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1、(10)申请公布号 CN 102250790 A (43)申请公布日 2011.11.23 CN 102250790 A *CN102250790A* (21)申请号 201110158689.7 (22)申请日 2011.06.14 CGMCC 3034 2009.04.23 C12N 1/20(2006.01) C12P 1/04(2006.01) C12R 1/385(2006.01) (71)申请人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市卫岗 1 号 (72)发明人 周立祥 任洁 (54) 发明名称 一株生物表面活性剂高效产生菌 S2 及其发 酵培养基 (57) 摘要 本发明涉。
2、及一株生物表面活性剂高效产生 菌 S2 及其发酵培养基， 属于生物技术领域。该菌 株 S2 为革兰氏阴性菌， 菌体形态呈杆状， 大小为 6-88-12m， 无芽孢和荚膜。经形态、 生理生 化特性以及分子生物学鉴定， 该菌株属于铜绿假 单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)， 保藏编号为 CGMCC No.3034。其最佳发酵培养基为以 50gL-1 菜油为唯一碳源的新型培养基。鼠李糖脂是该菌 株唯一的发酵产物， 且产量高。发酵液 CMC 值为 0.25gL-1， 与常见的化学表面活性剂相比， 它对 油类等疏水性物质具有更为明显的乳化作用和持 久性。 (83)生物保藏信息 (5。
3、1)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 CN 102250792 A1/1 页 2 1. 一 株 生 物 表 面 活 性 剂 高 效 产 生 菌， 命 名 为 铜 绿 假 单 胞 菌 S2(Pseudomonas aeruginosa S2)， 2009 年 4 月 23 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心， 保藏编号为 CGMCC No.3034。 2. 根据权利要求 1 所述的生物表面活性剂高效产生菌， 其特征在于所述铜绿假单胞菌 S2 的 GenBank 注册号为 EU59064。
4、7， 它的 16S rRNA 序列如下 ： tggattacgc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct gcctggtagt gggggataac gtccggaaacgggcgctaat accgcatacg tcctgaggga gaaagtgggg gatcttcgga cctcacgcta tcagatgagcctaggtcgga ttagctagtt ggtggggtaa aggcctacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagaggatgatcagtca cactggaact gagacacggt ccagactcct acggga。
5、ggca gcagtgggga atattggacaatgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagttgggaggaag ggcagtaagt taataccttg ctgttttgac gttaccaaca gaataagcac cggctaacttcgtgccagca gccgcggtaa tacgaagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgtaggtggttcag caagttggat gtgaaatccc cgggctcaac ct。
6、gggaactg catccaaaac tactgagctagagtacggta gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagtggcgaaggcg accacctgga ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagataccctggtag tccacgccgt aaacgatgtc gactagccgt tgggatcctt gagatcttag tggcgcagctaacgcgataa gtcgaccgcc tggggagtac ggccgcaag。
7、g ttaaaactca aatgaattga cgggggcccgcacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta cctggccttg acatgctgagaactttccag agatggattg gtgccttcgg gaactcagac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgtgtcgtgagat gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cctcgggtgggcactctaag gagactgccg gtgacaaacc ggagg。
