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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410567571.3 (22)申请日 2014.10.22 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104313005 A (43)申请公布日 2015.01.28 (73)专利权人 江苏省农业科学院 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇 国家农业科技园区江苏省农业科学院 基地 (72)发明人 周剑忠夏秀东王英刘小莉 李莹张丽霞黄自苏 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 代理人 肖明芳 (51)Int.Cl. C12N 。
2、11/10(2006.01) A23C 11/10(2006.01) A23C 9/127(2006.01) A23L 2/02(2006.01) 审查员 徐浩 (54)发明名称 一种高稳定性乳酸菌微胶囊及其制备方法 与应用 (57)摘要 本发明公开了一种高稳定性乳酸菌微胶囊 及其制备方法与应用， 属于生物工程技术领域。 乳酸菌细胞悬液与无菌的酪蛋白酸钠、 明胶和乳 酸钙的混合液混合， 通过微囊化细胞无菌制备装 置， 滴入无菌海藻酸钠溶液中， 形成乳酸菌液芯 胶囊， 这种含菌胶囊用谷氨酰胺转胺酶处理， 使 囊壁中酪蛋白酸钠和明胶发生交联， 增强了胶囊 的机械强度， 增加了连续培养和连续接种过程。
3、稳 定性， 延长含菌胶囊连续接种时间， 提高了含菌 胶囊的使用寿命， 降低了发酵产品的单位成本， 提高企业的经济效益和市场竞争力， 具有广阔的 市场前景。 权利要求书2页 说明书6页 附图1页 CN 104313005 B 2018.10.30 CN 104313005 B 1.一种高稳定性乳酸菌微胶囊的制备方法， 其特征在于， 它包括如下步骤： (1)将冷冻干燥的乳酸菌接种到MRS培养基将菌种活化两次； (2)将步骤(1)活化后的菌种接种到乳清培养基或MRS培养基中， 30-44培养18-24小 时； (3)将步骤(2)得到的发酵液经离心弃去除上清液， 剩余的菌体悬浮于无菌海藻糖水溶 液中，。
4、 与乳酸钙、 酪蛋白酸钠和明胶的无菌混合水溶液混匀； (4)将步骤(3)得到的混匀溶液通过微囊化细胞无菌制备装置， 喷入无菌的海藻酸钠水 溶液中， 制备得到微胶囊； (5)步骤(4)得到的微胶囊用无菌水冲洗后， 放入谷氨酰胺转胺酶溶液， 在30-40条件 下反应5-6小时； (6)将步骤(5)得到的反应液过滤， 弃去谷氨酰胺转胺酶溶液， 剩余微胶囊用无菌水冲 洗后， 将微胶囊放入乳酸钙水溶液中处理40-60分钟， 过滤， 弃去乳酸钙溶液， 用无菌水冲 洗； (7)将步骤(6)得到的微胶囊放入无菌乳酸菌增殖培养液中， 在30-37恒定pH6-7、 补 料连续培养， 待微胶囊内细胞密度达到1011。
