《巴氏微杆菌XJ及应用该菌制备甜菊醇的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《巴氏微杆菌XJ及应用该菌制备甜菊醇的方法.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102220274 A (43)申请公布日 2011.10.19 CN 102220274 A *CN102220274A* (21)申请号 201110159563.1 (22)申请日 2011.06.15 CCTCC NO ： M 2011182 2011.05.24 C12N 1/20(2006.01) C12P 15/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 南京师范大学 地址 210046 江苏省南京市亚东新城区文苑 路 1 号 (72)发明人 陈育如 玄燕 赵乙萱 刘润薇 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 322。
2、07 代理人 卢亚丽 (54) 发明名称 巴氏微杆菌 XJ 及应用该菌制备甜菊醇的方 法 (57) 摘要 本 发 明 涉 及 一 种 巴 氏 微 杆 菌 （Microbacterium barkeri） XJ 菌株及其应用。 所说的巴氏微杆菌 XJ， 保藏编号为 CCTCC NO ： M2011182。 该菌株可用于制备甜菊醇， 具体为将甜 菊糖苷或悬钩子苷制成菌培养液或酶转化液， 加 入适量菌或酶后， 在适当装液量、 转化温度、 pH、 时 间等条件下， 甜菊糖苷或悬钩子苷被转化为甜菊 醇， 转化液经分离纯化得到高纯度的甜菊醇。 本发 明提供了一种高效制备甜菊醇的方法。 (83)生物保藏信息。
3、 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 CN 102220283 A1/1 页 2 1. 一种巴氏微杆菌 （Microbacterium barkeri） XJ菌株， 其特征在于， 该菌株的保藏编 号为 CCTCC NO ： M 2011182。 2. 一种制备甜菊醇的方法， 是 ： 将巴氏微杆菌 XJ 接种到含有甜菊糖苷或悬钩子苷底物的溶液中， 进行生物转化 ； 得到 的转化液经分离除杂处理后， 得到甜菊醇 ； 或者是 ： 将巴氏微杆菌 XJ 的菌粉加入到含有甜菊糖苷或悬钩子苷底物的溶液中， 进行。
4、生物转 化， 得到的转化液经分离除杂处理后， 得到甜菊醇 ； 或者是 ： 将从巴氏微杆菌 XJ 中得到的酶液或酶粉加入到含有甜菊糖苷或悬钩子苷底物的溶液 中， 进行生物转化， 得到的转化液经分离除杂处理后， 得到甜菊醇。 3. 根据权利要求 2 所述的制备甜菊醇的方法， 其特征在于， 所说的甜菊糖苷是甜菊苷， 斯替维伯苷， 莱鲍迪苷A， 莱鲍迪苷B， 莱鲍迪苷C， 莱鲍迪苷D， 莱鲍迪苷E， 杜尔可苷A中的 任意一种或它们的混合物。 4. 根据权利要求 2 所述的制备甜菊醇的方法， 其特征在于， 其中的转化底物是甜菊浸 提液， 或由甜菊糖苷或悬钩子苷配制的转化液。 5. 根据权利要求 2 所述。
5、的制备甜菊醇的方法， 其特征在于， 转化底物中甜菊糖苷的浓 度为 0.0150%（W/W） 。 6. 根据权利要求 2 所述的备甜菊醇的方法， 其特征在于， 甜菊糖苷的浓度为 0.0510% （W/W） 。 7. 根据权利要求 2 所述的制备甜菊醇的方法， 其特征在于， 转化底物中悬钩子苷的浓 度为 0.0150%（W/W） 。 8. 根据权利要求 2 所述的制备甜菊醇的方法， 其特征在于， 悬钩子苷的浓度为 0.0510%（W/W） 。 9. 根据权利要求 2 所述的制备甜菊醇的方法， 其特征在于， 转化体系中接菌量为转化 底物体积的 0.120% ； 或者加入菌粉量为底物重量的 0.01%。
6、10% ； 或者加入的酶量为底物重 量的 0.01%10%。 10. 根据权利要求 2 所述的制备甜菊醇的方法， 其特征在于， 转化时间为 12144 h， 转 化温度为 2540， 转化体系的 pH 值为 3.5-7.5。 权 利 要 求 书 CN 102220274 A CN 102220283 A1/6 页 3 巴氏微杆菌 XJ 及应用该菌制备甜菊醇的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种制备甜菊醇的新方法， 特别是微生物或酶转化甜菊糖苷或悬钩子 苷获得甜菊醇的方法。属于药物原料生产应用领域。 背景技术 0002 甜菊糖苷为白色、 无嗅的粉末， 微溶于乙醇， 对热、 酸、 碱稳定， 室。
