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1、(10)申请公布号 CN 102229681 A (43)申请公布日 2011.11.02 CN 102229681 A *CN102229681A* (21)申请号 201110169071.0 (22)申请日 2011.06.22 C08B 37/10(2006.01) C12S 3/02(2006.01) (71)申请人 郓城绅联生物科技有限公司 地址 274700 山东省菏泽市郓城县工业园区 (72)发明人 谢成君 甄爱华 刘建洋 (74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所 37218 代理人 张贵宾 (54) 发明名称 一种利用猪小肠生产肝素钠的制备方法 (57) 摘要 本发明公开。
2、了一种从猪小肠粘膜中分离出生 化药物的制备方法， 特别公开了一种利用猪小肠 生产肝素钠的制备方法。该利用猪小肠生产肝素 钠的制备方法， 其特征是 ： 包括如下步骤 ： 肠粘膜 的制备、 酶解、 吸附、 洗脱、 沉淀脱盐和脱水干燥即 得肝素钠。因此， 本发明的有益效果是 ： 收率高， 肝素钠活性损失小， 质量稳定， 废液排放无污染且 能循环使用， 采用车间废气净化处理装置， 解决了 肝素钠车间气味恶臭的问题 ； 利用旧工艺生产 1 亿个单位的肝素钠， 需要 2000 2400 根猪小肠， 而利用本发明的制备方法生产 1 亿个单位的肝素 钠， 只需要 1400 1600 根猪小肠， 且肝素钠效价 。
3、和活性都有大幅度提高， 从而使生产成本大大降 低， 利润可提高 40以上。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 CN 102229682 A1/1 页 2 1. 一种利用猪小肠生产肝素钠的制备方法， 其特征是 ： 包括如下步骤 ： （1） 肠粘膜的制备 ： 在猪小肠内灌入清水， 用肠衣机挤压出小肠粘膜至粘膜池 ； （2）酶解 ： 用粘膜泵将粘膜从粘膜池打入酶解罐中， 往酶解罐中加水， 粘膜与水的 重量比为 1 ： 7-9， 搅拌均匀后加入 2709 碱性蛋白酶调节 PH 值为 8-9， 加热使温度达到 55 -。
4、60， 再加入重量百分比为 3%-5% 的肠衣专用盐， 测其盐度达到 2%-2.5%， 保温 2-3 小 时， 继续加热使温度达到 80 -85， 保温 30-40 分钟后， 用 80 目尼龙布过滤， 收集过滤液 ； （3） 吸附 ： 将上述过滤液打入吸附罐中， 搅拌， 待温度降到 58 -60时加入树脂， 搅拌 8-10 小时， 继续冷却到 40 -45， 放出废液， 收集过滤树脂 ； （4） 洗脱 ： （4-1） ： 将收集的树脂反复冲洗后倒入洗脱器中， 加入质量分数为5%-7%的盐水， 温度保 持在 50 -55， 搅拌 30-40 分钟 ； （4-2） ： 随后将废液倒掉， 加入质量分。
5、数为 20%-24% 的盐水， 温度保持在 50 -55， 搅 拌 3-4 小时后， 收集洗脱液 ； （4-3） ： 重复 （4-2） 的步骤， 将两次收集的洗脱液合并待用 ； （5） 沉淀脱盐 ： 将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中， 边搅拌边加入质量分数为 80%-85% 的乙醇， 调 PH 值 至 7-8， 搅匀密封沉淀 23-25 小时， 虹吸上层清液用于回收乙醇， 收集沉淀物待用 ； （6） 脱水干燥 ： 将上述沉淀物滤干脱水， 放入烘箱干燥后即得肝素钠。 2.根据权利要求1所述的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法， 其特征是 ： 步骤 （2） 酶解 中粘膜与 2709 碱性蛋白酶的重量比为 。
