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1、(10)申请公布号 CN 102382014 A (43)申请公布日 2012.03.21 CN 102382014 A *CN102382014A* (21)申请号 201110265368.7 (22)申请日 2011.09.08 C07C 275/24(2006.01) C07C 273/18(2006.01) A61K 31/17(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 29/00(2006.01) A61P 37/06(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 1/02(2006.01) (71)申请人 潍坊博创国际生物医药研究院。
2、 地址 261205 山东省潍坊市高新二路 36 号 (72)发明人 徐文方 宿莉 (74)专利代理机构 济南舜源专利事务所有限公 司 37205 代理人 苗峻 (54) 发明名称 氨肽酶 N 抑制剂及制备方法与应用 (57) 摘要 本发明属于药物技术领域， 尤其涉及氨肽酶 N 抑制剂及制备方法和在抗肿瘤方面的用途。本 发明的技术方案为 ： 氨肽酶 N 抑制剂， 化学名 为 ： (S)-4- 甲 基 -2-(3- 萘 基 -1- 基 甲 基 - 脲 基 )- 戊酰基羟胺。化合物 （I）结构式如下 ： 本发明氨肽酶 N抑制剂的药效学作用通过体外APN抑酶实验、 体 外抗肿瘤细胞侵袭、 抗血管生成。
3、和小鼠体内抗黑 色素瘤人工转移和血管生成实验来评价。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 2 页 CN 102382029 A1/1 页 2 1. 氨肽酶 N 抑制剂， 化学名为 (S)-4- 甲基 -2-(3- 萘基 -1- 基甲基 - 脲基 )- 戊酰基羟 胺， 具有结构式 （I） 的化合物 ： 。 2. 氨肽酶 N 抑制剂的制备方法， 其特征在于 ： 以 1- 萘甲胺为原料， 经三光气转化为萘 甲基异氰酸酯， 与 L- 亮氨酸甲酯缩合形成相应的脲基中间体， 其甲酯部分转化为异羟肟酸 得到化合物 （I。
4、） ， 反应式如下 ： 合成路线 ： 上述合成路线中的试剂和反应参数为 ： (a) 三光气， 甲苯， 回流， 3 小时 ； (b) 亮氨酸甲 酯盐酸盐， 三乙胺， 二氯甲烷， 室温， 一小时 ； (c) 盐酸羟胺， 氢氧化钾， 甲醇， 一小时。 3. 氨肽酶 N 抑制剂的应用， 用于制备和开发与氨肽酶 N 活性和表达异常相关的哺乳动 物疾病的药物。 4. 根据权利要求 3 所述的氨肽酶 N 抑制剂的应用， 其特征在于 ： 所述的与氨肽酶 N 活 性异常表达的相关哺乳动物疾病包括 ： 癌症、 炎症、 多发性硬化症、 免疫抑制性疾病或组织 溃疡、 牙周病、 大疱性表皮松懈症和白血病等。 权 利 要。
5、 求 书 CN 102382014 A CN 102382029 A1/8 页 3 氨肽酶 N 抑制剂及制备方法与应用 技术领域 0001 本发明属于药物技术领域， 尤其涉及氨肽酶 N 抑制剂及制备方法和在抗肿瘤方面 的用途。 背景技术 0002 氨肽酶 N(APN, CD13) 是一族 II 型膜结合糖蛋白， 分子量约为 150 kDa， 属于锌离 子依赖性金属蛋白酶， 以膜结合的同源二聚体形式存在， 参与多种生物功能肽 N- 端中性氨 基酸的降解。氨肽酶 N 广泛分布于人体内多种类型的细胞， 包括造血器官的基质细胞， 新生 血管内皮细胞， 各种上皮细胞包括肾脏近曲小管上皮细胞、 胆管上皮细。
