技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及三疣梭子蟹内生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代谢产物及其制备方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)是一种常见的老年性脑神经退行性病变，发病率较高，已成为现代社会严重威胁老年人生命的疾病之一。其死亡率仅次于心血管病、癌症及中风而位居第四。AD发病机制复杂，是一种多病因的疾病，典型的病理变化包括β-淀粉样蛋白(β-amyloidprotein，Aβ)沉积形成老年斑(senileplaque，SP)、神经纤维缠结(neurofibrillarytangles，NFT)、基底前脑胆碱能功能障碍和皮层、海马广泛的神经元丢失及突触形态的改变。近年来，根据AD的病因、病理及分子生物学研究进展，许多学者从不同角度提出了多种病因假说和相应的治疗策略，主要有胆碱能学说、Aβ毒性作用、炎性病变、自由基氧化损伤、脑能量代谢障碍、基因缺陷与突变等。
目前临床治疗AD主要采用基于胆碱能假说即以乙酰胆碱酯酶(acetylcho-linesterase，AchE)为靶点的乙酰胆碱酯酶抑制剂(acetylcholinesteraseinhibitors，AChEIs)，包括：他克林(tetra-hydroaminoacridine，THA)、多奈哌齐、利凡斯的明和加兰他敏等药物。这些药物价格昂贵，具有一定的副作用，且化学合成新的药物难度大，因而如何从天然药物中开发AChEIs成为研究的重点。目前主要集中于中草药及植物内生菌的代谢产物的研究，如刘平等研究了银杏提取物(EGB)对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力及海马神经元凋亡的影响；史大华等以24味中药为研究对象，检测水提物对兔大脑乙酰胆碱酯酶的抑制活性；汪涯等从蛇足石杉中分离到11株具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的内生真菌。海洋来源的内生真菌抗老年痴呆的报道相对较少，而来自三疣梭子蟹的内生真菌更是未见报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明以三疣梭子蟹内生真菌——芽枝霉菌(Cladosporiumsp.)Pt-2CGMCCNo.6562为研究对象，优化发酵条件，并采用有机溶剂萃取，色谱学的手段进行分离，制备对AchE抑制率达70％～90％的芽枝霉的次生代谢产物，与阳性对照他克林相比，具有显著的抑制效果。
本发明的第一个目的在于公开了一种三疣梭子蟹内生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代谢产物。
本发明的第二个目的在于公开了上述次生代谢产物的制备方法。
本发明所采用的技术方案如下：
一种三疣梭子蟹内生芽枝霉菌Pt-2，保藏编号为CGMCCNo.6562，其18SrDNA序列如SEQNo.1所示。
一种三疣梭子蟹内生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代谢产物，所述次生代谢产物是通过下述方法制备所得：
(1)、以三疣梭子蟹的内生芽枝霉菌为菌种，采用液体发酵的方法，在接种量10％、装液量200mL/500mL三角瓶、28℃条件下在发酵培养基中发酵9天，获得发酵物；所述发酵培养基的配方为：30g葡萄糖，3gNaNO3，0.5gKCl，0.5gMgSO4·7H2O，0.01gFeSO4，1gK2HPO4，1g酵母膏，1000mL海水；
(2)、将发酵液在40℃下真空浓缩至原体积的1/3，再用乙酸乙酯进行萃取，萃取液浓缩至干；
(3)、经浓缩至干的芽枝霉菌Pt-2发酵产物的有机相萃取物，采用硅胶柱层析，氯仿/甲醇体系梯度洗脱，获得6个极性段，对活性最高段采用C18反相柱和葡聚糖凝胶层析进行分离，获得AchE抑制率达70～90％的次生代谢产物。
上述技术方案所述的次生代谢产物，其中，AchE抑制率是以他克林作为阳性对照，通过DTNB法测定。
上述技术方案所述的次生代谢产物，其中，AchE抑制率是通过DTNB法测定。
三疣梭子蟹内生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代谢产物的制备方法，包括下述步骤：
(1)、以三疣梭子蟹的内生芽枝霉菌Pt-2为菌种，采用液体发酵的方法，在接种量10％、装液量200mL/500mL三角瓶、28℃条件下在发酵培养基中发酵9天，获得发酵物；所述发酵培养基的配方为：30g葡萄糖，3gNaNO3，0.5gKCl，0.5gMgSO4·7H2O，0.01gFeSO4，1gK2HPO4，1g酵母膏，1000mL海水；