6、500 ： 1。 3.根据权利要求1所述的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法， 其特征是 ： 步骤 （3） 吸附 中树脂的添加量按每根猪小肠加入 20-30 克树脂的比例添加。 4.根据权利要求1所述的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法， 其特征是 ： 步骤 （4-1） 中 树脂与加入的质量分数为 5%-7% 盐水的重量比为 1 1.1-1.3， 步骤 （4-2） 中树脂与加入的 质量分数为 20%-24% 盐水的重量比为 1 1.1-1.3。 5.根据权利要求1所述的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法， 其特征是 ： 步骤 （4-3） 收 集完洗脱液后， 再接着加入质量分数为20%-24%的盐水， 温度。
7、保持在50-55， 搅拌30-40 分钟后， 收集洗脱液做高浓度盐水循环使用。 6.根据权利要求1所述的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法， 其特征是 ： 步骤 （5） 沉淀 脱盐中搅拌加入预冷过的乙醇。 7.根据权利要求1所述的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法， 其特征是 ： 步骤 （5） 沉淀 脱盐中洗脱液与乙醇的体积比为 1 ： 1.8-2.2。 8.根据权利要求1所述的利用猪小肠生产肝素钠的制备方法， 其特征是 ： 步骤 （6） 脱水 干燥中烘箱的温度为 80 -90， 干燥时间为 6-8 小时。 权 利 要 求 书 CN 102229681 A CN 102229682 A1/5 页 3 。
8、一种利用猪小肠生产肝素钠的制备方法 0001 （一） 技术领域 本发明涉及一种从猪小肠粘膜中分离出生化药物的制备方法， 特别涉及一种利用 猪小肠生产肝素钠的制备方法。 0002 （二） 背景技术 肝素是一种广泛存在于哺乳动物组织中的黏多糖， 主要存在与肥大细胞中， 具有抗凝 血作用， 被广泛用于手术和脑血栓、 心肌梗死等的治疗。肝素的分子量大约 300037500， 对商品肝素的研究提示至少有 21 种分子个体。肝素钠是肝素的钠盐。肝素钠作为天然抗 凝血物质受到世界各国的重视也是我国主要的出口药物之一随着研究的深入， 人们发 现肝素钠不但有抗凝、 抗血栓形成和调节血脂的作用， 还具有抗炎、 抗。
9、过敏、 抗病毒、 抗癌等 功能。目前， 肝素钠主要是从猪、 羊小肠黏膜和牛肺、 腌肠衣盐水等中提取。研究显示肝素 钠在是猪小肠粘膜中含量最高。肝素钠粗品是我国的传统出口产品， 在国际上占有重要的 地位。但是传统生产工艺落后， 肝素钠产率低， 肝素钠产品质量不稳定， 生产过程中资源浪 费严重， 污染环境严重。 0003 （三） 发明内容 本发明为了弥补现有技术的不足， 提供了一种收率高、 肝素钠活性损失小的利用猪小 肠生产肝素钠的制备方法。 0004 本发明是通过如下技术方案实现的 ： 一种利用猪小肠生产肝素钠的制备方法， 其特征是 ： 包括如下步骤 ： （1） 肠粘膜的制备 ： 在猪小肠内灌入。
10、清水， 用肠衣机挤压出小肠粘膜至粘膜池 ； （2）酶解 ： 用粘膜泵将粘膜从粘膜池打入酶解罐中， 往酶解罐中加水， 粘膜与水的 重量比为 1 ： 7-9， 搅拌均匀后加入 2709 碱性蛋白酶调节 PH 值为 8-9， 加热使温度达到 55 -60， 再加入重量百分比为 3%-5% 的肠衣专用盐， 测其盐度达到 2%-2.5%， 保温 2-3 小 时， 继续加热使温度达到 80 -85， 保温 30-40 分钟后， 用 80 目尼龙布过滤， 收集过滤液 ； （3） 吸附 ： 将上述过滤液打入吸附罐中， 搅拌， 待温度降到 58 -60时加入树脂， 搅拌 8-10 小时， 继续冷却到 40 -4。