6、胞和小肠刷状缘上 皮细胞等 ； 也分布于成纤维细胞、 白血病细胞、 间叶细胞肿瘤细胞、 卵巢癌细胞及多种高转 移性肿瘤细胞的表面。APN 参与机体的多种生理调节， 尤其在肿瘤发生、 发展、 侵袭转移、 凋 亡、 肿瘤血管生成以及病毒感染中发挥重要的作用。 0003 1) 氨肽酶 N 在肿瘤细胞表面高水平表达。该酶可降解细胞外基质， 从而促进肿瘤 细胞侵袭与转移。细胞外基质是机体阻挡恶变细胞侵袭转移的天然屏障， 在维持细胞连接 的稳定性和细胞间信号传导中起着非常重要的作用。细胞外基质的降解还能通过促进存 在于其中的生长因子的释放而促进肿瘤的生长增殖 （Sato Y，Biol. Pharm. Bu。
7、ll., 2004, 27(6): 772-776 ； Saiki, I.; et al. Int. J. Cancer., 1993, 54, 137 ； Menrad A., Speicher D., Wacker J., et al. Cancer Res., 1993, 53(6): 1450-1455） 。 2) 氨肽酶 N 能够刺激血管内皮细胞释放肿瘤微血管形成相关因子， 帮助增生的新生内皮细胞向细胞 间基质侵袭并形成管腔结构， 促进肿瘤血管生成。APN 在新生血管内皮细胞高表达， 血管生 成是肿瘤生长和转移的第一步。3） APN 作为血管内皮细胞表面的肿瘤细胞归巢模序 NGR 受。
8、 体， 可协助内皮细胞在肿瘤组织的诱导下归巢， 从而促进肿瘤诱导的血管生成。4） APN 在粒 细胞及淋巴细胞表面大量表达， 同时也参与了 T 淋巴细胞依赖的炎症反应， 以及降低了细 胞对其抗原的识别能力， 削弱巨噬细胞和 NK 细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力， 抑制和屏 蔽各种免疫细胞诱导的肿瘤细胞凋亡作用。5) 氨肽酶 N 参与内源性镇痛物质内啡肽和脑 啡肽的降解， 导致疼痛。 6) 氨肽酶N降解血管紧张素III， 在肾素-血管紧张素系统中发挥 调节机体血压的作用 (Mitsui, T.; et al. Biol. Pharm. Bull.,2004, 27, 768.) 随着肿瘤早期诊断。
9、手段的不断进步， 手术成为治疗肿瘤的重要手段， 然而恶性肿瘤转 移则成为手术治疗肿瘤的主要障碍和肿瘤患者复发及死亡的主要原因。近年来， 随着各 国专家对 APN 的研究逐年深入， 人们发现， APN 在降解细胞间基质、 促进肿瘤侵袭转移和血 管生成方面具有重要作用， 因此， 开发 APN 抑制剂作为抗肿瘤转移和抗血管生成药物越来 越受到各方面的关注。十几年以来， 对 APN 抑制剂的研究开发极为迅速， 但至今为止只有 唯一一个上市药物乌苯美司。乌苯美司 (Ubenimex) 作为一个具有含 - 氨基酸的类 二肽结构， 目前作为免疫增强剂用于白血病的治疗， 是从橄榄网状链霉菌 (Streptom。
10、yces olivorecticuli)的培养液中分离得到的， 全合成代价昂贵， 来源有限。 因此， 开发来源途径 便利小分子 APN 抑制剂成为抗肿瘤药物变得非常有意义。 说 明 书 CN 102382014 A CN 102382029 A2/8 页 4 发明内容 0004 本发明的目的在于， 克服现有技术的不足， 提供了一种氨肽酶 N 抑制剂， 该化合物 在针对于氨肽酶 N 活性筛选、 机制实验和体内药效学测试中发现， 其活性优于目前唯一上 市的乌苯美司。同时本发明还提供了氨肽酶 N 抑制剂的制备方法和在抗肿瘤治疗方面的用 途。 0005 为解决上述技术问题， 本发明的技术方案为 ： 氨。
