脆性X综合症致病基因突变检测试剂盒及应用.pdf

本发明公开了一种检测脆性X综合症致病基因FMR1基因是否发生突变的试剂盒。该试剂盒的主要成分包括：（1）FMR1基因第1到第17外显子区PCR扩增与测序引物20对，（2）PCR扩增试剂，（3）PCR产物纯化试剂，（4）DNA测序试剂。本发明的试剂盒用于检测假脆性X综合症致病基因FMR1的突变体，可以快速方便地查出致病基因的携带者以及病人，可应用于产前诊断、阻止患儿出生，降低脆性X综合症的发病率。

1.一种检测脆性X综合征致病基因FMR1基因是否发生突变的试剂盒，其特征在于包括以下成分：(1)FMR1基因第1到第17外显子区PCR扩增与测序引物20对，(2)PCR扩增试剂，(3)PCR产物纯化试剂，(4)DNA测序试剂；所述的20对引物序列如下：第1对：F：5’-ctccgtttcggtttcacttc-3’，R：5’-agtccttccctcccaacaac-3’第2对：F：5’-cttcaaaaactgaccttcatttg-3’，R：5’-ccattcctgaaaagcactca-3’第3对：F：5’-ttgtgtggtatcttctctcctttg-3’，R：5’-ccattcctgaaaagcactca-3’第4对：F：5’-cctcggggtacatagacagg-3’，R：5’-tgaccaacagaaacatactgaaca-3’第5对：F：5’-tgttcagtatgtttctgttggtca-3’，R：5’-aagtttaaacaagcgcaagg-3’第6对：F：5’-ttcagaaatgtacagaaaaggagcta-3’，R：5’-gaacctaaggaattgttaagaagca-3’第7对：F：5’-ttcagaaatgtacagaaaaggagcta-3’，R：5’-tttccaactatagaacctaaggaattg-3’第8对：F：5’-gacccctcatatacagggtcaa-3’，R：5’-tttcaattaaatgataccctcca-3’第9对：F：5’-aaaaagtacttaggctgtgagagg-3’，R：5’-cattgtgcacatgtaccctaaaa-3’第10对：F：5’-tgaaaagagtctctactttggttttg-3’，R：5’-cagcaggcatgcttgataat-3’第11对：F：5’-ttcggtaattttataaaccaaaactg-3’，R：5’-gcctacaagtctaaccagagaaaa-3’第12对：F：5’-aaaagtcctgcagtgaaagtcc-3’，R：5’-actcctccctccagtcccta-3’第13对：F：5’-catttgtatacctgctgttcacc-3’，R：5’-cagtgttttgcacaggctaga-3’第14对：F：5’-aaggagatcattcaatttcctg-3’，R：5’-cccactgtgaattggaaacc-3’第15对：F：5’-gaagagttttggattaccc-3’，R：5’-gggagagatgggatcttggt-3’第16对：F：5’-ttcagattctgtggttggttt-3’，R：5’-cataaactggatttgtaatctttgaa-3’第17对：F：5’-gcacttcttctgttctcatctcc-3’，R：5’-cacacacatttcagggtcca-3’第18对：F：5’-tctcgtatagaagtcttcatgaaatg-3’，R：5’-aacaaaaccaaaccccaaca-3’第19对：F：5’-cagaattggaaaagactaagatcg-3’，R：5’-ttttaaaagcaatcatttgtaagga-3’第20对：F：5’-tgacatttgtttggttatagtgcaa-3’，R：5’-ttttgccttttaagggctcat-3’。 2.根据权利1所述的试剂盒用于检测FMR1基因突变体。 

所属技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及检测脆性X综合症致病基因是否发生突变的试剂盒。 

背景技术

脆性X综合征是一种发病率仅次于先天愚型的遗传性智能低下综合征，发病率占全部儿童的0.05％，呈X连锁遗传，占X连锁智能低下的40％。其外显率因性别不同有差异，男性80％，女性30％。95％以上的脆性X综合征患者发病的分子遗传学基础是FMR1基因(CGG)n结构扩展的动态突变引起的，约5％以下则是由于FMR1基因的错义突变和缺失型突变影响了FMRP的正常结构导致的。 

FMR1基因位于染色体Xq27.3，在基因组序列约38kb，由17个外显子和16个内含子组成，编码脆性X智能低下基因蛋白(FMRP)。FMR1基因是一个高度保守的基因，其5’端外显子上的非翻译区有一个(CGG) n三核苷酸串联重复序列，(CGG)n在重复片段长度和AGG嵌入模式上都存在多态性，并且可以遗传，在其上游大约250bp处有一个CpG岛。正常FMR1基因(CGG)n中n介于7-60之间。当n扩展到60-200时，携带者虽表型正常，但在传代过程中易发生进一步扩展，称FMR1基因的前突变。前突变CpG岛一般不甲基化，FMR1基因具有相对正常的转录和蛋白质水平，不表现出临床症状。当n扩展达200以上时，男性表现100％为典型的脆性X综合征，女性也有30％-50％表现轻重程度不等的智能低下。这种FMR1基因的突变称全突变，前突变至全突变的扩展是严格母系的，全突变(CGG)n重复序列大量扩展，引起FMR1 5’(CGG)n侧CpG岛异常甲基化，使FMR1基因失活，导致FMRP的缺失引起智能低下。 