5、cfu/g以上， 停止培养， 过滤， 去除培养基， 放入微 胶囊保护液中， 0-4储存； 步骤(1)和(2)中， 所述的MRS培养基配方为， 每1L蒸馏水， 加入10g蛋白胨、 10g牛肉膏、 5g酵母提取物、 2gK2HPO4、 2g柠檬酸二铵、 5g乙酸钠、 20g葡萄糖、 1mL吐温80、 0.58gMgSO4.7H2O、 0.25gMnSO4.4H2O， 混匀， pH6.2-6.4； 步骤(2)中， 所述的乳清培养基为： 每 1L蒸馏水， 加入46g乳清粉、 12g大豆分离蛋白、 5.3g酵母膏、 2.6g K2HPO4、 1.2g KH2PO4， 混 匀， pH 6.8-7.2； 步。
6、骤(3)中， 所述的海藻糖水溶液中， 溶质海藻糖质量百分比浓度为0.5-0.8； 菌体与 无菌海藻糖水溶液的质量比为32-38； 所述的乳酸钙、 酪蛋白酸钠和明胶的无菌混合水溶 液中， 溶质乳酸钙的质量百分浓度为3-5、 溶质酪蛋白酸钠的质量百分浓度为5.5-6.5、 溶质明胶的质量百分浓度为1-1.5； 含乳酸菌的海藻糖水溶液与乳酸钙、 酪蛋白酸钠和明 胶的无菌混合水溶液的质量比为1-1.5 6-8； 步骤(4)中， 所述的海藻酸钠水溶液中， 溶质海藻酸钠的质量百分浓度为0.4-1.0， 且 还含质量百份浓度为0.1-0.15的吐温80； 所述海藻酸钠水溶液的用量为步骤(3)得到的 混匀溶液。
7、质量的5-8倍； 步骤(5)中， 谷氨酰胺转胺酶的加入量14-20U/100g微胶囊； 步骤(6)中， 所述的乳酸钙水溶液中， 溶质乳酸钙的质量百分浓度为2-4； 步骤(7)中， 所述的乳酸菌增殖培养液配方如下： 每1L蒸馏水， 加入20g酪蛋白粉、 30g大 豆蛋白水解液、 0.6g酵母粉、 3gK2HPO4、 6g乳酸钙、 10g葡萄糖、 15g乳糖， 混匀， pH6.8-7.2； 所 述的微胶囊保护液为配方为： 海藻糖0.1wt， 甘油8wt， 木糖醇1.2wt， 蔗糖3wt， 乳酸 钙0.4wt， 其余为水。 2.权利要求1中所述的制备方法制备得到的高稳定性乳酸菌微胶囊。 3.根据权利。
8、要求2所述的高稳定性乳酸菌微胶囊， 其特征在于， 所述的乳酸菌为单种乳 酸菌或者多种乳酸菌。 4.权利要求2所述的高稳定性乳酸菌微胶囊在牛奶、 果汁或蔬菜汁连续接种用发酵剂 权利要求书 1/2 页 2 CN 104313005 B 2 产品的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 104313005 B 3 一种高稳定性乳酸菌微胶囊及其制备方法与应用 技术领域 0001 本发明为一种高稳定性乳酸菌微囊及其制备方法与应用， 属于生物工程技术领 域， 是一种增加连续培养和连续接种过程稳定性， 延长含菌胶囊连续接种时间， 提高含菌胶 囊的使用寿命， 提高发酵乳制品、 发酵果蔬汁等连续接种发酵剂效率。
9、的新技术。 背景技术 0002 传统液体发酵剂是指将生产用的纯种培养物， 经过母发酵剂、 中间发酵剂、 生产发 酵剂等逐级扩大增殖后用于生产。 这类发酵剂在最终使用时， 菌体浓度只有108-109cfu/ml， 而且在操作上繁杂， 技术上不易控制， 经常由于菌种比例失调、 活力下降， 易变异或污染而 导致产品质量不稳定。 目前国外已经基本不使用这类发酵剂， 然而我国目前大多数生产厂 家仍采用传统的液体发酵剂工艺进行生产， 其主要原因是生产成本低廉。 0003 冻干型的直投式发酵剂近年得到了较快推广和应用。 这种发酵剂是在控制pH的状 态下进行接种发酵， 离心浓缩， 以冷冻或干燥的状态出售。 最。