11、5， 放出废液， 收集过滤树脂 ； （4） 洗脱 ： （4-1） ： 将收集的树脂反复冲洗后倒入洗脱器中， 加入质量分数为5%-7%的盐水， 温度保 持在 50 -55， 搅拌 30-40 分钟 ； （4-2） ： 随后将废液倒掉， 加入质量分数为 20%-24% 的盐水， 温度保持在 50 -55， 搅 拌 3-4 小时后， 收集洗脱液 ； （4-3） ： 重复 （4-2） 的步骤， 将两次收集的洗脱液合并待用 ； （5） 沉淀脱盐 ： 将上述洗脱液过滤移入沉淀罐中， 边搅拌边加入质量分数为 80%-85% 的乙醇， 调 PH 值 至 7-8， 搅匀密封沉淀 23-25 小时， 虹吸上层清液。
12、用于回收乙醇， 收集沉淀物待用 ； （6） 脱水干燥 ： 将上述沉淀物滤干脱水， 放入烘箱干燥后即得肝素钠。 0005 步骤 （2） 酶解中粘膜与 2709 碱性蛋白酶的重量比为 500 ： 1。 说 明 书 CN 102229681 A CN 102229682 A2/5 页 4 0006 步骤 （3） 吸附中树脂的添加量按每根猪小肠加入 20-30 克树脂的比例添加。 0007 步骤 （4-1） 中树脂与加入的质量分数为 5%-7% 盐水的重量比为 1 1.1-1.3， 步骤 （4-2） 中树脂与加入的质量分数为 20%-24% 盐水的重量比为 1 1.1-1.3。 0008 步骤 （4-。
13、3） 收集完洗脱液后， 再接着加入质量分数为 20%-24% 的盐水， 温度保持在 50 -55， 搅拌 30-40 分钟后， 收集洗脱液做高浓度盐水循环使用。 0009 步骤 （5） 沉淀脱盐中搅拌加入预冷过的乙醇。 0010 步骤 （5） 沉淀脱盐中洗脱液与乙醇的体积比为 1 ： 1.8-2.2。 0011 步骤 （6） 脱水干燥中烘箱的温度为 80 -90， 干燥时间为 6-8 小时。 0012 上述步骤 （3） 吸附中， 所加树脂为德国拜耳树脂 ； 步骤 （4） 洗脱中， 盐水是指用肠 衣专用盐所配制的水溶液。 0013 为了使粘膜刮制容易， 常习惯将小肠浸泡24-48小时,这样能保护。
14、肠衣免受破损， 但长时间浸泡会发酵产生肝素酶， 分解肝素钠， 此外发酵还会产生一些有害物质， 使树脂中 毒， 因此在浸泡时间上一定要准确把握， 夏季适当缩短时间， 冬季可适当延长时间， 在弱碱 性或质量分数为 4的盐水条件下， 能减缓微生物的发酵和抑制肝素酶活性， 可以放于低温 处作短期贮存。 0014 乙醇沉淀时， 必须在搅拌的同时逐渐加入乙醇， 以避免局部乙醇浓度突然增高， 而 且乙醇要用预冷过的， 否则就会使肝素钠的部分空间构象受到破坏， 从而降低其活性。 0015 酶解、 吸附肝素钠过程中的废液 ( 煮锅废水 )， 气味恶臭， 致使生产车间空气环境 及其混乱， 使人难以忍受， 甚至影响。
15、工作人员的身心健康。 为此本发明采用车间废气净化处 理装置， 大大减少了空气中的恶臭气味， 极大改善了工作环境。 0016 因此， 本发明的有益效果是 ： 收率高， 肝素钠活性损失小， 质量稳定， 废液排放无污 染且能循环使用， 采用车间废气净化处理装置， 解决了肝素钠车间气味恶臭的问题 ； 利用旧 工艺生产 1 亿个单位的肝素钠， 需要 2000 2400 根猪小肠， 而利用本发明的制备方法生产 1亿个单位的肝素钠， 只需要14001600根猪小肠， 且肝素钠效价和活性都有大幅度提高， 从而使生产成本大大降低， 利润可提高 40以上。 0017 （四） 具体实施方式 实施例 1 ： 利用猪小。
16、肠生产肝素钠的制备方法， 采用如下步骤 ： （1） 肠粘膜的制备 ： 取 400 根猪小肠灌水洗涤， 除去残留粪便， 清洗干净 ； 将肠内灌入清水， 用肠衣机挤压 出小肠粘膜， 操作用力均匀， 粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池 ； 刮制过程中的肠头、 碎肠皮绞 碎后再投入粘膜池， 共收集粘膜 420 千克 ； （2） 酶解 ： 打开粘膜泵， 将 420 千克粘膜从粘膜池打入酶解罐中， 将 3360 千克水加入酶解罐中， 打开搅拌机进行搅拌， 转速为 50r/min， 搅拌均匀， 再加入 840 克 2709 碱性蛋白酶添加到酶 解罐中， 调节 PH 值为 8.0 ； 打开蒸汽阀门使温度达到 55， 。