8、aaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggcccttacggccagggc tacacacgtg ctacaatggt cggtacaaag ggttgccaag ccgcgaggtg gagctaatcccataaaaccg atcgtagtcc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcgtgaatca。 3. 一种生物表面活性剂高效产生菌发酵培养基， 其特征在于所使用的培养基为菜油 50gL-1， 硝酸钠 10gL-1， 氯化钾 1.1gL-1， 磷酸二氢钾 3.4gL-1， 磷酸氢二钾 4.4gL-1。
9、， 硫酸镁 0.5gL-1， 酵母膏 0.5gL-1， 微量元素溶液 5.0ml， pH7.2 7.4 ； 其中微量元素溶液 配方为 (gL-1) ： 硫酸锌 0.29， 氯化钙 0.24， 硫酸铜 0.25， 硫酸镁 0.17。 权 利 要 求 书 CN 102250790 A CN 102250792 A1/4 页 3 一株生物表面活性剂高效产生菌 S2 及其发酵培养基 一、 技术领域 0001 本发明涉及一株生物表面活性剂高效产生菌 S2 及其发酵培养基， 属于生物技术 领域。 二、 背景技术 0002 生物表面活性剂是天然表面活性剂的一种， 主要是指微生物在一定培养条件下产 生的一些具。
10、有明显降低表面张力的代谢产物。与化学合成的表面活性剂相比， 它们除具有 降低表面张力、 稳定乳化液和发泡等相同特性外， 还具有一般化学合成表面活性剂所不具 备的环境友好特性， 如无毒、 可自然生物降解、 生态安全等优点。另外生物表面活性剂也常 比化学活性剂具有更高的表面活性， 因为生物表面活性剂的化学结构要比化学合成的表面 活性剂复杂和庞大的多， 单个分子要占据更大的空间， 因而表面活性要强于化学合成表面 活性剂， 乳化能力也更强， 它们在医药、 化妆品、 洗涤剂和食品等工业方面具有潜在的应用 价值。特别是在在难降解疏水性有机污染物如多环芳烃、 多氯联苯、 石油烃的修复中， 生物 表面活性剂具。
11、有重要的作用， 因为它能使这些疏水性有机物乳化并明显增溶， 使得降解菌 更容易降解这些物质。 0003 微生物产生的生物表面活性剂包括许多不同的种类， 如糖脂、 脂肽、 多糖 - 脂类复 合物、 磷脂、 脂肪酸和中性脂等。它们主要是由利用碳氢化合物作碳源的微生物所产生。 0004 近年来， 随着人们对环境保护意识的增强， 环境治理力度的加大， 生物表面活性剂 的开发和应用倍受重视， 在石油开采、 环境治理、 食品工业、 造纸工业、 生物医药等领域应用 越来越广泛， 而且逐渐向其它领域渗透。例如， 有研究报道， 将生物表面活性剂与能够单独 降解蒽的微生物配合使用， 6 天后可使蒽的降解量增加 4。
12、 倍。 0005 现有报道的产生物表面活性剂的微生物主要为假单胞菌， 其产生量相对比较低。 例如， 中国海洋大学梁生康等通过摇瓶试验研究了铜绿假单胞菌产生物表面活性剂的情 况， 最大产量为2.14g/L。 这不仅与生物表面活性剂产生菌的种类有关也与培养基组成有很 大关系， 因此， 筛选高效菌株以及相应的培养基仍十分重要。 三、 发明内容 0006 技术问题本发明的目的在于针对生产实际中对高效产生物表面活性剂的大量需 求的情况， 筛选出一株产生物表面活性剂高效菌并研制出相应的发酵培养基配方。 0007 技术方案下面为本发明的主要内容 ： 0008 本发明提供的一株能够生产生物表面性剂的菌株 S2。
13、， 经过鉴定确认为铜绿假单孢 菌 Pseudomonas aeruginosa S2。该菌株于 2009 年 4 月 23 日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心 ( 中国科学院微生物研究所， 中国北京 )， 其保藏编号为 CGMCC No.3034。菌株经 PCR 扩增后， 其 16S rDNA 序列在 GenBank 的登录号为 EU590647。其最佳 发酵培养基为菜油 50gL-1， 硝酸钠 10gL-1， 氯化钾 1.1gL-1， 磷酸二氢钾 3.4gL-1， 磷酸 氢二钾 4.4gL-1， 硫酸镁 0.5gL-1， 酵母膏 0.5gL-1， 微量元素溶液 5.0ml，。
14、 pH7.2 7.4。 说 明 书 CN 102250790 A CN 102250792 A2/4 页 4 其中微量元素溶液配方为 (gL-1) ： 硫酸锌 0.29， 氯化钙 0.24， 硫酸铜 0.25， 硫酸镁 0.17。 0009 上述铜绿假单孢菌 S2 经鉴定， 具有如下生物学特征 ： 0010 (1) 菌株的形态特征 ： 革兰氏阴性菌， 在平板上培养 3d 后， 形成直径 3-5mm 的圆形 菌落， 菌落表面光滑， 隆起， 呈淡黄色。 显微镜镜检得到细菌的菌体形态呈杆状， 大小分别是 6-88-12m。革兰氏阴性， 无芽孢和荚膜。 0011 (2)菌株的生理生化特征 ： 可以在p。
