酮精品8.76g，母液浓缩干后皂化，得到母液物1.21g。总收率81.18％。
本发明通过连续发酵可以将总收率提高至81.97％；减少了脱氢物的过滤、提取、精制、包装工序；减少了50％的废水排放。本发明的制备工艺简单、成本低、收率高(比现有技术高出近10个百分点)，适合于工业化推广应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。