17、加入 150 千克肠衣专用盐， 用盐 度计测其盐度达到 2.5%， 保温 2 小时 ； 恒温结束后， 再打开蒸汽阀门继续加温， 使温度达到 80， 停止加温， 保温 30 分钟 ； 保温后， 即刻用 80 目尼龙布过滤， 收集过滤液用于吸附 ； （3） 吸附 ： 说 明 书 CN 102229681 A CN 102229682 A3/5 页 5 将酶解过滤液打入吸附罐中， 打开搅拌机， 转速为 50r/min， 使罐中的温度自然降到 58， 保持溶液的 PH 值为 8.0， 盐度 2.5% ； 将 10 千克树脂加入吸附罐中， 搅拌 8 小时 ； 自然 冷却温度到 45， 放出废液， 用 8。
18、0 目尼龙丝袋收集过滤树脂 ； （4） 洗脱 ： （4-1） ： 将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗 ； 将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中， 加入 质量分数为 5% 的盐水， 加入盐水的量刚好没过树脂， 温度保持在 50， 开启搅拌机转速为 30r/min， 搅拌 30 分钟 ； （4-2） ： 随后将废液倒掉， 加入质量分数为 22% 的盐水， 加入盐水的量刚好没过树脂， 温 度保持在 50， 开启搅拌机转速 30r/min， 搅拌 3 小时后， 收集洗脱液 ； （4-3） ： 重复 （4-2） 的步骤一次， 将两次收集的洗脱液合并待用 ； （步骤 （4-3） 收集完洗脱液后， 再接着加入质量分数为。
19、 22% 的盐水， 温度保持在 50， 开 启搅拌机转速 30r/min， 搅拌 30 分钟后， 收集洗脱液做高浓度盐水循环使用 ； ） （5） 沉淀脱盐 ： 将洗脱液过滤移入沉淀罐中， 边搅拌边加入质量分数为 80% 的预冷过的乙醇， 加入乙 醇的体积量为洗脱液的两倍， 使乙醇浓度降到 40， 调 PH 值至 7.0， 搅匀密封沉淀 24 小时 ； 虹吸上层清液用于回收乙醇， 收集沉淀物待用 ； （6） 脱水干燥 ： 将收集的沉淀物滤干脱水 ； 将脱水后的沉淀物移入烘箱在 80下用蒸汽干燥 6 小时， 烘干即得肝素钠。 0018 实施例 2 ： 利用猪小肠生产肝素钠的制备方法， 采用如下步骤。
20、 ： （1） 肠粘膜的制备 ： 取 300 根猪小肠灌水洗涤， 除去残留粪便， 清洗干净 ； 将肠内灌入清水， 用肠衣机挤压 出小肠粘膜， 操作用力均匀， 粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池 ； 刮制过程中的肠头、 碎肠皮绞 碎后再投入粘膜池， 共收集粘膜 310 千克 ； （2） 酶解 ： 打开粘膜泵， 将310千克粘膜从粘膜池打入酶解罐中， 将2790千克水加入酶解罐中， 打 开搅拌机进行搅拌， 转速为 55r/min， 搅拌均匀， 再加入 620 克 2709 碱性蛋白酶添加到酶解 罐中， 调节 PH 值为 8.0 ； 打开蒸汽阀门使温度达到 58， 加入 93 千克肠衣专用盐， 用盐度 计测其。
21、盐度达到 2.5%， 保温 2.5 小时 ； 恒温结束后， 再打开蒸汽阀门继续加温， 使温度达到 82， 停止加温， 保温 35 分钟 ； 保温后， 即刻用 80 目尼龙布过滤， 收集过滤液用于吸附 ； （3） 吸附 ： 将酶解过滤液打入吸附罐中， 打开搅拌机， 转速为 55r/min， 使罐中的温度自然降到 59， 保持溶液的PH值为7.5， 盐度2.5% ； 将9千克树脂加入吸附罐中， 搅拌9小时 ； 自然冷 却温度到 42， 放出废液， 用 80 目尼龙丝袋收集过滤树脂 ； （4） 洗脱 ： （4-1） ： 将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗 ； 将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中， 加入 质量分。