10、终产品中活菌数可以达到1010- 1011cfu/g， 这类发酵剂的优点是： 1)节省菌种车间； 2)减少乳品厂的投资； 3)简化了工艺过 程； 4)避免了技术原因造成的质量不稳定， 有利于发酵乳产品的精确控制和生产标准化。 但 其缺点也很明显： 1)由于冻干设备和能耗的因素， 这类发酵剂的生产成本较高； 2)在离心、 冷冻或干燥过程中会不同程度地对菌体造成损害而导致有效菌体数量下降； 3)菌体在生产 与保藏时所处环境差异较大而导致菌种活力较低， 复苏时间较长， 延长了发酵时间(一般要 6-8小时)。 目前我国直投式冻干发酵剂的供应主要由国外厂家把持， 如丹麦汉森(Hansen) 公司、 法国。
11、罗地亚(Rhodia)公司、 美国Marshed公司、 澳大利亚Csiro研究所等， 这些公司的 产品占据了中国近95的乳酸菌发酵剂市场， 而且售价较高， 如果使用这些公司的直投发 酵剂， 每吨产品的成本增加近200元。 0004 研制开发具有自主知识产权的新型、 高效食品发酵剂生产技术， 克服了上述两类 发酵剂的不足， 即简化了生产工艺， 又降低了生产成本， 显得尤为重要。 0005 近年来， 我们在微胶囊发酵剂的研制及应用方面进行了积极探索， 首创的 “生物微 反应器高密度培养技术” 避免了传统悬浮培养的缺点和限制， 利用合适的包囊材料， 优化包 囊工艺， 制备出强度有较大提高的微胶囊， 。
12、并对培养基和培养条件进行了优化， 通过连续培 养， 制成高密度的微囊化发酵剂。 从培养基中分离微囊化细胞不需经过超滤或冷冻离心， 而 用普通的离心或微过滤就可进行， 因此大大降低了生产成本， 更重要的是减轻离心对菌体 的伤害。 另外， 细胞包囊后还可以防止氧对益生型厌氧菌或兼性厌氧菌的损伤， 防止噬菌体 感染， 起到发酵剂制备工艺过程对细胞的保护作用。 装入特定的生物反应器可进行连续接 种， 重复使用， 大大减少发酵剂的用量， 降低发酵产品的生产成本。 目前微囊化发酵剂在实 际的应用中面临一些问题， 胶囊的机械强度低， 使用过程中易破损， 如何开发制备胶囊新材 料和对现有的胶囊材料进行改性来制。
13、备高强度的微胶囊， 提高胶囊在连续接种过程中稳定 性， 是微胶囊发酵剂实际生产利用中亟待解决的问题。 说明书 1/6 页 4 CN 104313005 B 4 发明内容 0006 本发明所要解决的技术问题是针对目前微囊化发酵剂在连续接种过程中， 随使用 时间增加， 微胶囊强度减弱、 破损率增加， 严重影响接种效率、 降低生产产能、 增加生产成本 的问题， 提供一种机械强度高， 连续培养和连续接种过程稳定性好、 使用寿命长的含乳酸菌 微胶囊， 提高接种效率， 降低了发酵产品的单位成本。 0007 本发明还要解决的技术问题是提供上述高稳定性乳酸菌微胶囊的制备方法。 0008 本发明最后要解决的技术。
14、问题是提供上述高稳定性乳酸菌微胶囊的应用。 0009 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案如下： 0010 一种高稳定性乳酸菌微胶囊的制备方法， 它包括如下步骤： 0011 (1)将冷冻干燥的乳酸菌接种到MRS培养基将菌种活化两次； 0012 (2)将步骤(1)活化后的菌种接种到乳清培养基或MRS培养基中， 30-44培养18- 24小时； 0013 (3)将步骤(2)得到的发酵液经离心弃去除上清液， 剩余的菌体悬浮于无菌海藻糖 水溶液中， 与乳酸钙、 酪蛋白酸钠和明胶的无菌混合水溶液混匀； 0014 (4)将步骤(3)得到的混匀溶液通过微囊化细胞无菌制备装置， 喷入无菌的海藻酸 钠水溶。
