一种低聚半乳糖的制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102181507 A (43)申请公布日 2011.09.14 CN 102181507 A *CN102181507A* (21)申请号 201110049829.7 (22)申请日 2011.03.02 C12P 19/14(2006.01) C12N 11/04(2006.01) (71)申请人 江门量子高科生物股份有限公司 地址 529728 广东省江门市高新区高新西路 133 号 (72)发明人 宋景深 陈子健 陈振鹏 曾昭政 (74)专利代理机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 44205 代理人 谭志强 (54) 发明名称 一种低聚半乳糖的制备方法 。

2、(57) 摘要 本发明公开了一种低聚半乳糖的制备方法， 包括将产 - 半乳糖苷酶的菌体与海藻酸钠溶液 混合均匀， 得到混合菌液 ； 将混合菌液喷压至氯 化钙溶液中， 浸泡得到固定化物 ； 将固定化物切 碎， 倒入氯化钙和壳聚糖的混合液中， 搅拌浸泡 ； 将固定化物颗粒置于戊二醛溶液交联， 洗净， 得到 固定有细胞的颗粒 ； 将固定有细胞的颗粒与乳糖 溶液混合， 搅拌反应完毕后过滤， 将滤得的糖浆纯 化， 得到低聚半乳糖。 本发明方法可有效解决直接 用菌体进行转化反应出现的菌体分离及糖浆澄清 等难题， 提高生产效率 ； 缩短生产时间， 简化生产 设备， 节省生产成本 ； 减少资源消耗， 含 - 。

3、半乳 糖苷酶的固定化细胞可以重复利用， 降低发酵上 罐次数， 减轻环保压力。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 CN 102181510 A1/1 页 2 1. 一种低聚半乳糖的制备方法， 包括以下步骤 ： 1) 将产 - 半乳糖苷酶的菌体与海藻酸钠溶液混合均匀， 得到混合菌液 ； 2) 将混合菌液喷压至氯化钙溶液中， 浸泡得到固定化物 ； 3) 将固定化物切碎， 倒入 pH 为 5 7， 含有质量百分浓度为 1 5% 氯化钙和质量百分 浓度为 0.15 0.30% 壳聚糖的混合液中， 搅拌 6 12 小时 。

4、； 4) 将浸泡处理之后的固定化物颗粒置于戊二醛溶液交联， 洗净， 得到固定化细胞的颗 粒 ； 5) 将固定有细胞的颗粒与乳糖溶液混合， 搅拌， 反应完毕后过滤， 将滤得的糖浆纯化， 得到低聚半乳糖。 2. 根据权利要求 1 所述的一种低聚半乳糖的制备方法， 其特征在于 ： 海藻酸钠溶液的 百分浓度为 1 3%。 3. 根据权利要求 1 所述的一种低聚半乳糖的制备方法， 其特征在于 ： 2） 中的氯化钙溶 液的质量百分浓度为 2 5%。 4. 根据权利要求 1 所述的一种低聚半乳糖的制备方法， 其特征在于 ： 混合菌液喷压至 氯化钙溶液后的浸泡时间为 6 16 小时。 权 利 要 求 书 CN。

5、 102181507 A CN 102181510 A1/4 页 3 一种低聚半乳糖的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种低聚半乳糖的制备方法。 背景技术 0002 低聚半乳糖 （galactooligosaccharide， GOS） 是一种功能性低聚糖， 具有良好的生 理功效， 是双歧杆菌、 乳杆菌的有效增殖因子， 可广泛应用在各种食品中， 尤其是婴幼儿配 方乳品。低聚半乳糖的生理作用有 ：（1） 促进双歧杆菌、 乳杆菌增殖， 抑制病原菌的感染和 腐败菌的发育 ；（2） 抑制有毒物代谢及有害酶的产生 ；（3） 防止便秘 ；（4） 改善血清脂质， 促 进挥发性脂肪酸的生长， 降低总血。