11、肽酶 N 抑制剂， 化学名为 ： (S)-4- 甲基 -2-(3- 萘基 -1- 基甲基 - 脲基 )- 戊酰基羟胺。化合物 （I） 结构式如下 ： 所述化合物的制备方法， 反应步骤及反应式如下 ： 为萘甲基异氰酸酯与 L- 亮氨酸甲酯缩合形成相应的脲基中间体， 其甲酯部分转化为 异羟肟酸得到化合物 （I） 。反应式如下 ： 合成路线 ： 上述合成路线中的试剂为 ： (a) 三光气， 甲苯， 回流， 3 小时 ； (b) 亮氨酸甲酯盐酸盐， 三乙胺， 二氯甲烷， 室温， 一小时 ； (c) 盐酸羟胺， 氢氧化钾， 甲醇， 一小时。 0006 具体合成方法 ： 1） 萘甲基异氰酸酯 （1） ： 。
12、向 1- 萘甲胺 （1.57 g， 10 mmol） 的 1,4- 二氧六环溶液中加入三光气 （1.50 g， 5 mmol） 后回流三个小时， 蒸干溶剂， 所得油状物萘甲基异氰酸酯无需分离纯化， 可直接用于下一步 2） (S)-4- 甲基 -2-(3- 萘基 -1- 基甲基 - 脲基 )- 戊酸甲酯 （2） 向 L- 亮氨酸甲酯盐酸盐 （1.31 g， 10 mmol） 和三乙胺 （1.10 g， 11 mmol） 的二氯甲烷 溶液中滴入 1 的二氯甲烷溶液， 室温搅拌 1 个小时， 蒸干溶剂， 残渣溶于乙酸乙酯并用 1N 盐酸溶液和饱和食盐水洗涤， 而后干燥有机相。产物 2 由重结晶得到，。
13、 白色固体 1.70 g， 产 率52%， ESI-MS m/z： 328.1 M+H+， 1H-NMR (DMSO-d 6) ： 8.78-7.82 (m, 3H), 7.56-7.41 (m, 4H), 6.45 (t, 1H, J = 5.7 Hz), 6.11 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 4.74-4.60 (m, 说 明 书 CN 102382014 A CN 102382029 A3/8 页 5 2H), 4.17-4.10 (m, 1H), 3.67 (s, 3H), 1.60-1.51 (m, 1H), 1.37-1.32 (m, 2H), 0.89-0.87 (。
14、m, 6H)。 0007 ） (S)-4- 甲基 -2-(3- 萘基 -1- 基甲基 - 脲基 )- 戊酰基羟胺， 化合物 （I） 将2溶于羟胺钾 （是由盐酸羟胺和氢氧化钾生成的） 的甲醇溶液中， 室温搅拌一个小时， 而后蒸干溶剂， 残渣溶于 1N 盐酸中， 以乙酸乙酯提取， 干燥有机相。化合物 （1） 由重结晶得 到， 白色固体 0.60 g， 产率 35%， ESI-MS m/z： 329.1 M+H+， 1H-NMR (DMSO-d 6): 10.68 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.78-7.82 (m, 3H), 7.56-7.41 (m, 4H), 6.45 (t。
15、, 1H, J = 5.7 Hz), 6.11 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 4.74-4.60 (m, 2H), 4.17-4.10 (m, 1H), 1.60-1.51 (m, 1H), 1.37-1.32 (m, 2H), 0.89-0.87 (m, 6H)。 0008 本领域技术人员可以对上述步骤进行变动以提高收率， 他们可据本领域的基本知 识确定合成的路线， 如选择反应物， 溶剂和温度， 可以通过使用各种常规保护基以避免副反 应的发生从而提高收率。 这些常规的保护方法可参见例如T. Greene, Protecting Groups in Organic Synthesi。