15、液中， 制备得到微胶囊； 0015 (5)步骤(4)得到的微胶囊用无菌水冲洗后， 放入谷氨酰胺转胺酶(TGase)溶液， 在 30-40条件下反应5-6小时； 0016 (6)将步骤(5)得到的反应液过滤， 弃去谷氨酰胺转胺酶溶液， 剩余微胶囊用无菌 水冲洗后， 将微胶囊放入乳酸钙水溶液中处理40-60分钟， 过滤， 弃去乳酸钙溶液， 用无菌水 冲洗； 0017 (7)将步骤(6)得到的微胶囊放入无菌乳酸菌增殖培养液中， 在30-37恒定pH6- 7、 补料连续培养， 待微胶囊内细胞密度达到1011cfu/g以上， 停止培养， 过滤， 去除培养基， 放 入微胶囊保护液中， 0-4储存。 001。
16、8 步骤(1)和(2)中， 所述的MRS培养基配方为， 每1L蒸馏水， 加入10g蛋白胨、 10g牛肉 膏、 5g酵母提取物、 2gK2HPO4、 2g柠檬酸二铵、 5g乙酸钠、 20g葡萄糖、 1mL吐温80、 0.58gMgSO4.7H2O、 0.25gMnSO4.4H2O， 混匀， pH6.2-6.4。 0019 步骤(2)中， 所述的乳清培养基为： 每1L蒸馏水， 加入46g乳清粉、 12g大豆分离蛋 白、 5.3g酵母膏、 2.6g K2HPO4、 1.2g KH2PO4， 混匀， pH6.8-7.2。 0020 步骤(2)中， 优选30-44培养18小时。 0021 步骤(3)中，。
17、 所述的海藻糖水溶液中， 溶质海藻糖质量百分比浓度为0.5-0.8(优 选0.5)； 菌体与无菌海藻糖水溶液的质量比为32-38； 所述的乳酸钙、 酪蛋白酸钠和明 胶的无菌混合水溶液中， 溶质乳酸钙的质量百分浓度为3-5、 溶质酪蛋白酸钠的质量百分 浓度为5.5-6.5、 溶质明胶的质量百分浓度为1-1.5； 含乳酸菌的海藻糖水溶液与乳酸 钙、 酪蛋白酸钠和明胶的无菌混合水溶液的质量比为1-1.5： 6-8(优选1:6)。 0022 步 骤 (4) 中 ， 所 述的 微 囊 化 细胞 无 菌 制备 装 置 ， 其 结 构 参 考中 国 专 利 ZL200820035824.2。 0023 步骤。
18、(4)中， 所述的海藻酸钠水溶液中， 溶质海藻酸钠的质量百分浓度为0.4- 说明书 2/6 页 5 CN 104313005 B 5 1.0， 且还含质量百份浓度为0.1-0.15(优选0.15)的吐温80； 所述海藻酸钠水溶液的 用量为步骤(3)得到的混匀溶液质量的5-8倍。 0024 步骤(5)中， 谷氨酰胺转胺酶的加入量14-20U/100g微胶囊。 0025 一个谷氨酰胺转氨酶活力单位(U)定义为： 37时每分钟催化形成1 mol L-谷氨 酸-单羟肟酸的酶量为一个酶单位。 0026 步骤(6)中， 所述的乳酸钙水溶液中， 溶质乳酸钙的质量百分浓度为2-4(优选 2)。 0027 步骤。
19、(7)中， 所述的乳酸菌增殖培养液配方如下： 每1L蒸馏水， 加入20g酪蛋白粉、 30g大豆蛋白水解液、 0.6g酵母粉、 3gK2HPO4、 6g乳酸钙、 10g葡萄糖、 15g乳糖， 混匀， pH6.8- 7.2； 所述的微胶囊保护液配方为： 海藻糖0.1wt， 甘油8wt， 木糖醇1.2wt， 蔗糖3wt， 乳酸钙0.4wt， 其余为水。 0028 上述制备方法制备得到的高稳定性乳酸菌微胶囊也在本发明的保护范围内。 0029 其中， 所述的乳酸菌为单种乳酸菌或者多种乳酸菌。 0030 上述高稳定性乳酸菌微胶囊在牛奶、 果汁或蔬菜汁连续接种用发酵剂产品的应用 也在本发明的保护范围之内。 。