7、温下的溶解度超 过40%(王一凡, 任岱, 周风贤等. 甜菊糖食品中营养成分的研究. 中国现代医学杂志, 1997, 7(3): 63-64） 。 0003 甜菊糖苷是八种双萜糖甙的混合物， 结构通式见表 1， R1 和 R2 位可连接不同种类 和数量的单糖构成不同成分， 其八种成分分别为 ： 甜菊苷 （甙， 以下苷与甙同义） 、 甜菊醇双 糖甙 (steviolbioside)、 莱鲍迪甙 A (rebaudioside A， RA)、 莱鲍迪甙 B (rebaudioside B， RB)、 莱鲍迪甙 C (rebaudioside C， RC)、 莱鲍迪甙 D (rebaudioside。
8、 D， RD)、 莱鲍迪甙 E (rebaudioside E， RE)、 杜尔可甙 A (dulcoside A， Dul - A)。其不同种类的糖苷在甜度和 味质上存在较大的差异。其中以 RA 口感最好， 其甜度为蔗糖的 300 倍， 且甜味纯正无后味， 是非常理想的天然甜味剂。而 SS 的甜度为蔗糖的 200 倍并带有一定的后苦味道， 且呈味比 蔗糖慢。SS 和 RA 是甜菊叶中主要甜菊糖苷成分， 约占总甜菊糖含量的 90% （曹强译 , 甜菊 糖的特征与有效利用 . 杭州食品科技 , 1993, 29 (2): 8-11.） 。 0004 甜叶悬钩子苷 ( 又名甜茶， Rubusosi。
9、de)， 也称为甜菊二 ( 双） 糖苷 （甙） ， 是我国南 方蔷薇科(Rosaceae)植物悬钩子 （甜茶） 抽提出来的一种贝壳杉烯双萜苷， 分子式C32H50013， 分子量642。 甜叶悬钩子苷呈淡黄色或白色粉末， 味甜。 悬钩子苷在该植物叶子中的含量较 高 (5 )， 但在植物果实中的含量甚微。悬钩子苷的化学结构与甜菊苷十分相似， 结构上 仅相差一个葡萄糖基。用巨大芽孢杆菌 (Bacillus Megaterium) 产生的环糊精葡萄糖基转 移酶对悬钩子苷进行改性处理， 其甜度能得到改进。我国广西一带有将甜叶悬钩子的叶加 工成甜茶饮用， 当地居民还有将此植物叶的水浸出液与米粉一起混合制。
10、作糕点。悬钩子苷 说 明 书 CN 102220274 A CN 102220283 A2/6 页 4 的糖苷配基是甜菊醇 (13- 羟基异贝壳杉烯酸 )， 悬钩子苷可经本发明选育的菌转化得到甜 菊醇。 甜菊醇 (Steviol) 为甜菊苷的苷元， 分子具有对映 - 贝壳杉烯型四环二萜骨架结构， 而对映 - 贝壳杉烯型二萜类化合物大多具有广泛的生理活性， 如清热解毒， 抗菌消炎， 抗 肿瘤等作用 (Fuji K, Node M, Ito N, et al， Terpenoids. L. Antitumor activity of diterpenoids from Rabdosia shiko。
11、kiana var occidentalis. Chem. Pharm. Bull., 1985, 33(3): 1038-1042） 。甜菊醇与甜菊糖苷有类似的作用， 即抗高血糖等功 能， 因为它们能够促进胰岛素分泌。甜菊醇生物活性与赤霉素也有相似之处 , 与赤霉素 的形成有关， 可促进赤霉素的生物合成 (Kyowa Hakka Kogyo Co Ltd.Jpn Kokai Tokyo Koho,80,120,794)。甜菊醇对种子的发芽和芽的生长均有促进作用 , 这与赤霉素的生理 功效相似。Bearder 等发现甜菊醇在赤霉菌突变体 BI-41a 的作用下 , 转变为赤霉素 GA1, HA。
12、19等 (JohnR, Bearder J, Colin M W. Phytochemistry, 1975, 14(8):1741)。甜菊醇 和赤霉素在植物体内的生物合成过程中有相同的前体 , 即贝壳杉烯和贝壳杉烯酸 , 故它 们是同源的。所以 , 甜菊醇对植物生长的促进作用可能是通过转化为赤霉素而实现 , 以 赤霉素的生理机能表现出来 ( 柏正武， 刘秀芳， 徐汉生 . 甜叶醇衍生物的合成及其生物活 性 . 应用化学 . 1993, 10(4):35-38)。 0005 甜菊醇在酸性条件下不稳定， 易发生重排从而变成其同分异构体异甜菊醇， 所以 不能通过甜菊苷酸水解的方法制备。 0006 。