脆性X综合征发病率高，临床表现复杂，遗传规律独特，目前无有效的治疗方法，要降低其发病率，关键是查出携带者及病人，然后通过遗传咨询、产前诊断、阻止患儿出生。 

发明内容

本发明的目的是提供一种采用DNA测序技术检测脆性X综合症致病基因FMR1是否突变的试剂盒。 

本检测试剂盒主要包括以下成分： 

(1)FMR1基因第1到第17外显子区PCR扩增与测序引物20对，各对引物序列见表1； 

(2)常规PCR扩增试剂，如dNTP、Taq DNA聚合酶等； 

(3)常规PCR产物纯化试剂，如SAP酶、ExoI酶等； 

(4)常规DNA测序试剂，如BigDye mix、EDTA溶液、乙醇溶液、HIDI溶液等。 

表1 FMR1基因第1-17外显子区的PCR扩增与测序引物序列 

本试剂盒的使用步骤包括： 

(1)提取样本的基因组DNA； 

(2)FMR1基因PCR扩增： 

针对FMR1基因第1-17外显子区按照表1设计引物进行PCR扩增。每个反应体系为总体积10μl，包含基因组DNA(100ng/μl)1.0μl、dNTP混合液(2.5mM each)0.8μl、10X PCR反应缓冲液(Mg2+free)1.0μl、上游引物和下游引物(10μM)各0.2μl、MgCl2(25mM)1.0μl、T aq DNA聚合酶(5Units/μl)0.08μl、去离子水5.72μl。反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟。 

(3)PCR产物纯化： 

每个反应体系为总体积12.5μl，包含PCR产物10μl，SAP酶(1units/μl)0.375μl，ExoI酶(10units/μl)0.1875μl，去离子水1.9375μl。反应条件为37℃、15分钟，72℃、20分钟。 

(4)DNA测序反应 

每个反应的体系为总体积5μl，包含PCR纯化产物1μl，BigDye mix(25％)1μl，DNA测序引物(3.2μM)1μl，去离子水2μl。反应条件为98℃、2分钟，进行25个循环的96℃、30秒，55℃、30秒，60℃、4分钟。 

反应结束后每管加入EDTA溶液(125mM)1μl和乙醇溶液(100％)15μl，于室温下沉淀15分钟；在4℃以3650转/分的转速离心30分钟，轻轻倒去上清液；加入乙醇溶液(70％)30μl，以3650转/分的转速离心15分钟，轻轻倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8μl，放入测序仪中。 

本发明所述的试剂盒用于检测脆性X综合症致病基因FMR1的突变体，可以快速方便地查出致病基因的携带者以及病人，可应用于产前诊断、阻止患儿出生，降低脆性X综合症的发病率。 

具体实施方式

实施例1 

一人份检测脆性X综合症致病基因FMR1是否发生突变的试剂盒，包括以下成分： 

(1)FMR1基因第1到第17外显子区PCR扩增与测序引物20对，每条引物1 OD，各条引物序列参见表1； 

(2)PCR扩增试剂：dNTP混合液(2.5mM each)24μl、10X PCR反应缓冲液(Mg2+free)30μl、MgCl2(25mM)30μl、T aq DNA聚合酶(5Units/μl)2.4μl； 

(3)PCR产物纯化试剂：SAP酶(lunits/μl)11.25μl、ExoI酶(10units/μl)5.625μl； 

(4)测序试剂，如BigDye mix(25％)30μl、EDTA溶液(125mM)30μl、乙醇溶液(100％)450μl、乙醇溶液(70％)900μl、HIDI溶液240μl。 

本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。 

实施例2 

一人份检测脆性X综合症致病基因FMR1是否发生突变的试剂盒的使用步骤包括： 

(1)提取样本的基因组DNA； 

(2)FMR1基因PCR扩增： 

20对引物共进行20个PCR反应。每个反应体系为总体积10μl，包含基因组DNA(100ng/μl)1.0μl、dNTP混合液(2.5mM each)0.8μl、10X PCR反应缓冲液(Mg2+free)1.0μl、上游引物和下游引物(10μM)各0.2μl、MgCl2(25mM)1.0μl、T aq DNA聚合酶(5Units/μl)0.08μl、去离子水5.72μl。反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟。 

(3)PCR产物纯化： 

共进行20个PCR纯化反应。每个反应体系为总体积12.5μl，包含PCR产物10μl，SAP酶(1units/μl)0.375μl，ExoI酶(10units/μl)0.1875μl，去离子水1.9375μl。反应条件为37℃、15分钟，72℃、20分钟。 

(4)DNA测序反应 

共进行20个DNA测序反应。每个反应的体系为总体积5μl，包含PCR纯化产物1μl，BigDye mix(25％)1μl，DNA测序引物(3.2μM)1μl，去离子水2μl。反应条件为98℃、2分钟，进行25个循环的96℃、30秒，55℃、30秒，60℃、4分钟。反应结束后加入EDTA溶液(125mM)1μl和乙醇溶液(100％)15μl，于室温下沉淀15分钟；在4℃以3650转/分的转速离心30分钟，轻轻倒去上清液；加入乙醇溶液(70％)30μl，以3650转/分的转速离心15分钟，轻轻倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8μl，放入测序仪中进行测序。 

<110> 上海佰真生物科技有限公司

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