20、0031 有益效果： 本发明利用生物工程技术， 用高稳定性乳酸菌微囊制备技术制得的连 续接种乳酸菌发酵剂， 克服了现有连续接种发酵剂微胶囊强度低、 破损率高的问题， 提高接 种效率， 降低了发酵产品的单位成本。 0032 1.既能在培养过程有效提高微囊内细胞密度(1011cfu/g)， 又能在连续接种过程 中降低胶囊破损率。 0033 2.发酵剂的生产成本低， 不需高速冷冻离心(或超滤)， 冷冻干燥工序， 只需经普通 过滤就可分离菌体。 0034 3.乳酸菌细胞包囊后， 可以防止嗜菌体感染， 从而保证发酵成功。 0035 4.在连续生产过程中， 可以基本保持各菌种间比例， 确保连续生产发酵产品。
21、的风 味基本一致。 附图说明 0036 图1为连续接种时间对胶囊强度和破损率的影响。 具体实施方式 0037 根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。 然而， 本领域的技术人员容易理解， 实 施例所描述的内容仅用于说明本发明， 而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。 0038 以下实施例所用乳酸菌都是目前生产上常规菌种， 公众可以直接从市场上购买。 0039 实施例1： 0040 一种高稳定性乳酸菌微胶囊的制备方法， 它包括如下步骤： 0041 (1)将冷冻干燥的乳酸菌接种到MRS培养基将菌种活化两次。 0042 (2)将步骤(1)活化后的菌种接种到乳清培养基或MRS培养基中， 。
22、37培养18小时。 0043 (3)将步骤(2)得到的发酵液经离心(5000rpm， 10min)弃去除上清液， 剩余的菌体 说明书 3/6 页 6 CN 104313005 B 6 悬浮于无菌海藻糖水溶液中， 与乳酸钙、 酪蛋白酸钠和明胶的无菌混合水溶液混匀； 所述的 海藻糖水溶液中， 溶质海藻糖质量百分比浓度为0.5； 菌体与无菌海藻糖水溶液的质量比 为35； 所述的乳酸钙、 酪蛋白酸钠和明胶的无菌混合水溶液中， 溶质乳酸钙的质量百分浓 度为4、 溶质酪蛋白酸钠的质量百分浓度为6、 溶质明胶的质量百分浓度为1.5； 含乳 酸菌的海藻糖水溶液与乳酸钙、 酪蛋白酸钠和明胶的无菌混合水溶液的质量。
23、比为1:6。 0044 (4)将步骤(3)得到的混匀溶液通过微囊化细胞无菌制备装置(参考中国专利 ZL200820035824.2)， 喷入无菌的海藻酸钠水溶液中， 制备得到微胶囊； 所述的海藻酸钠水 溶液中， 溶质海藻酸钠的质量百分浓度为0.6， 且还含质量百份浓度为0.15的吐温80； 所述海藻酸钠水溶液的用量为步骤(3)得到的混匀溶液质量的6倍。 0045 (5)步骤(4)得到的微胶囊用无菌水冲洗后， 放入谷氨酰胺转胺酶(TGase)溶液， 谷 氨酰胺转胺酶的加入量18U/100g微胶囊， 在37条件下反应5.5小时。 0046 (6)将步骤(5)得到的反应液过滤， 弃去谷氨酰胺转胺酶溶。
