与相关申请的交叉参照
本申请要求于2008年1月8日提交的美国临时专利申请号61/019,805的利益，所述美国临时专利申请号的内容为了所有目的通过引用整体合并入本文。
发明领域
本发明涉及通过糖基化的多肽修饰领域。特别地，本发明涉及使用短的酶识别的N联糖基化序列制备糖基化多肽的方法。
发明背景
用于造成特定的生理学应答的糖基化和非糖基化多肽的施用是医学领域众所周知的。例如，经纯化的和重组的人生长激素(hGH)用于治疗与hGH缺陷相关的病状和疾病，例如儿童中的侏儒症。其他例子涉及具有已知的抗病毒活性的干扰素，以及刺激白血细胞产生的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
可以用于制造具有野生型糖基化模式的多肽的表达系统的缺乏已限制了此类多肽作为治疗试剂的用途。本领域已知不适当或不完全糖基化的多肽可以是免疫原性，导致肽的快速中和和/或变应性应答的发展。重组产生的糖肽的其他缺陷包括亚最佳的效力和从血流中的快速清除。
解决糖基化多肽治疗剂产生中固有的问题的一种方法已在其表达后在体外修饰多肽。多肽的表达后体外修饰已用于现有聚糖结构的修饰和糖基部分与非糖基化的氨基酸残基的附着。重组真核生物糖基转移酶的广泛选择已变得可获得的，使得具有定制设计的糖基化模式和糖基结构的哺乳动物糖缀合物的体外酶促合成成为可能。参见例如，美国专利号5,876,980；6,030,815；5,728,554；5,922,577；以及WO/9831826；US2003180835；和WO 03/031464。
此外，糖肽已用一种或多种非糖修饰基团例如水溶性聚合物进行衍生。已与肽缀合的示例性聚合物是聚(乙二醇)(“PEG”)。增加多肽的分子大小的PEG缀合已用于减少免疫原性，并且延长PEG缀合的多肽的血液清除时间。例如，给予Davis等人的美国专利号4,179,337公开了与聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)偶联的非免疫原性多肽，例如酶和多肽-激素。
用于使PEG及其衍生物与多肽附着的主要方法涉及通过氨基酸残基的非特异性键合(参见例如，美国专利号4,088,538美国专利号4,496,689、美国专利号4,414,147、美国专利号4,055,635和PCT WO87/00056)。PEG缀合的另一种方法涉及糖肽的糖基残基的非特异性氧化(参见例如，WO 94/05332)。
在这些非特异性方法中，PEG以随机、非特异性方式加入多肽主链上的反应残基中。这种方法具有明显缺点，包括最终产物的同质性的缺乏，和经修饰的多肽的生物学或酶促活性减少的可能性。因此，高度需要用于治疗多肽的衍生方法，所述方法导致特异性标记的、可容易表征和基本上同质的产物的形成。
特异性修饰的、同质的多肽治疗剂可以通过使用酶在体外产生。与用于使修饰基团例如合成聚合物与多肽附着的非特异性方法不同，基于酶的合成具有区域选择性和立体选择性的优点。用于在经标记的多肽的合成中使用的2个主要类别的酶是糖基转移酶(例如，唾液酸转移酶、寡糖基转移酶、N-乙酰葡糖氨基转移酶)和糖苷酶。这些酶可以用于糖的特异性附着，所述糖随后可以经改变以包括修饰基团。备选地，糖基转移酶和经修饰的糖苷酶可以用于将经修饰的糖直接转移给多肽主链(参见例如，美国专利6,399,336以及美国专利申请公开20030040037、20040132640、20040137557、20040126838和20040142856，其各自通过引用合并入本文)。使化学和酶促方法相组合的方法也是已知的(参见例如，Yamamoto等人，Carbohydr.Res.305：415-422(1998)和美国专利申请公开20040137557，其通过引用合并入本文)。