16、s. 本发明的氨肽酶 N 抑制剂， 实验证明它对种植于 C57BL/6 小鼠体内的 B16BL6 小鼠黑色 素瘤高转移株具有显著的抗转移和抗肿瘤诱导血管生成的作用， 有望成为一类新型的抗肿 瘤药物。本发明氨肽酶 N 抑制剂的药效学作用通过体外 APN 抑酶实验、 体外抗肿瘤细胞侵 袭、 抗血管生成和小鼠体内抗黑色素瘤人工转移和血管生成实验来评价。 附图说明 0009 图 1 为化合物对肿瘤细胞侵袭能力的抑制率， 图 2 为化合物对 HUVEC 形成管腔能力的抑制， 图 3 为化合物对小鼠人工肺转移的抑制， 图 4 为化合物对小鼠肿瘤诱发血管生成的抑制。 具体实施方式 0010 下面结合说明书附。
17、图和具体实施例对本发明作进一步详细说明 ： 实施例 1 氨肽酶 N 抑制剂， 化学名为 ： (S)-4- 甲基 -2-(3- 萘基 -1- 基甲基 - 脲基 )- 戊酰基羟 胺。化合物 （I） 结构式如下 ： 所述化合物的制备方法， 反应步骤及反应式如下 ： 为萘甲基异氰酸酯与 L- 亮氨酸甲酯缩合形成相应的脲基中间体， 其甲酯部分转化为 异羟肟酸得到化合物 （I） 。反应式如下 ： 合成路线 ： 说 明 书 CN 102382014 A CN 102382029 A4/8 页 6 上述合成路线中的试剂为 ： (a) 三光气， 甲苯， 回流， 3 小时 ； (b) 亮氨酸甲酯盐酸盐， 三乙胺，。
18、 二氯甲烷， 室温， 一小时 ； (c) 盐酸羟胺， 氢氧化钾， 甲醇， 一小时。 0011 具体合成方法 ： 1） 萘甲基异氰酸酯 （1） ： 向 1- 萘甲胺 （1.57 g， 10 mmol） 的 1,4- 二氧六环溶液中加入三光气 （1.50 g， 5 mmol） 后回流三个小时， 蒸干溶剂， 所得油状物萘甲基异氰酸酯无需分离纯化， 可直接用于下一步 2） (S)-4- 甲基 -2-(3- 萘基 -1- 基甲基 - 脲基 )- 戊酸甲酯 （2） 向 L- 亮氨酸甲酯盐酸盐 （1.31 g， 10 mmol） 和三乙胺 （1.10 g， 11 mmol） 的二氯甲烷 溶液中滴入 1 的二。
19、氯甲烷溶液， 室温搅拌 1 个小时， 蒸干溶剂， 残渣溶于乙酸乙酯并用 1N 盐酸溶液和饱和食盐水洗涤， 而后干燥有机相。产物 2 由重结晶得到， 白色固体 1.70 g， 产 率52%， ESI-MS m/z： 328.1 M+H+， 1H-NMR (DMSO-d 6) ： 8.78-7.82 (m, 3H), 7.56-7.41 (m, 4H), 6.45 (t, 1H, J = 5.7 Hz), 6.11 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 4.74-4.60 (m, 2H), 4.17-4.10 (m, 1H), 3.67 (s, 3H), 1.60-1.51 (m, 1H), 。
20、1.37-1.32 (m, 2H), 0.89-0.87 (m, 6H)。 0012 ） (S)-4- 甲基 -2-(3- 萘基 -1- 基甲基 - 脲基 )- 戊酰基羟胺， 化合物 （I） 将 2 溶于羟胺钾的甲醇溶液中， 室温搅拌一个小时， 而后蒸干溶剂， 残渣溶于 1N 盐 酸中， 以乙酸乙酯提取， 干燥有机相。化合物 （1）由重结晶得到， 白色固体 0.60 g， 产率 35%， ESI-MS m/z： 329.1 M+H+， 1H-NMR (DMSO-d 6): 10.68 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.78-7.82 (m, 3H), 7.56-7.41 (m,。
21、 4H), 6.45 (t, 1H, J = 5.7 Hz), 6.11 (d, 1H, J = 9.0 Hz), 4.74-4.60 (m, 2H), 4.17-4.10 (m, 1H), 1.60-1.51 (m, 1H), 1.37-1.32 (m, 2H), 0.89-0.87 (m, 6H)。 0013 实施例 2 目标化合物抑制氨肽酶 N 的活性试验 （In vitro） 1、 原理 ： 氨肽酶 N 与其底物 （L- 亮氨酰 -p- 硝基苯胺） 相互作用， 产生在 405nm 有吸收 的对 - 硝基苯胺， 并且对 - 硝基苯胺的浓度与酶活性的大小呈正相关。通过检测 405nm 处 。