6、清的胆固醇浓度 ；（5） 保护肝功能的作用 ；（6） 降低血压 的作用 ；（7） 促进钙质吸收和防止骨质减少 ；（8） 提高人体免疫力 ；（9） 防龋齿作用。低聚 半乳糖是目前国际上已经开发的功能性低聚糖之一 , 是目前各类功能性低聚糖品种中唯 一源自动物乳汁中的低聚糖。 0003 低聚半乳糖是以乳糖为原料， 经 - 半乳糖苷酶 （EC3.2.1.23） 作用而制得， 是在 乳糖分子中的低聚半乳糖基上以 （1 2） 键或 （1 3） 、 （1 4） 键、 （1 6） 键连接 1 4 个半乳糖分子的寡糖类混合物。在我国， 对低聚半乳糖的研究起步较晚， 目前 只有小量生产工艺相关的报道， 而且主要。

7、为实验室范围研究， 产业化水平较低， 严重制约 低聚半乳糖产业在我国的发展。 0004 纯化的 - 半乳糖苷酶价格昂贵， 直接在反应液中添加 - 半乳糖苷酶生产低聚 半乳糖， 将大大增加生产成本， 这种方法也无法实现连续生产， 也严重降低了生产效率。 0005 如果直接将产 - 半乳糖苷酶的菌体投入乳糖溶液中， 可以生产得到低聚半乳 糖， 理论上也可以采用絮凝分离菌体， 但实际上， 很难控制工艺条件实验菌体的分离， 会在 产品中引入大量的外来离子， 使得产品中的灰分增加， 增加了后处理的成本， 亦不是一种经 济的生产方法。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种经济的低聚半乳糖的制备方法。。

8、 0007 本发明所采取的技术方案是 ： 一种低聚半乳糖的制备方法， 包括以下步骤 ： 1) 将产 - 半乳糖苷酶的菌体与海藻酸钠溶液混合均匀， 得到混合菌液 ； 2) 将混合菌液喷压至氯化钙溶液中， 浸泡得到固定化物 ； 3) 将固定化物切碎， 倒入 pH 为 5 7， 含有质量百分浓度为 0.15 0.30% 氯化钙和 质量百分浓度为 0.15 0.30% 壳聚糖的混合液中， 搅拌 6 12 小时 ； 4) 将浸泡处理之后的固定化物颗粒置于戊二醛溶液交联， 洗净， 得到固定有细胞的 颗粒 ； 5) 将固定有细胞的颗粒与乳糖溶液混合， 搅拌， 反应完毕后过滤， 将滤得的糖浆纯 化， 得到低聚。

9、半乳糖。 说 明 书 CN 102181507 A CN 102181510 A2/4 页 4 0008 优选的， 海藻酸钠溶液的百分浓度为 1 3%。 0009 优选的， 氯化钙溶液的质量百分浓度为 2 5%。 0010 优选的， 混合菌液喷压至氯化钙溶液后的浸泡时间为 6 16 小时。 0011 本发明的低聚半乳糖制备方法具有以下优点 ： （1） 简化工艺， 有效解决直接用菌体进行转化反应出现的菌体分离及糖浆澄清等难题， 提高生产效率 ； （2） 缩短生产时间， 简化生产设备， 节省生产成本 ； （3） 减少资源消耗， 含 - 半乳糖苷酶的固定化细胞可以重复利用， 降低发酵上罐次 数， 减。

10、轻环保压力。 具体实施方式 0012 一种低聚半乳糖的制备方法， 包括以下步骤 ： 1) 将产 - 半乳糖苷酶的菌体与海藻酸钠溶液混合均匀， 得到混合菌液 ； 2) 将混合菌液喷压至氯化钙溶液中， 浸泡得到固定化物 ； 3) 将固定化物切碎， 倒入 pH 为 5 7， 含有质量百分浓度为 0.15 0.30% 氯化钙和 质量百分浓度为 0.15 0.30% 壳聚糖的混合液中， 搅拌 6 12 小时 ； 4) 将浸泡处理之后的固定化物颗粒置于戊二醛溶液交联， 洗净， 得到固定有细胞的 颗粒 ； 5) 将固定有细胞的颗粒与乳糖溶液混合， 搅拌， 反应完毕后过滤， 将滤得的糖浆纯 化， 得到低聚半乳。