13、20 世纪 80 年代 Ogawa 等报道了甜菊醇的化学合成方法。甜菊醇可由甜菊苷 stevioside 经高碘酸钠或四醋酸铅氧化再经碱水解得到 , 此法需要价高的高碘酸钠或含 重金属的四醋酸铅 , 得到的甜菊醇产率也很低， 且需经过多次重结晶才能得到较纯的产物 (Ogawa T, Nozaki M, Matsui M. Total synthesis stevioside. Tetrahedron, 1980, 36(18): 2641-2648） 。用蜗牛酶加甲苯处理甜菊糖苷可得到甜菊醇， 蜗牛酶在降解甜菊糖 苷时以内切方式作用于 1-4 糖苷键， 反应在 48h 达到完全， 经分离纯化可。
14、得到甜菊醇 （刘 铸晋 , 周文华 , 高峰 , 等 . 甜叶悬钩子叶的甜味成分研究 . 植物学通报 , 1983, 01: 33-37） , 但蜗牛酶来源有限且价格较高， 使用的甲苯为有毒有机溶剂。 0007 Oliveira 等人将甜菊糖置于含有赤霉菌Gibberella fujikuroi 的培养基 中 , 经 48h（室温 ) 或者 pH4.0, 7 天 （室温） 处理， 可得到甜菊醇 (Heleno de Oliveira, Bras, Ferreira da Trindade, Jose Luiz. Production of hydroxystevio and its appli。
15、cation as a plant growth regulator: Brazil, 2004006278P.2006-08-22.)。 甜菊醇还可通过动物包括人类肠道中的微生物 ( 无使用巴氏微杆菌的报道）处理得到 (Hutapea et al., 1997; Koyama et al.,2003a,b; Gardana et al., 2003; Geuns et al., 2003)。R.E. Wingard 等在研究肠道中 SS 和 RA 的吸收与降解中发现 SS 能够在 2d 内 转化为甜菊醇， 而 RA 需要 6d( R.E. Wingard, Jr, J.P. Brown, F。
16、.E. Enderlin, J.A. Dale, R. L. Hale and C.T. Seitz. Intestinal degradation and absorption of the glycosidic sweeteners stevioside and rebaudioside A 1 Experientia 36 (1980), Birkhuser Verlag, Basel (Schweiz)。Koyama 等研究表明人体肠道中的微生物作用在 0.2mg/ml 和 10 mg/ml 的甜菊糖的混合物 24h， 在人体中的降解率分别低于 85% and 55%. 本发明所使用的。
17、微生物巴氏微杆菌 XJ 在 24h 内可将 3.2mg/mL 浓度的 95%SS 转化为甜 说 明 书 CN 102220274 A CN 102220283 A3/6 页 5 菊醇 （同时， 其中 RA 的转化率 21%） ， 30 小时可将 100%SS 转化。 0008 本发明用筛选的巴氏微杆菌对原料的转化效率高 （90%-100%） ， 反应条件温和 （常 温） ， 操作简便 （巴氏微杆菌极易培养） ， 成本低 （可使用低成本的混合底物） ， 可得到高纯度 的甜菊醇产品 (98%-99%)。该方法可以解决制备甜菊醇时效率不高或需用到有毒化学品或 重金属或试剂昂贵的问题， 可拓展甜叶菊、。
18、 甜菊苷或悬钩子苷的用途， 高效地得到甜菊醇产 品。 发明内容 0009 本发明旨在提供一种巴氏微杆菌 XJ 及利用该菌制备甜菊醇的方法。 0010 本发明所述的巴氏微杆菌 （Microbacterium barkeri） XJ 菌株， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2011182。 0011 本发明所说的制备甜菊醇的方法， 是将巴氏微杆菌 XJ 接到含有甜菊糖苷或悬钩 子苷底物的溶液中， 进行生物转化 ； 得到的转化液经分离除杂处理后， 得到高纯度甜菊醇 ； 或者是 ： 将巴氏微杆菌 XJ 的菌粉加入到含有甜菊糖苷或悬钩子苷底物的溶液中， 进行生物转 化， 得到的转化液经分离除杂处理。
19、后， 得到高纯度甜菊醇 ； 或者是 ： 将从巴氏微杆菌 XJ 中得到的转化酶液或酶粉加入到含有甜菊糖苷或悬钩子苷底物的 溶液中， 进行生物转化， 得到的转化液经分离除杂处理后， 得到高纯度甜菊醇。 0012 上述方法中所说的甜菊醇糖苷是甜菊苷(甙)、 斯替维伯苷(甙)、 莱鲍迪苷(甙) A、 莱鲍迪苷 ( 甙 )B、 莱鲍迪苷 ( 甙 )C、 莱鲍迪苷 ( 甙 )D、 莱鲍迪苷 ( 甙 )E、 杜尔可苷 ( 甙 ) A 中的任意一种或它们的混合物。 0013 上述方法中所说的悬钩子苷是来自于甜茶或悬钩子植物的提取物。 0014 上述方法中所说的转化底物是甜菊浸提液或悬钩子苷或由甜菊糖苷不同组份。