22、的吸收度确定对 - 硝基苯胺的含量， 从而确定氨肽酶的活性， 间接反映出抑制剂对酶活性 抑制程度的大小。 0014 2、 材料与方法 ： 氨肽酶 N 与底物 L- 亮氨酰 -p- 硝基苯胺均购自 Sigma 公司 溶液的配制 ： 说 明 书 CN 102382014 A CN 102382029 A5/8 页 7 缓冲液， 配制 pH7.2， 50mM 磷酸盐缓冲液， 室温放置备用。 0015 氨肽酶 N 溶解在缓冲液中配成 0.2mg/mL 的溶液 ； 底物溶解在 DMSO 中配成 0.5mg/mL 溶液， 各溶液冰箱放置备用。 0016 3、 氨肽酶活性分析 ： 96孔板中加入上述氨肽酶N。
23、溶液10uL， 底物溶液， 用缓冲液补足200 uL。 室温放置1h， 于 405nm 波长处测定吸收值。 0017 空白组 空白组的吸收度与 96 孔板中的无试剂孔吸收度相差无几 （无试剂孔吸收是 0.035） ， 说 明空白组几乎无吸收。对照吸收度可以看出， 在酶溶液固定时， 底物溶液最好选 15 uL 更适 宜， 所以定底物为 15 uL。 0018 4、 抑酶检测 ： 96 孔板中分别加入上述氨肽酶 N 溶液 10 uL， 底物 15 uL， 不同梯度浓度的化合物 20 uL， 50mM 磷酸盐缓冲液 （pH7.2） 补足 200 uL。100% 组不含抑制剂。空白组用失活的酶 代替活。
24、性酶， 均用缓冲液补足200 uL。 室温放置1h,于405nm波长处测定吸收值， 按照如下 公式计算抑制率 ： 抑制率 =（100% 吸收度化合物吸收度） /(100% 吸收度空白吸收度 ) 根据化合物的浓度与相应的抑制率 , 利用 origin7.5 软件拟合药效曲线， 计算各化合 物的 IC50。 0019 实验结果见表 1。 0020 表 1. 化合物的体外抑酶试验结果 a 表中数值为三次试验的平均值 说 明 书 CN 102382014 A CN 102382029 A6/8 页 8 Bestatin， 商品名为 Ubenmix（乌苯美司） ， 目前上市作为免疫增强剂用于白血病的治 。
25、疗， 是从橄榄网状链霉菌 (Streptomyces olivorecticuli) 的培养液中分离得到的小分子 类肽 APN 抑制剂。 0021 上述测试结果表明， 化合物 （I） 表现出对三种 APN 的抑制活性均优于阳性对照药 Bestatin， 具有良好的开发前景， 并可作为发现新型高效氨肽酶 N 抑制剂的先导化合物。 0022 实施例 3 目标化合物体外抑制细胞侵袭的活性试验 化合物 （I） 进行体外抑制肿瘤细胞侵袭的活性试验， 结果见图 1。 0023 术语说明 ： ES-2 为人卵巢透明细胞癌细胞株。 0024 Bestatin， 商品名为 Ubenmix （乌苯美司） ， 目前。
26、上市作为免疫增强剂用于白血病的 治疗， 是从橄榄网状链霉菌 (Streptomyces olivorecticuli) 的培养液中分离得到的小分 子类肽 APN 抑制剂。 0025 DMSO ： 二甲基亚砜。 0026 Matrigel ： 提取自小鼠 EHS 肉瘤的细胞间基质 1. 材料 ES-2 细胞株， 预包被 Matrigel 的 Transwell 小室， 结晶紫， 含 1% 胎牛血清 的 RPMI-1640 培养基， 含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基， 24 孔板 2. 方法 细胞培养 ES-2 细胞株采用常规培养。实验时使用对数生长期细胞。 0027 抗肿瘤细胞。