11、糖。 0013 优选的， 海藻酸钠溶液的百分浓度为 1 3%。 0014 优选的， 氯化钙溶液的质量百分浓度为 2 5%。 0015 优选的， 混合菌液喷压至氯化钙溶液后的浸泡时间为 6 16 小时。 0016 本发明将发酵所得的菌体包埋于海藻酸钙， 制作成固定化细胞 ； 利用壳聚糖带电 荷的特性， 可将包埋于海藻酸钙中的细胞凝聚， 并在固定化细胞表面形成一层保护膜， 再通 过戊二醛的交联作用， 使细胞更加紧密结合， 不容易从包材中渗漏出来。 用此方法所制备的 固定化细胞相对于只用海藻酸钙作为包埋材料所制备的固定化细胞， 其结构稳定性更好， 酶活使用率更高， 可连续应用于 10 批以上的乳糖转。

12、化反应， 每批只要反应时间 24 小时， 转 化率即可稳定在 45% 以上。 0017 下面结合实施例， 进一步说明本发明。 0018 以下实施例中， 如无特别说明， 百分比均指质量百分比。 0019 以下实施例中使用的产 - 半乳糖苷酶的菌体由菌株 ATCC 13032 经培养发酵得 到。显然， 也可以使用其他现有的产 - 半乳糖苷酶菌株的菌体。 0020 调节 pH 时， 最好使用盐酸或氢氧化钠溶液， 便于去除产生的盐。当然， 也可以其他 的酸或碱来调节 pH。 0021 实施例 1 1) 将 10g 海藻酸钠配制成 2% 的溶液， 在海藻酸钠溶液中加入 450ml OD600nm值为 2。

13、80 稀菌体液， 混合均匀， 得到混合菌液 ； 2) 将混合菌液喷压至 5% 的氯化钙溶液中， 浸泡 10 小时， 将其中的固化物切粒， 得到 说 明 书 CN 102181507 A CN 102181510 A3/4 页 5 粒状固定化菌体 ； 3) 将 600ml 含有 2% 氯化钙、 0.30% 壳聚糖的混合液的 pH 调节至 5.8， 倒入粒状固定 化菌体， 浸泡 8 小时 ； 4) 用等体积的水置换氯化钙和壳聚糖的混合液， 加入 2ml 戊二醛， 搅拌反应 10min， 排除戊二醛溶液， 并用水将粒状固定化菌体冲洗干净， 得到 860g 固定化细胞 ； 5) 称量 5Kg 的乳糖以。

14、及 5Kg 饮用水， 于 10L 反应罐加热混合溶解， 使乳糖稀释液的糖 度为 50.0 Brix， 投入 600g 制得的固定化细胞， 60搅拌反应 20 小时， 转化率达到 46%， 将 固定化细胞与反应后的糖浆过筛分离， 回收固定化细胞用于下次反应 ； 6) 分离得到的糖浆经过压滤澄清、 脱盐脱色、 旋转真空浓缩后， 得到低聚半乳糖。 0022 实施例 2 1) 将 7.5g 海藻酸钠配制成 1.5% 的溶液， 在海藻酸钠溶液中加入 450ml OD600nm值为 250 稀菌体液， 混合均匀， 得到混合菌液 ； 2) 将混合菌液喷压至3%的氯化钙溶液中， 浸泡8小时， 将其中的固化物切。

15、粒， 得到粒 状固定化菌体 ； 3) 将 600ml 含有 1.5% 氯化钙、 0.20% 壳聚糖的混合液的 pH 调节至 5.8， 倒入粒状固 定化菌体， 浸泡 8 小时 ； 4) 用等体积的水置换氯化钙和壳聚糖的混合液， 加入 1.5ml 戊二醛， 搅拌反应 10min， 排除戊二醛溶液， 并用水将粒状固定化菌体冲洗干净， 得到 820g 固定化细胞 ； 5) 称量 4Kg 的乳糖以及 6Kg 饮用水， 于 10L 反应罐加热混合溶解， 使乳糖稀释液的糖 度为 40.0 Brix， 投入 500g 制得的固定化细胞， 50搅拌反应 30 小时， 转化率达到 47.5%， 将固定化细胞与反应。