(2)、将发酵液在40℃下真空浓缩至原体积的1/3，再用乙酸乙酯进行萃取，萃取液浓缩至干；
(3)、经浓缩至干的芽枝霉菌Pt-2发酵产物的有机相萃取物，采用硅胶柱层析，氯仿/甲醇体系梯度洗脱，获得6个极性段，对活性最高段采用C18反相柱和葡聚糖凝胶层析进行分离，获得AchE抑制率达70～90％的次生代谢产物。
上述技术方案所述的制备方法，其中，AchE抑制率是以他克林作为阳性对照，通过DTNB法测定。
上述技术方案所述的制备方法，其中，AchE抑制率是通过DTNB法测定。
本发明所采用的三疣梭子蟹内生芽枝霉菌为芽枝霉菌(Cladosporiumsp.)Pt-2，该菌种的菌学特征如下：
1、芽枝霉菌Pt-2菌株形态学特征：
如图10所示，芽枝霉菌Pt-2菌菌落形态规则，生长速度中等，培养两天后菌落直径为2.3cm，菌落表面有短绒毛状气生菌丝，菌落中间隆起，颜色为墨绿色，最边缘为一圈白色菌丝，生长整齐，背面呈墨绿色至黑色。
2、芽枝霉菌Pt-2菌株的孢子形态特征：
如图11所示的显微镜下(放大400倍)的孢子形态，分生孢子梗呈深色，长度不等，末端和外侧可产生分生孢子，分生孢子杆形、椭圆形或柠檬形，壁光滑或轻微粗糙，单细胞伴有黑色痕迹，易散开。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过对三疣梭子蟹的内生芽枝霉菌Pt-2次生代谢产物的分离和纯化，获得了AchE抑制率达70～90％的组分，为预防老年痴呆病生物药品的开发提供理论依据。
2、本发明所制备的次生代谢产物克服了目前常用乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物价格昂贵，具有一定的副作用，且化学合成新的药物难度大的缺点，提供了一种新的抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物，并提供了一种新的制备方法。
附图说明：
1、图1为碳源对发酵液提取物AchE抑制率的影响效果柱形图；
2、图2为氮源对发酵液提取物AchE抑制率的影响效果柱形图；
3、图3为接种量对发酵液提取物AchE抑制率的影响效果柱形图；
4、图4为装液量对发酵液提取物AchE抑制率的影响效果柱形图；
5、图5为培养温度对发酵液提取物AchE抑制率的影响效果柱形图；
6、图6为发酵时间对发酵液提取物抑制AchE活性的影响效果柱形图；
7、图7为硅胶柱层析分离流程图；
8、图8为各洗脱组分对AchE抑制率的影响效果柱状图；
9、图9为反相柱和葡聚糖凝胶柱分离流程图；
10、图10为芽枝霉菌Pt-2菌的菌落形态；
11、图11为芽枝霉菌Pt-2菌在显微镜下放大400倍观察到的孢子形态；
12、图12为芽枝霉菌Pt-2菌的18SrDNA片段凝胶电泳图；
13、图13为芽枝霉菌Pt-2菌的进化树。
菌株保藏信息：本发明芽枝霉菌Pt-2(Cladosporiumsp.Pt-2)，分类命名为芽枝霉Cladosporiumsp.，已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.6562，保藏日期为2012年9月11日。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对对本发明作进一步的说明。
实施例1：芽枝霉菌Pt-2(Cladosporiumsp.Pt-2)的筛选获得：
一、菌株的分离
1.1、培养基
分离用培养基：马铃薯琼脂(PDA)培养基，加入终浓度为200U/mL的青霉素钾和150U/ml硫酸链霉素。
液体发酵培养基(改良查氏培养基)：30g蔗糖，3gNaNO3，0.5gKCL，0.5gMgSO4·7H2O，0.01gFeSO4，1gK2HPO4依次加入1000mL海水中搅匀溶解，再加1g酵母膏略加热溶解，121℃灭菌20min备用。
1.2、菌株分离方法
将蟹去壳，取其腮和肠胃部位，先用75％酒精浸泡5min进行表面消毒，然后剪碎加3mL无菌水研磨，涂布于分离培养基上，将平板放置于恒温培养箱中，28℃倒置培养。待平板长出菌丝时，采用菌丝尖端切割法对内生真菌进行分离纯化，将纯化好的真菌转于斜面，于4℃冰箱保存备用。
1.3、发酵培养
将分离得到的内生真菌接种到装有200mL查氏培养基的锥形瓶中，置于振荡培养箱中培养14天。培养条件为28℃，120rpm。
发酵结束后，发酵液进行过滤，上清液用乙酸乙酯萃取，所得萃取相采用旋转蒸发仪蒸发、浓缩得提取物。提取物采用DTNB法测定其抑制乙酰胆碱酯酶的活性.