27、侵袭检测 ES-2 细胞悬浮于 1% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基调整至 1105/400 L， 分别加入预包被Matrigel并经过无血清培养基水化的Transwell上室， 同 时在上室每孔中加入100 L含不同浓度化合物的1%胎牛血清的培养基， 使孔中化合物终 浓度分别为 ： 5 和 50 g/ml， 加细胞不加化合物的孔作阴性对照孔， Bestatin 作化合物阳 性对照。下室中加入 750 L10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基， 于 37， 5% 二氧化碳中孵 育 8 h， 弃去上室中的培养基， 用棉签擦去非侵袭细胞， 将上室放入甲醇中固定， 并以结晶紫 染色，。
28、 而后于显微镜下观察和拍摄， 随机选取五个视野对细胞进行计数， 与阴性对照相比， 计算抑制率， 细胞侵袭抑制率按下式计算 ： 抑制率 （%） =（1 - 实验小室细胞数 / 对照小室细胞数） 100% 见图 1 ， 图中柱形为三次试验的平均值及标准偏差， 并且与阴性对照组相比， 所有药物 处理组效果经 t 检验具有统计学意义，P 0.05。 0028 图 1 测试数据表明， 化合物 （I） 在体外抗肿瘤细胞侵袭的试验中显示出优于阳性 对照 Bestatin 的活性， 具有良好的开发前景。 0029 实施例 4 目标化合物体外抗血管生成的活性试验 化合物 （I） 进行体外抑制人脐静脉血管内皮细胞。
29、 （HUVEC） 成管腔的活性试验， 结果见 图 2。 0030 术语说明 ： HUVEC 为人脐静脉血管内皮细胞。 0031 Bestatin， 商品名为 Ubenmix （乌苯美司） ， 目前上市作为免疫增强剂用于白血病的 说 明 书 CN 102382014 A CN 102382029 A7/8 页 9 治疗， 是从橄榄网状链霉菌 (Streptomyces olivorecticuli) 的培养液中分离得到的小分 子类肽 APN 抑制剂。 0032 DMSO ： 二甲基亚砜。 0033 Matrigel ： 提取自小鼠 EHS 肉瘤的细胞间基质 1. 材料 HUVEC 细胞， Mat。
30、rigel， 无血清的 RPMI-1640 培养基， 含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基， 24 孔板 2. 方法 细胞培养 原代分离的 HUVEC 细胞采用常规培养。 0034 抗 HUVEC 成管腔检测 HUVEC 细胞悬浮于无血清的 RPMI-1640 培养基调整至 1105/400 L， 分别加入预包被 Matrigel 并经过无血清培养基水化的 24 孔板， 同时在每 孔中加入 100 L 含不同浓度化合物的无血清培养基， 使孔中化合物终浓度为 25 g/ml， 加细胞不加化合物的孔作阴性对照孔， Bestatin 作化合物阳性对照， 于 37， 5% 二氧化碳 中孵。
31、育 8 h， 而后于显微镜下观察和拍摄， 随机选取五个视野对细胞 - 细胞连结点进行计 数， 与阴性对照相比。 0035 见图 2， 图中柱形为三次试验的平均值及标准偏差， 并且与阴性对照组相比， 所有 药物处理组效果经 t 检验具有统计学意义，P 0.05， 图 2 测试数据表明， 化合物 （I）在体外抗血管生成的试验中显示出优于阳性对照 Bestatin 的活性， 具有良好的开发前景。 0036 实施例 5 目标化合物小鼠体内抗小鼠黑色素瘤 B16BL6 人工肺转移实验 本发明对目标化合物分别进行体内抗小鼠黑色素瘤 B16BL6 人工肺转移实验 （结果见 图 3） 。 0037 采用小鼠黑。