16、后的糖浆过筛分离， 回收固定化细胞用于下次反应 ； 6) 分离得到的糖浆经过压滤澄清、 脱盐脱色、 旋转真空浓缩后， 得到低聚半乳糖。 0023 实施例 3 1) 将 12g 海藻酸钠配制成 2.5% 的溶液， 在海藻酸钠溶液中加入 450ml OD600nm值为 280 稀菌体液， 混合均匀， 得到混合菌液 ； 2) 将混合菌液喷压至 5% 的氯化钙溶液中， 浸泡 16 小时， 将其中的固化物切粒， 得到 粒状固定化菌体 ； 3) 将 600ml 含有 1% 氯化钙、 0.15% 壳聚糖的混合液的 pH 调节至 6.5， 倒入粒状固定 化菌体， 浸泡 10 小时 ； 4) 用等体积的水置换氯。

17、化钙和壳聚糖的混合液， 加入 2ml 戊二醛， 搅拌反应 10min， 排除戊二醛溶液， 并用水将粒状固定化菌体冲洗干净， 得到固定化细胞 ； 5) 在乳糖糖浆中投入制得的固定化细胞， 60搅拌反应 20 小时， 将固定化细胞与反 应后的糖浆过筛分离， 回收固定化细胞用于下次反应 ； 6) 分离得到的糖浆经过压滤澄清、 脱盐脱色、 旋转真空浓缩后， 得到低聚半乳糖。 0024 实施例 4 1) 将 15g 海藻酸钠配制成 3% 的溶液， 在海藻酸钠溶液中加入 450ml OD600nm值为 280 稀菌体液， 混合均匀， 得到混合菌液 ； 2) 将混合菌液喷压至4%的氯化钙溶液中， 浸泡6小时。

18、， 将其中的固化物切粒， 得到粒 状固定化菌体 ； 说 明 书 CN 102181507 A CN 102181510 A4/4 页 6 3) 将 600ml 含有 5% 氯化钙、 0.2% 壳聚糖的混合液的 pH 调节至 7.0， 倒入粒状固定化 菌体， 浸泡 6 小时 ； 4) 用等体积的水置换氯化钙和壳聚糖的混合液， 加入 1.5ml 戊二醛， 搅拌反应 10min， 排除戊二醛溶液， 并用水将粒状固定化菌体冲洗干净， 得到固定化细胞 ； 5) 在乳糖糖浆中投入制得的固定化细胞， 60搅拌反应 20 小时， 将固定化细胞与反 应后的糖浆过筛分离， 回收固定化细胞用于下次反应 ； 6) 分。

19、离得到的糖浆经过压滤澄清、 脱盐脱色、 旋转真空浓缩后， 得到低聚半乳糖。 0025 实施例 5 1) 将 5g 海藻酸钠配制成 1% 的溶液， 在海藻酸钠溶液中加入 450ml OD600nm值为 280 稀菌体液， 混合均匀， 得到混合菌液 ； 2) 将混合菌液喷压至 2% 的氯化钙溶液中， 浸泡 13 小时， 将其中的固化物切粒， 得到 粒状固定化菌体 ； 3) 将 600ml 含有 3% 氯化钙、 0.30% 壳聚糖的混合液的 pH 调节至 5.0， 倒入粒状固定 化菌体， 浸泡 12 小时 ； 4) 用等体积的水置换氯化钙和壳聚糖的混合液， 加入 1ml 戊二醛， 搅拌反应 10min， 排除戊二醛溶液， 并用水将粒状固定化菌体冲洗干净， 得到固定化细胞 ； 5) 在乳糖糖浆中投入制得的固定化细胞， 60搅拌反应 20 小时， 将固定化细胞与反 应后的糖浆过筛分离， 回收固定化细胞用于下次反应 ； 6) 分离得到的糖浆经过压滤澄清、 脱盐脱色、 旋转真空浓缩后， 得到低聚半乳糖。 说 明 书 CN 102181507 A 。