二、菌株的鉴定
1、方法：
1.1、菌株形态鉴定
将保藏的菌种于PDA平板中培养，观察菌落形态特征及产孢情况。
菌落特征主要包括菌落的形状、大小、颜色、隆起、表面状况、质地、光泽等。在显微镜下观察细胞的结构及孢子的形状、着生位置、数量及排列等。
1.2、芽枝霉菌Pt-2菌株18SrDNA扩增及其序列分析：
(1)、基因组提取及电泳检测
①、基因组提取：按照生工SK1375真菌基因组DNA抽提试剂盒说明书提取。
②、PCR反应：
PCR体系建立(50ul)：
PCR程序设定
预变性98℃5min；循环95℃35S，55℃35S，72℃40s，35个循环；延伸8min。
引物序列：
NS15’GTAGTCATATGCTTGTCTC3’
NS65’GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC3’
(2)、PCR产物电泳：
(3)、DNA琼脂糖切胶纯化：
由PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带。
(4)、目的片断TA克隆：
包括连接反应、连接产物转化、蓝白斑筛选，具体步骤参考黄玖利，海南粗榧内生真菌S15化学成分研究[38]。
(5)、质粒提取后DNA测序：
由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
(6)、系统进化树的构建及分析：
从NCBI的基因库中寻找与Pt-2的18SrDNA相关的序列，将相关性最高的菌株同Pt-2菌株一同构建系统进化树，并进行同源性比较，进而确定菌株的分类。
2、芽枝霉菌Pt-2菌株鉴定结果
2.1、芽枝霉菌Pt-2菌株形态学特征
如图10所示的，芽枝霉菌Pt-2菌菌落形态规则，生长速度中等，培养两天后菌落直径为2.3cm，菌落表面有短绒毛状气生菌丝，菌落中间隆起，颜色为墨绿色，最边缘为一圈白色菌丝生长整齐，背面呈墨绿色至黑色。
图11为显微镜下(放大400倍)观察到的孢子形态，分生孢子梗呈深色，长度不等，末端和外侧可产生分生孢子，分生孢子杆形、椭圆形或柠檬形，壁光滑或轻微粗糙，单细胞伴有黑色痕迹，易散开。
2.2、PCR产物电泳图谱：
由图12可以看出，芽枝霉菌Pt-2菌株18SrDNA片段长度为1200bp-1500bp之间。
2.3、PCR测序结果：
芽枝霉菌Pt-2菌株的18SrDNA序列如SEQNo.1所示，菌株的18SrDNA序列长1418bp，与电泳结果一致。利用Blast软件将此序列和美国生物信息中心(NCBI)进行对比分析，结果表明与CladosporiumbruhneistrainCPC5101相似性最高
2.4、进化树的构建及分析：
应用MEGA5.05软件构建进化树，结果表明：芽枝霉菌Pt-2Pt-2与芽枝霉属Cladosporiumsp.18SrDNA的相似度在99％以上，结合形态学和分子生物学的结果，最终确定该菌为芽枝霉属，命名为Cladosporiumsp.Pt-2。
2.5、发酵液的乙酸乙酯相的抑制乙酰胆碱酯酶活性：
从螃蟹中分离出的芽枝霉菌Pt-2具有很好的抑制AchE活性，50mg/ml的浓度下，乙酰胆碱酯酶的抑制率达到60％-80％。
实施例2、三疣梭子蟹内生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代谢产物的制备：
三疣梭子蟹内生芽枝霉菌Pt-2抑制AchE的次生代谢产物的制备过程为：
(1)、以三疣梭子蟹的内生芽枝霉菌Pt-2为菌种，采用液体发酵的方法，在接种量10％、装液量200mL/500mL三角瓶、28℃条件下在发酵培养基中发酵9天，获得发酵物；所述发酵培养基的配方为：30g葡萄糖，3gNaNO3，0.5gKCl，0.5gMgSO4·7H2O，0.01gFeSO4，1gK2HPO4，1g酵母膏，1000mL海水；
(2)、将发酵液在40℃下真空浓缩至原体积的1/3，再用乙酸乙酯进行萃取，萃取液浓缩至干；