20、或 与悬钩子苷等配制的转化底物。底物浓度可为 0.0130%（W/W） ， 优选 0.0510%（W/W） ， 最 好为 0.55%（W/W） 。 0015 上述方法中转化体系中接菌量为转化底物体积的 0.120%， 优选 515%（V/V） ， 最 好 812%（V/V） ； 或者加入菌粉量为底物重量的 0.01%10%， 或者加入的酶量为底物重量的 0.01%10%. 上述方法中转化时间为 12144 h， 优选 2472 h ； 转化温度为 2540， 优选 2837 ； 转化体系的 pH 值为 3.57.5。 0016 本发明将甜菊糖或悬钩子苷制成转化液， 接入相应的菌液或菌粉或酶粉，。
21、 在适当 的温度和 pH 下转化， 即可获得甜菊醇转化液， 经除杂和分离纯化后获得高纯度的甜菊醇产 品。 或者取一定量的甜菊叶或甜茶， 按一定的固液比用水充分浸提后， 过滤得到甜菊浸提液 或甜茶浸提液， 接入微生物后转化到得甜菊醇溶液， 再经分离纯化即可得到高纯度的甜菊 醇。 0017 将选育的巴氏微杆菌按常规的液体或固体发酵培养后接入含甜菊糖 （15%） （W/W） 的体系中， 接菌量为 0.510%（V/V） ， 培养 12-144 h。1%（W/W） 甜菊糖苷溶液 HPLC 图见图 1， 转化完全的的 HPLC 如图 2 所示。 说 明 书 CN 102220274 A CN 10222。
22、0283 A4/6 页 6 0018 本发明的优点 ： 将来源丰富、 成分复杂的甜菊糖或悬钩子苷原料经巴氏微杆菌转化后得到高纯度的甜 菊醇。 附图说明 0019 图 1 ： 1% 甜菊糖苷溶液转化前的 HPLC 图。 0020 图 2 ： 1% 甜菊糖苷溶液经微生物转化完全后的 HPLC 图。 具体实施方式 0021 从江苏省植物中经富集培养分离得到 2 株菌， 分别对甜菊糖转化液进行转化， 转 化条件如实施例1所述。 HPLC方法检测转化效果， 选择转化效果好的一株作为研究菌株， 命 名为 XJ。 0022 该菌在 37温箱中培养一天可长出菌落， 菌落形态为白色湿润， 圆形凸起， 边缘齐 整。
23、， 直径 2-5mm。光镜下观察为短杆状， 单生或呈双杆状， 形体微小， 革兰氏阳性。经 16 S rDNA 序列测定及进化树构建得出该菌为微杆菌属中的巴氏微杆菌。 0023 该菌株于 2011 年 5 月 24 日送交中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏单位地址 ： 武汉大学 ； 保藏菌株分类命名为 ： 巴氏微杆菌 （Microbacterium barkeri） XJ， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2011182。 0024 巴氏微杆菌培养条件简单， 斜面保藏培养基为常用肉汤培养基， 通过产酶培养可 直接用于转化。 0025 巴氏微杆菌粉或酶粉的制备 ： 使用常规的液体或固体发酵培。
24、养和酶的分离方法即 可得到菌粉或酶粉。 0026 例如， 菌粉的制备包括菌的发酵培养、 发酵液的分离、 菌泥乳化和乳化液真空冷冻 干燥。将巴氏微杆菌产酶发酵的酶液经冷冻后在真空度 15pa 条件下真空干燥 30 h 即可 得到酶粉。 0027 本发明所用的材料即转化底物 ： 甜菊糖苷、 悬钩子苷可从长沙光明食品化工公司 购买， 也可用通常的提取方法从甜叶菊或悬钩子叶中制备。 0028 本发明结合具体的实验和数据为本发明进一步说明， 举例是为说明本发明的过程 而非仅限于实施例。以下实施例中所说的菌液、 菌粉、 酶粉或酶液均指巴氏微杆菌 CCTCC M 2011182 的菌液、 菌粉、 酶粉或酶液。
25、。 0029 实施例 1 ： 配制 1%（W/W） 、 pH 7.5 甜菊糖苷转化底物 （甜菊糖苷 ： 水 =1 ： :99（W/W） ， 配制方法下 同） ， 接入 1%（V/V） 巴氏微杆菌液， 37， 220 r/min 动态培养 3 天。培养结束后， 5000 rpm 离心去除菌体， 上清液经絮凝沉淀除杂、 大孔树脂吸附分离、 洗脱液结晶纯化获得高纯度的 甜菊醇， 纯度约为 95%， 甜菊糖的转化率为 90%。 0030 实施例 2 ： 500 mL 转化瓶装 1%（W/W） 、 pH6.5 甜菊糖苷底物， 加 10%（W/W） 酶液， 37转化 2 天。 结束后分离纯化得到纯度约为 。