24、液， 剩余微胶囊用无菌 水冲洗后， 将微胶囊放入乳酸钙水溶液中处理50分钟， 所述的乳酸钙水溶液中， 溶质乳酸钙 的质量百分浓度为2， 过滤， 弃去乳酸钙溶液， 用无菌水冲洗。 0047 (7)将步骤(6)得到的微胶囊放入无菌乳酸菌增殖培养液中， 在35恒定pH6-7、 补 料连续培养， 待微胶囊内细胞密度达到1011cfu/g以上， 停止培养， 过滤， 去除培养基， 放入微 胶囊保护液中， 0-4储存。 0048 步骤(1)和(2)中， 所述的MRS培养基配方为， 每1L蒸馏水， 加入10g蛋白胨、 10g牛肉 膏、 5g酵母提取物、 2gK2HPO4、 2g柠檬酸二铵、 5g乙酸钠、 20。
25、g葡萄糖、 1mL吐温80、 0.58gMgSO4.7H2O、 0.25gMnSO4.4H2O， 混匀， pH6.2-6.4。 0049 步骤(2)中， 所述的乳清培养基为： 每1L蒸馏水， 加入46g乳清粉、 12g大豆分离蛋 白、 5.3g酵母膏、 2.6g K2HPO4、 1.2g KH2PO4， 混匀， pH6.8-7.2。 0050 步骤(7)中， 所述的乳酸菌增殖培养液配方如下： 每1L蒸馏水， 加入20g酪蛋白粉、 30g大豆蛋白水解液、 0.6g酵母粉、 3gK2HPO4、 6g乳酸钙、 10g葡萄糖、 15g乳糖， 混匀， pH6.8- 7.2； 所述的微胶囊保护液配方为： 。
26、海藻糖0.1wt， 甘油8wt， 木糖醇1.2wt， 蔗糖3wt， 乳酸钙0.4wt， 其余为水。 0051 用上述高稳定性乳酸菌微囊发酵剂， 包括含一种乳酸菌的微胶囊 含多种乳酸菌 的微胶囊、 各单种乳酸菌微胶囊混合的乳酸菌微囊发酵剂， 广泛应用于牛奶、 豆奶、 果蔬汁 连续接种， 连续接种过程中机械强度和破损率结果见图1。 0052 破损率小于5对连续接种产量和发酵产品品质影响不显著， 高于10影响显著。 用本方法制备的乳酸菌胶囊可在生物反应器连续接种50-55天， 显著高于目前的24天(液芯 微囊发酵剂连续接种稳定性分析,食品科学,2013,21,154-157)。 0053 微胶囊机械。
27、强度检测： 采用正面按压法测量。 将胶囊放在电子天平上， 用适当大小 的砝码对其正面逐渐加压直至破裂， 天平显示的压力发生由小变大， 再突然变小的突变， 记 录此时承受的最大正面压力即该微胶囊的机械强度。 每批微胶囊随机取20个， 用破裂压力 的平均值表征其机械强度。 0054 胶囊破损率检测： 在小型生物反应器中装入300颗乳酸菌微胶囊， 进行连续接种试 验， 每3天取出胶囊， 数完好胶囊的数量， 计算出破损率。 0055 实施例2： 说明书 4/6 页 7 CN 104313005 B 7 0056 一种高稳定性乳酸菌微胶囊的制备方法， 它包括如下步骤： 0057 (1)将冷冻干燥的乳酸菌。
28、接种到MRS培养基将菌种活化两次。 0058 (2)将步骤(1)活化后的菌种接种到乳清培养基或MRS培养基中， 30培养20小时。 0059 (3)将步骤(2)得到的发酵液经离心(5000rpm， 10min)弃去除上清液， 剩余的菌体 悬浮于无菌海藻糖水溶液中， 与乳酸钙、 酪蛋白酸钠和明胶的无菌混合水溶液混匀； 所述的 海藻糖水溶液中， 溶质海藻糖质量百分比浓度为0.6(优选0.5)； 菌体与无菌海藻糖水 溶液的质量比为32； 所述的乳酸钙、 酪蛋白酸钠和明胶的无菌混合水溶液中， 溶质乳酸钙 的质量百分浓度为3、 溶质酪蛋白酸钠的质量百分浓度为5.5、 溶质明胶的质量百分浓 度为1； 含乳。