(3)、经浓缩至干的芽枝霉菌发酵产物的有机相萃取物，采用硅胶柱层析，氯仿/甲醇体系梯度洗脱，获得6个极性段，对活性最高段采用C18反相柱和葡聚糖凝胶层析进行分离，获得AchE抑制率达70～90％的次生代谢产物。
本实施例的参数通过以下方法得到：
一、本发明中AchE抑制率的测定方法：
采用DTNB法测定发酵液对AchE的抑制率，下述各步骤中抑制率的测定均采用此方法，具体步骤为：
将提取物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成浓度为50mg/mL的溶液。取4支10mL的试管，试管1～4分别对应于空白组、对照组、样品组和本底组，将4支试管放于37℃的恒温水浴中；先向每支试管中添加乙酰胆碱碘代物20μL、显色剂DTNB100μL和pH＝8.0磷酸缓冲液，其中试管1～4对应的pH＝8.0磷酸缓冲液体积为2950μL、2880μL、2880μL和2950μL；然后向1、2号试管中各加入DMS0100μL，3、4号试管中各加入待测样品溶液100μL，2、3号试管中再各加入70μL的乙酰胆碱酯酶后混匀；在水浴中反应4min20s后再向各试管中分别添加40％的SDS终止剂100μL终止反应；最后在412nm下测其OD值，通过计算公式(一)计算出样品对乙酰胆碱酯酶的抑制率，
公式(一)：
二、最佳发酵条件的确定：
具有抑制AchE活性的芽枝霉菌次生代谢产物的最佳发酵条件为：
发酵培养基的配方为：30g葡萄糖，3gNaNO3，0.5gKCl，0.5gMgSO4·7H2O，0.01gFeSO4，1gK2HPO4，1g酵母膏，1000mL海水；
接种量10％、装液量200mL/500mL三角瓶、28℃，发酵9天，所得产物对AchE的抑制率可达60％～80％。
具体操作：将菌种Cladosporiumsp.接种于PDA平板培养基上，于28℃培养4天。然后在无菌条件下，用打孔器在菌丝体生长旺盛的区域打取4块直径约为5mm的菌体，接种于装有100mL种子培养基(查氏培养基)的250mL三角瓶中，于28℃，120rpm条件下振荡培养3天，然后将种子液接种于装有200mL发酵培养基的500mL三角瓶中，接种量为10％，于28℃、120rpm条件下振荡培养9天后取出，四层纱布过滤，除去菌体，保留上清液，然后采用旋转蒸发仪浓缩蒸干，所得代谢产物采用DTNB法测定其对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，具体操作见步骤六。为了提高抑制乙酰胆碱酯酶的活性成份的产量，对该真菌进行发酵条件的优化，在固定其他参数不变的情况下，分别考察不同的碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、淀粉)；不同的氮源(酵母膏、蛋白胨、尿素、硝酸铵、黄豆粉)；不同的发酵时间(5天、7天、9天、11天和13天)；不同的接种量(1％、5％、10％、15％和20％)；不同的装液量(50ml、100ml、150ml、200ml和250ml每500ml三角瓶)；培养温度(20℃、24℃、28℃、32℃和36℃)和发酵时间(5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天和13天)对发酵液提取物AchE抑制率(抑制率的测定按照步骤一测定)的影响，确定最佳的发酵条件。每个实验操作重复三次。
在固定其他参数不变的情况下，葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和淀粉5种不同碳源对发酵液提取物AchE抑制率的影响如图1所示；酵母膏、蛋白胨、尿素、硝酸铵和黄豆粉)5种不同氮源对发酵液提取物AchE抑制率的影响如图2所示；不同的发酵时间(5天、7天、9天、11天和13天)对发酵液提取物AchE抑制率的影响如图3所示；不同的接种量(1％、5％、10％、15％和20％)对发酵液提取物AchE抑制率的影响如图4所示；不同的装液量(每500ml三角瓶分别装液50ml、100ml、150ml、200ml和250ml)对发酵液提取物AchE抑制率的影响如图5所示；发酵时间(5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天和13天)对发酵液提取物AchE抑制率的影响如图6所示。