15、H6-8下生长， 对葡萄糖、 V-P反应、 甲基红、 吲哚 反应呈阴性， 对接触酶、 氧化酶、 液化明胶、 水解淀粉、 产荧光色素、 产脓青素、 产精氨酸双水 解酶呈阳性， 并能在41下生长。 该菌株主要产鼠李糖脂， 最佳条件下发酵液表面张力可由 75mNm-1降至 35mNm-1， CMC 值为 0.25gL-1， 远远低于一般化学表面活性剂的 CMC 值， 发 酵液乳化性能优于对照的十二烷基磺酸钠 (SDS) 及十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 等常用 的化学表面活性剂。发酵的产物为鼠李糖脂单一产物， 48h 发酵， 产量可高达 4.7g/L。发酵 溶液对疏水性有机物如石蜡油等具有明显的。
16、乳化和增溶作用， 而且作用持久。 0012 (3)菌株的分子生物鉴定结果 ： 该菌株S2的16S rRNA共测出1267个碱基， 在核酸 数据库 GenBank (NCBI)(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/) 登录号为 EU590647。16S rDNA 的序列如下 ： 0013 tggattacgc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct gcctggtagt gggggataac gtccggaaacgggcgctaat accgcatacg tcctgaggga gaaagtgggg gatcttcgga cctcacgcta tcaga。
17、tgagcctaggtcgga ttagctagtt ggtggggtaa aggcctacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagaggatgatcagtca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggacaatgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagttgggaggaag ggcagtaagt taataccttg ctgttttgac gttaccaaca gaataagcac c。
18、ggctaacttcgtgccagca gccgcggtaa tacgaagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgtaggtggttcag caagttggat gtgaaatccc cgggctcaac ctgggaactg catccaaaac tactgagctagagtacggta gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagtggcgaaggcg accacctgga ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaa。
19、ac aggattagataccctggtag tccacgccgt aaacgatgtc gactagccgt tgggatcctt gagatcttag tggcgcagctaacgcgataa gtcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccgcacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta cctggccttg acatgctgagaactttccag agatggattg gtgccttcgg gaactcagac acaggtgctg catg。
20、gctgtc gtcagctcgtgtcgtgagat gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cctcgggtgggcactctaag gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggcccttacggccagggc tacacacgtg ctacaatggt cggtacaaag ggttgccaag ccgcgaggtg gagctaatcccataaaaccg atcgtagtcc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa 。
21、gtcggaatcg ctagtaatcgtgaatca。 0014 菌株 S2 与假单孢属 (Pseudomonas) 中的铜绿假单胞菌 (aeruginosa) 相似性最 高， 同源性达到 99以上， 因此， 鉴定为铜绿假单胞菌 S2。 0015 有益效果 0016 该菌株与已有的同类菌株相比具有明显优点 ： 0017 铜绿假单胞菌 S2 的发酵液 CMC 值仅为 0.25gL-1， 远远低于一般化学表面活性剂 说 明 书 CN 102250790 A CN 102250792 A3/4 页 5 的 CMC 值。 0018 发酵 2 天， 产量可达到 4.7g/L。 0019 铜绿假单胞菌。