29、酸菌的海藻糖水溶液与乳酸钙、 酪蛋白酸钠和明胶的无菌混合水溶液的质量 比为1： 8。 0060 (4)将步骤(3)得到的混匀溶液通过微囊化细胞无菌制备装置(参考中国专利 ZL200820035824.2)， 喷入无菌的海藻酸钠水溶液中， 制备得到微胶囊； 所述的海藻酸钠水 溶液中， 溶质海藻酸钠的质量百分浓度为0.4， 且还含质量百份浓度为0.1的吐温80； 所 述海藻酸钠水溶液的用量为步骤(3)得到的混匀溶液质量的5倍。 0061 (5)步骤(4)得到的微胶囊用无菌水冲洗后， 放入谷氨酰胺转胺酶(TGase)溶液， 谷 氨酰胺转胺酶的加入量14U/100g微胶囊， 在30条件下反应5小时。 。
30、0062 (6)将步骤(5)得到的反应液过滤， 弃去谷氨酰胺转胺酶溶液， 剩余微胶囊用无菌 水冲洗后， 将微胶囊放入乳酸钙水溶液中处理40分钟， 所述的乳酸钙水溶液中， 溶质乳酸钙 的质量百分浓度为4， 过滤， 弃去乳酸钙溶液， 用无菌水冲洗。 0063 (7)将步骤(6)得到的微胶囊放入无菌乳酸菌增殖培养液中， 在30恒定pH6-7、 补 料连续培养， 待微胶囊内细胞密度达到1011cfu/g以上， 停止培养， 过滤， 去除培养基， 放入微 胶囊保护液中， 0-4储存。 0064 所述的MRS培养基、 乳清培养基、 乳酸菌增殖培养液、 微胶囊保护液配方同实施例 1。 0065 实施例3： 0。
31、066 一种高稳定性乳酸菌微胶囊的制备方法， 它包括如下步骤： 0067 (1)将冷冻干燥的乳酸菌接种到MRS培养基将菌种活化两次。 0068 (2)将步骤(1)活化后的菌种接种到乳清培养基或MRS培养基中， 44培养24小时。 0069 (3)将步骤(2)得到的发酵液经离心(5000rpm， 10min)弃去除上清液， 剩余的菌体 悬浮于无菌海藻糖水溶液中， 与乳酸钙、 酪蛋白酸钠和明胶的无菌混合水溶液混匀； 所述的 海藻糖水溶液中， 溶质海藻糖质量百分比浓度为0.8； 菌体与无菌海藻糖水溶液的质量比 为38； 所述的乳酸钙、 酪蛋白酸钠和明胶的无菌混合水溶液中， 溶质乳酸钙的质量百分浓 度。
32、为5、 溶质酪蛋白酸钠的质量百分浓度为6.5、 溶质明胶的质量百分浓度为1.5； 含 乳酸菌的海藻糖水溶液与乳酸钙、 酪蛋白酸钠和明胶的无菌混合水溶液的质量比为1.5： 8。 0070 (4)将步骤(3)得到的混匀溶液通过微囊化细胞无菌制备装置(参考中国专利 ZL200820035824.2)， 喷入无菌的海藻酸钠水溶液中， 制备得到微胶囊； 所述的海藻酸钠水 溶液中， 溶质海藻酸钠的质量百分浓度为1.0， 且还含质量百份浓度为0.15的吐温80； 所述海藻酸钠水溶液的用量为步骤(3)得到的混匀溶液质量的8倍。 0071 (5)步骤(4)得到的微胶囊用无菌水冲洗后， 放入谷氨酰胺转胺酶(TGa。
33、se)溶液， 谷 说明书 5/6 页 8 CN 104313005 B 8 氨酰胺转胺酶的加入量20U/100g微胶囊， 在40条件下反应6小时。 0072 (6)将步骤(5)得到的反应液过滤， 弃去谷氨酰胺转胺酶溶液， 剩余微胶囊用无菌 水冲洗后， 将微胶囊放入乳酸钙水溶液中处理60分钟， 所述的乳酸钙水溶液中， 溶质乳酸钙 的质量百分浓度为4， 过滤， 弃去乳酸钙溶液， 用无菌水冲洗。 0073 (7)将步骤(6)得到的微胶囊放入无菌乳酸菌增殖培养液中， 在37恒定pH6-7、 补 料连续培养， 待微胶囊内细胞密度达到1011cfu/g以上， 停止培养， 过滤， 去除培养基， 放入微 胶囊。