22、数为 6% 的盐水， 加入盐水的量刚好没过树脂， 温度保持在 52， 开启搅拌机转速为 35r/min， 搅拌 35 分钟 ； 说 明 书 CN 102229681 A CN 102229682 A4/5 页 6 （4-2） ： 随后将废液倒掉， 加入质量分数为 20% 的盐水， 加入盐水的量刚好没过树脂， 温 度保持在 52， 开启搅拌机转速 35r/min， 搅拌 3.5 小时后， 收集洗脱液 ； （4-3） ： 重复 （4-2） 的步骤一次， 将两次收集的洗脱液合并待用 ； （步骤 （4-3） 收集完洗脱液后， 再接着加入质量分数为 20% 的盐水， 温度保持在 52， 开 启搅拌机转速。
23、 35r/min， 搅拌 35 分钟后， 收集洗脱液做高浓度盐水循环使用 ； ） （5） 沉淀脱盐 ： 将洗脱液过滤移入沉淀罐中， 边搅拌边加入质量分数为 82% 的预冷过的乙醇， 加入乙 醇的体积量为洗脱液的两倍， 使乙醇浓度降到 42， 调 PH 值至 7.5， 搅匀密封沉淀 23 小时 ； 虹吸上层清液用于回收乙醇， 收集沉淀物待用 ； （6） 脱水干燥 ： 将收集的沉淀物滤干脱水 ； 将脱水后的沉淀物移入烘箱在 85下用蒸汽干燥 7 小时， 烘干即得肝素钠。 0019 实施例 3 ： 利用猪小肠生产肝素钠的制备方法， 采用如下步骤 ： （1） 肠粘膜的制备 ： 取 500 根猪小肠灌水。
24、洗涤， 除去残留粪便， 清洗干净 ； 将肠内灌入清水， 用肠衣机挤压 出小肠粘膜， 操作用力均匀， 粘膜沿着粘膜管道进入粘膜池 ； 刮制过程中的肠头、 碎肠皮绞 碎后再投入粘膜池， 共收集粘膜 520 千克 ； （2） 酶解 ： 打开粘膜泵， 将520千克粘膜从粘膜池打入酶解罐中， 将3640千克水加入酶解罐中， 打 开搅拌机进行搅拌， 转速为 60r/min， 搅拌均匀， 再加入 1040 克 2709 碱性蛋白酶添加到酶 解罐中， 调节 PH 值为 9.0 ； 打开蒸汽阀门使温度达到 60， 加入 208 千克肠衣专用盐， 用盐 度计测其盐度达到 2.5%， 保温 3 小时 ； 恒温结束后。
25、， 再打开蒸汽阀门继续加温， 使温度达到 85， 停止加温， 保温 40 分钟 ； 保温后， 即刻用 80 目尼龙布过滤， 收集过滤液用于吸附 ； （3） 吸附 ： 将酶解过滤液打入吸附罐中， 打开搅拌机， 转速为 60r/min， 使罐中的温度自然降到 60， 保持溶液的PH值为8.0， 盐度2.5% ； 将10千克树脂加入吸附罐中， 搅拌10小时 ； 自然 冷却温度到 45， 放出废液， 用 80 目尼龙丝袋收集过滤树脂 ； （4） 洗脱 ： （4-1） ： 将放入尼龙丝袋中的树脂反复冲洗 ； 将冲洗干净的树脂倒入洗脱器中， 加入 质量分数为 7% 的盐水， 加入盐水的量刚好没过树脂， 温。
26、度保持在 55， 开启搅拌机转速为 40r/min， 搅拌 40 分钟 ； （4-2） ： 随后将废液倒掉， 加入质量分数为 24% 的盐水， 加入盐水的量刚好没过树脂， 温 度保持在 55， 开启搅拌机转速 40r/min， 搅拌 4 小时后， 收集洗脱液 ； （4-3） ： 重复 （4-2） 的步骤一次， 将两次收集的洗脱液合并待用 ； （步骤 （4-3） 收集完洗脱液后， 再接着加入质量分数为 24% 的盐水， 温度保持在 55， 开 启搅拌机转速 40r/min， 搅拌 40 分钟后， 收集洗脱液做高浓度盐水循环使用 ； ） （5） 沉淀脱盐 ： 将洗脱液过滤移入沉淀罐中， 边搅拌边加入质量分数为 85% 的预冷过的乙醇， 加入乙 说 明 书 CN 102229681 A CN 102229682 A5/5 页 7 醇的体积量为洗脱液的两倍， 使乙醇浓度降到 45， 调 PH 值至 8.0， 搅匀密封沉淀 25 小时 ； 虹吸上层清液用于回收乙醇， 收集沉淀物待用 ； （6） 脱水干燥 ： 将收集的沉淀物滤干脱水 ； 将脱水后的沉淀物移入烘箱在 90下用蒸汽干燥 6 小时， 烘干即得肝素钠。 0020 上述步骤 （3） 吸附中， 所加树脂为德国拜耳树脂 ； 步骤 （4） 洗脱中， 盐水是指用肠 衣专用盐所配制的水溶液。 说 明 书 CN 102229681 A 。