三、萃取有机相的选择：
(一)、有机相萃取及其萃取液提取率的测定；
将步骤(一)所得到的发酵液在40℃下真空浓缩至原体积的1/3，再分别用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇三种有机相进行萃取；
将氯仿、乙酸乙酯、正丁醇三种有机相萃取液，分别于40℃下真空浓缩至干，并测得其提取率分别为5～10％，30～60％和20～30％。
将氯仿、乙酸乙酯、正丁醇三种有机相萃取液以及剩余的水相，分别置于旋转蒸发仪中真空浓缩至干，并测定其质量，分别记为m1，m2，m3和m4，结果如表1所示。计算三种不同有机萃取溶剂的萃取率，分别为5～10％，30～60％和15～25％。计算公式为：
不同溶剂的萃取率＝不同有机溶剂相的质量(m1，m2或m3)/(m1+m2+m3+m4)
表1氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水相的质量
氯仿相(m1) 乙酸乙酪相(m2) 正丁醇相(m3) 水相(m4) 质量(g) 0.18～0.36 1.08～2.16 0.54～0.9 0.18～1.8
注：共1200ml发酵液。
(二)、有机相萃取样品液的制备及其对AchE的抑制率；
将步骤(二)所得到的三种有机相萃取液，分别在40℃下真空浓缩至干，用DMSO配成终浓度为50mg/ml的有机相萃取样品液，并分别测得其对AchE的抑制率在20～80％。
(三)、萃取有机相的选择；
考虑提取率和对AchE的抑制率两个因素，在氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等三种萃取有机相中，本发明选取乙酸乙酯作为萃取特定有机相。
四、乙酸乙酯相的分离步骤(次生代谢产物的提纯方法)：
1、硅胶柱分离：
将上述步骤所得到的乙酸乙酯萃取物，采用硅胶柱层析进行系统分离，氯仿/甲醇体系梯度洗脱，获得6个极性段，每个极性段对AchE的抑制率达20％～70％；
将上述菌种大量培养发酵，按照上述步骤所得到的乙酸乙酯萃取物(10.8g)，采用硅胶柱(85g硅胶，200-300目)层析的方法进行系统分离，氯仿/甲醇体系(氯仿∶甲醇＝100∶0，100∶1，100∶2，100∶4，100∶8，100∶16)进行梯度洗脱，获得6个极性段，分别测定每个极性段对AchE的抑制率，其抑制率达20％～70％。
硅胶柱层析分离流程如图7所示；各洗脱组分对AchE抑制率的影响如图8所示。
2、C18反相柱和葡聚糖凝胶柱分离：
将上述步骤(1)所得的6个极性段，选择抑制AchE活性最高的段，采用C18反相柱和葡聚糖凝胶层析进一步进行分离，获得乙酰胆碱酯酶抑制率达70％～90％的组分；
将上述步骤(1)所得的6个极性段，选择抑制AchE活性最高的段C5(氯仿/甲醇＝100∶8)，采用C18反相柱(30g，50μm)，水/甲醇体系进行分离(水∶甲醇＝100∶0，90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50)，得到6个极性段，分别进行AchE抑制活性的测定；选择活性最高的两个极性段(水/甲醇＝90∶10和80∶20段)(抑制率可达60％～70％)再进行葡聚糖凝胶SephadexLH-20层析分离，洗脱溶剂为甲醇，最终可得到乙酰胆碱酯酶抑制率达70％～90％的组分。C18反相柱和葡聚糖凝胶柱分离流程如图9所示。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。