26、95% 的甜菊醇。 0031 实施例 3 ： 说 明 书 CN 102220274 A CN 102220283 A5/6 页 7 500 mL 转化瓶装 5%（W/W） 、 pH 7.0 甜菊糖苷转化底物， 加 5%（V/V） 菌液， 35培养 3 天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。 0032 实施例 4 ： 500 mL 转化瓶装 0.05% （W/W） 、 pH 5.5 甜菊糖苷底物， 加 1% （W/W） 菌粉， 30培养 24h。 结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。 0033 实施例 5 ： 500 mL 转化瓶装 0.5%（W/W） 、 pH 7.5 甜菊糖苷底物， 加 0.0。
27、1%（W/W） 酶粉， 30转化 4 天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。 0034 实施例 6 ： 500 mL 转化瓶 15% （W/W） 、 pH 6.0 甜菊糖苷转化底物， 加 0.6%（W/W） 菌粉， 32培养 2 天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。 0035 实施例 7 ： 500 mL 转化瓶装 20%（W/W） 、 pH 5.0 甜菊糖苷转化底物， 加 20%（V/V） 菌液， 32培养 5 天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。 0036 实施例 8 ： 500 mL 转化瓶装 30%（W/W） 、 pH 5.0 甜菊糖苷转化底物液， 加 0.1%（V/V） 菌液， 。
28、28 培养 6 天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。 0037 实施例 9 ： 在 500 mL 三角瓶中装 0.01% （W/W） 、 pH 3.5 甜菊糖苷底物， 加 0.01%（W/W） 菌粉， 30 培养 4 天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。 0038 实施例 10 ： 在 500L 的工业反应器中加 10%（W/W） 、 pH 7.0 甜菊糖苷转化底物， 加 15%（V/V） 菌液， 32培养 3 天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。 0039 实施例 11 ： 在 1500L 的工业反应器中加 1.5%（W/W） 、 pH 7.5 甜菊糖苷转化底物， 加 10%（W/W）。
29、 菌 粉， 30培养 3 天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。 0040 实施例 12 ： 在 100L 的工业反应器中加 1%、 pH 6.0（W/W） 甜菊糖苷转化液， 加 10%（V/V） 菌液， 37培养 2 天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。 0041 实施例 13 ： 800 mL 转化瓶装 200 mL 10%（W/W） 、 pH 5.5 甜菊糖苷转化液， 加 8%（V/V） 菌液， 30 培养 5 天。结束后分离纯化获得高纯度的甜菊醇。 0042 实施例 14 ： 与实施例 1 基本相同， 所不同的是底物是悬钩子苷转化液。 0043 实施例 15 ： 与实施例 2 基本相。
30、同， 所不同的是底物是悬钩子苷转化液。 0044 实施例 16 ： 与实施例 3 基本相同， 所不同的是底物是悬钩子苷转化液。 0045 实施例 17 ： 说 明 书 CN 102220274 A CN 102220283 A6/6 页 8 与实施例 4 基本相同， 所不同的是底物是悬钩子苷转化液。 0046 实施例 18 ： 与实施例 1 基本相同， 所不同的是用酶粉转化。 0047 实施例 19 ： 与实施例 1 基本相同， 所不同的是用酶液转化。 0048 实施例 20 ： 与实施例 1 基本相同， 所不同的是用菌液与酶液协同转化。 0049 实施例 21 ： 与实施例 2 基本相同， 所不同的是底物悬钩子苷来自悬钩子叶自行提取。 0050 实施例 22 ： 与实施例 3 基本相同， 所不同的是底物是悬钩子苷来自甜菊糖转化而得。 说 明 书 CN 102220274 A CN 102220283 A1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102220274 A 。