22、 S2 发酵液能维持油与水乳化液体积在 80以上， 且可稳定长达 150h 以上， 其性能明显优于 SDS 和 CTAB 等常用的化学表面活性剂。 四、 具体实施方式 0020 下面叙述本发明的实施例。 0021 1、 菌株的分离纯化 0022 称取采自南京市扬子石化的油泥 10g， 加入 90ml 无菌水， 220r/min 摇床振荡 2h ； 静止 30min 后取上清 10ml 接种到装有 90ml 发酵培养基的摇瓶中， 于 28、 220r/min 的恒 温摇床上振荡培养 3d， 以此摇瓶中的培养菌液作为菌种， 在同样条件下进行二次转接培养。 将富集液划线和稀释涂布于蓝色凝胶平板， 3。
23、7培养 3 5d， 挑选菌落周围产生蓝圈较大 的菌株进行进一步分离和纯化。挑选蓝圈较大的菌株， 在牛肉膏蛋白胨细菌平板上划线纯 化， 37培养23d， 挑选单菌落在斜面培养基上留种。 将斜面保存菌株接种到摇瓶发酵培 养基中， 28、 220r/min 振荡培养 3 5d， 取发酵液进行表面活性的测定。 0023 上述菌株富集培养使用液体发酵培养基， 添加质量百分比为 2的植物油作为唯 一碳源。 0024 上述平板初筛培养基使用蓝色凝胶培养基 (g/L)， 其成分为 ： 牛肉膏 1， 葡萄糖 20， 蛋白胨 5， 酵母膏 0.2， 琼脂 18， 十六烷基三甲基溴化胺 0.2， 亚甲基蓝 0.00。
24、5 0025 上述分离铜绿假单胞菌 S2 的发酵培养基使用液体发酵培养基， 添加百分比为 5 的植物油作为唯一碳源。 0026 2、 铜绿假单孢菌 S2 的发酵， 发酵温度为 25 0027 (1) 菌种筛选 ： 铜绿假单孢菌 S2， 保藏号 CGMCC No.3034 ； 0028 (2) 斜面培养 ： 将菌种接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基， 25条件下， 静止培养 24 小时 ； 0029 (3)种子培养 ： 将步骤(2)培养的菌株， 在无菌条件下用接种环接1环于20mL含有 质量体积比为 1的植物油的发酵培养基中， 25条件下， 振荡培养 48 小时， 制得种子液 ； 0030 (4) 扩。
25、大培养 ： 以 5的体积比的接种量， 将种子液接种于 100mL 含有质量体积比 为 5的植物油的发酵培养基中， 25条件下， 振荡培养 48 小时。发酵培养基组成为菜油 50gL-1， 硝酸钠 10gL-1， 氯化钾 1.1gL-1， 磷酸二氢钾 3.4gL-1， 磷酸氢二钾 4.4gL-1， 硫酸镁 0.5gL-1， 酵母膏 0.5gL-1， 微量元素溶液 5.0ml， pH7.2 7.4。其中微量元素溶 液配方为 (gL-1) ： 硫酸锌 0.29， 氯化钙 0.24， 硫酸铜 0.25， 硫酸镁 0.17。 0031 (5) 收集发酵产物 ： 将步骤 (4) 所得的发酵液 8000r/。
26、min， 4离心 20min， 处理两 次， 除菌体， 发酵液即为具有表面活性剂的溶液。经测定， 发酵液中生物表面活性剂鼠李糖 脂的浓度为 4.7g/L， 发酵液 CMC 为 0.25gL-1。 0032 3、 生物表面活性剂鼠李糖脂的提纯 0033 将 2(5) 中的上清液用盐酸调至 pH 2.0， 出现絮状沉淀， 4静置过夜 ； 再离心处理 (10000r/min， 30min， 4 )， 倒掉上清液， 用尽量少的 pH 为 2.0 的盐酸溶液将离心管中的沉 淀洗下， 用1mol/L的NaOH将沉淀的pH调至7.0， 冷冻干燥， 得到黄褐色疏松状的固体， 即表 说 明 书 CN 10225。
27、0790 A CN 102250792 A4/4 页 6 面活性剂粗产品。 0034 将上述所得的粗产品用CH2Cl2萃取， 减压蒸馏， 用0.01mol/L的NaOH溶解， 用滤纸 过滤， 再用盐酸将滤液的pH调至2.0， 再次出现沉淀， 4、 10000r/min离心30min， 得淡黄色 沉淀， 冷冻干燥即得表面活性剂。 0035 4、 铜绿假单孢菌 S2 发酵液的乳化性能测定 0036 取一刻度试管 (18mm180mm)， 内加 4mL 石蜡油和 4mL 上述发酵液， 测定发酵液内 鼠李糖含量。配制与发酵液中鼠李糖含量相同浓度 (4700mg/L) 的十二烷基磺酸钠 (SDS) 及十。
28、六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 溶液， 分别加入 4mL 菜油， 置于相同规格的刻度试管内作 为对照， 每种处理 3 个重复， 用 KQ-250B 型超声波仪于 80W 下超声处理 40s， 然后避光静置， 在不同时间测量乳化液和油相体积。结果见表 1。 0037 表 1. 不同表面活性剂对石蜡油的乳化效果 ( ) 0038 从表1中明显看出， 菌株S2发酵液对石蜡的乳化体积在长达156h时仍达到82， 而对应的化学表面活性剂 SDS 只有 76， CTAB 则只有 65。因此， 该菌株所产生物表面活 性剂的性能比 SDS 和 CTAB 的性能更优越。 说 明 书 CN 102250790 A CN 102250792 A1/1 页 7 0001 序 列 表 CN 102250790 A 。