32、色素瘤 B16BL6 人工肺转移模型， 对目标化合物进行腹腔注射 （ip） 给 药观察， 并与阳性药物 Bestatin 的抗转移作用进行比较。 0038 实验分组及剂量设计 ： 受试药物 ： 化合物 （I） 阳性对照 ： Bestatin 阴性对照组 ： 等量药物溶剂 瘤 株 ： 小鼠黑色素瘤 B16BL6 动 物 ： C57BL/6 小鼠， 雌雄各半， 5 6 周龄 实验过程 ： 动物购买后， 实验室平衡饲养 1 周， 小鼠黑色素瘤 B16BL6 进行常规培养， 1640 培养液含 10%FBS， 5%CO2， 37培养。小鼠 56 周大时接种细胞， 5105个 / 只， 尾静脉 注射。当。
33、天对小鼠进行随机分组 （每组 8 只） 并开始给药。药物用 DMSO 溶解， SAHA 组， 受 试药物组分别按下表所示剂量和给药方式给药， DMSO 对照组， 给予等体积溶剂， 连续腹腔注 射给药 2 周。实验结束时断颈椎处死小鼠， 剥离肺脏， 比较、 计算转移结节数。t 检验法比较 各组动物肺部转移结节数平均值、 标准偏差等指标的统计学差别。 0039 见图 3， 图中柱形为三次试验的平均值及标准偏差， 并且与阴性对照组相比， 所有 药物处理组效果经 t 检验具有统计学意义，P 0.05。 0040 上述图 3 测试结果表明， 化合物 （I） 作为 APN 抑制剂具有较强的体内外抗转移活 。
34、说 明 书 CN 102382014 A CN 102382029 A8/8 页 10 性， 具有一定的开发应用前景。 0041 实施例 6 目标化合物小鼠体内抗小鼠黑色素瘤 B16BL6 诱导的血管生成实验 本发明对目标化合物分别进行体内抗小鼠黑色素瘤 B16BL6 诱导的血管生成实验 （结 果见图 4） 。 0042 采用小鼠黑色素瘤 B16BL6 诱导的血管生成模型， 对目标化合物进行腹腔注射 （ip） 给药观察， 并与阳性药物 Bestatin 的抗血管生成作用进行比较。 0043 实验分组及剂量设计 ： 受试药物 ： 化合物 （I） 阳性对照 ： Bestatin 阴性对照组 ： 等。
35、量药物溶剂 瘤 株 ： 小鼠黑色素瘤 B16BL6 动 物 ： C57BL/6 小鼠， 雌雄各半， 5 6 周龄 实验过程 ： 动物购买后， 实验室平衡饲养 1 周， 小鼠黑色素瘤 B16BL6 进行常规培养， 1640 培养液含 10%FBS， 5%CO2， 37培养。小鼠 56 周大时接种细胞， 5105个 / 只， 背部双 侧皮内注射。当天对小鼠进行随机分组 （每组 8 只） 并开始给药。药物用 DMSO 溶解， SAHA 组， 受试药物组分别按下表所示剂量和给药方式给药， DMSO 对照组， 给予等体积溶剂， 连续 腹腔注射给药 5 天。实验结束时断颈椎处死小鼠， 分离背部表皮和皮下组。
36、织， 比较、 计数延 伸向瘤块的血管数。 t检验法比较各组动物延伸向瘤块的血管数平均值、 标准偏差等指标的 统计学差别。 0044 见图 4， 图中柱形为三次试验的平均值及标准偏差， 并且与阴性对照组相比， 所有 药物处理组效果经 t 检验具有统计学意义，P 0.05。 0045 上述图 4 测试结果表明， 化合物 （I） 作为 APN 抑制剂具有较强的体内外抗血管生 成活性， 具有一定的开发应用前景。 说 明 书 CN 102382014 A CN 102382029 A1/2 页 11 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102382014 A CN 102382029 A2/2 页 12 图 4 说 明 书 附 图 CN 102382014 A 。