34、保护液中， 0-4储存。 0074 所述的MRS培养基、 乳清培养基、 乳酸菌增殖培养液、 微胶囊保护液配方同实施例 1。 0075 实施例4： 发酵豆乳生产。 0076 按实施例1的方法制得的嗜热链球菌(S.thermophilus)、 德氏保加利亚乳杆菌 (L.dellrueckii subsp.bulgraricus)、 嗜酸乳杆菌(:Lactobacillus acidophilus)、 植物 乳杆菌(L.plantarum)、 发酵乳杆菌(L.fermentum)、 乳酪短杆菌(Brevibacteriumcasei)单 种或混合的微胶囊发酵剂装入经杀菌的生物反应器， 将该生物反应器。
35、的进料口与巴氏杀菌 器(带冷却)的出口相连接， 反应器出口与发酵罐相连， 连续泵入巴氏杀菌豆奶， 同时从生物 反应器中流出含菌豆奶， 控制含菌奶中菌密度在106-107cfu/ml。 含菌豆奶流入下一级发酵 罐， 在30-37恒温发酵， 可生产各种发酵豆奶。 一次投入的发酵剂可连续使用50-55天， 成 本比直透式发酵剂降低60-70， 同时避免了使用继代式发酵剂质量不稳定的缺陷。 0077 实施例5： 发酵乳制品生产。 0078 按实施例1的方法制得的制得的嗜热链球菌(S.thermophilus)、 德氏保加利亚乳 杆菌(L .dellrueckii subsp .bulgraricus)。
36、、 干酪乳杆菌(L .casei)、 长双歧杆菌 (B.longum)、 发酵乳杆菌(L.fermentum)单种或混合的微胶囊发酵剂装入经杀菌的生物反 应器， 将该生物反应器的进料口与巴氏杀菌器(带冷却)的出口相连接， 反应器出口与发酵 罐相连， 连续泵入巴氏杀菌奶,同时从生物反应器中流出含菌奶， 控制含菌奶中菌密度在 106-107cfu/ml。 含菌奶流入下一级发酵罐， 在37-42恒温发酵， 生产的酸奶， 理化及感观指 标都较为良好， 符合国家标准GB27461999。 一次投入的发酵剂可连续使用50-55天， 成本 比直透式发酵剂降低60-70， 同时避免了使用继代式发酵剂质量不稳定。
37、的缺陷。 0079 实施例6： 发酵果蔬汁生产。 0080 按实施例1的方法 制得的 将植物乳杆菌 (L .plantarum) 、 营养乳杆菌 (L.alimentarius)、 乳酸乳球菌(L.lactis)、 罗旺醋杆菌(Acetobacterlovaniensis)、 汉氏 醋杆菌(Gluconacetobacterhansenii)制备成单种或混合的微胶囊发酵剂， 装入经杀菌的 生物反应器， 将该生物反应器的进料口与巴氏杀菌器(带冷却)的出口相连接， 反应器出口 与发酵罐相连， 连续泵入巴氏杀菌果蔬汁,同时从生物反应器中流出含菌果蔬汁， 控制含菌 果蔬汁中菌密度在105-106cfu/ml。 含菌果蔬汁流入下一级发酵罐， 25-35恒温发酵， 生产 各种发酵果蔬汁饮料。 一次投入的发酵剂可连续使用50-55天， 成本比直透式发酵剂降低 60-70， 同时避免了使用继代式发酵剂质量不稳定的缺陷。 说明书 6/6 页 9 CN 104313005 B 9 图1 说明书附图 1/1 页 10 CN 104313005 B 10 。