碳水化合物以几种方法与糖肽附着，其中N联至天冬酰胺和O联至丝氨酸和苏氨酸是对于重组糖蛋白治疗剂最相关的。
并非所有多肽都包括糖基化序列作为其氨基酸序列的部分。此外，现有的糖基化序列可能不适合于附着修饰基团。此类修饰可以例如引起经修饰的多肽的生物活性中不希望有的降低。因此，本领域需要精确和可重现的糖基化和糖修饰方法。本发明解决了这些和其他需要。
发明概述
本发明包括酶促糖缀合或糖基PEG化反应可以特异性靶向多肽内的特定N联糖基化序列的发现。在一个例子中，通过突变将所靶向的糖基化序列引入亲本多肽(例如野生型多肽)内，产生包括N联糖基化序列的突变体多肽，其中N联糖基化序列不存在于相对应的亲本多肽(外源N联糖基化序列)中，或不存在于相同位置处。此类突变体多肽命名为“序列子(sequon)多肽”。
在一个方面，本发明提供了包括至少一个外源N联糖基化序列的多肽和制备此类多肽的方法。本发明还提供了序列子多肽的文库。在一个代表性实施方案中，文库包括多个不同成员，其中文库的每个成员与共同的亲本多肽相对应，并且其中文库的每个成员包括本发明的外源N联糖基化序列。还提供的是制备且使用此类文库的方法。
在一个实施方案中，每个N联糖基化序列是酶的底物，所述酶例如寡糖基转移酶，例如本文描述的那些(例如，PglB或Stt3)，所述酶可以将经修饰的或未经修饰的糖基部分从糖基供体种类转移到N联糖基化序列的天冬酰胺残基上。因此，在另一个方面，本发明提供了在糖基化多肽和修饰基团(例如，聚合修饰基团)之间的共价缀合物，其中多肽包括外源N联糖基化序列。聚合修饰基团经由糖基连接基团在N联糖基化序列内的天冬酰胺残基处与多肽缀合，所述糖基连接基团插入多肽和聚合修饰基团之间，并且与多肽和聚合修饰基团共价连接，其中糖基连接基团是选自单糖和寡糖的成员。本发明进一步提供了包括本发明的多肽缀合物的药物组合物。
在本发明的多肽中使用的示例性N联糖基化序列选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2：
X1NX2X3X4(SEQ ID NO：1)；和
X1DX2′NX2X3X4(SEQ ID NO：2)，
其中N是天冬酰胺；D是天冬氨酸；X3是选自苏氨酸(T)和丝氨酸(S)的成员；X1存在或不存在，并且当存在时是氨基酸；X4存在或不存在，并且当存在时是氨基酸；并且X2和X2′是独立地选择的氨基酸。在一个实施方案中，X2和X2′不是脯氨酸(P)。
本发明进一步提供了制备且使用多肽缀合物的方法。在一个例子中，使用无细胞的体外方法形成在多肽和修饰基团(例如，聚合修饰基团)之间的多肽缀合物。多肽包括包含天冬酰胺残基的本发明的N联糖基化序列。修饰基团经由糖基连接基团在天冬酰胺残基处与多肽共价连接，所述糖基连接基团插入多肽和修饰基团之间，并且与多肽和修饰基团共价连接。该方法包括在寡糖基转移酶的存在下，在足以使寡糖基转移酶将糖基部分从糖基供体种类转移到N联糖基化序列的天冬酰胺残基上的条件下，使本发明的多肽和糖基供体种类相接触。
形成多肽和修饰基团(例如，聚合修饰基团)之间的共价缀合物的另一个示例性方法涉及多肽在其中表达的宿主细胞内的细胞内糖基化。该方法利用内源和/或共表达的寡糖基转移酶。该方法包括在细胞内酶(例如，寡糖基转移酶)的存在下，在足以使酶将糖基部分从糖基供体种类转移到N联糖基化序列的天冬酰胺残基上的条件下，使包括N联糖基化序列的多肽(例如，本发明的多肽)和糖基供体种类相接触。在一个例子中，将糖基供体种类加入细胞培养基中，被宿主细胞内在化，并且用作通过细胞内(内源或共表达)寡糖基转移酶的底物。
在另一个方面，本发明提供了在本发明的方法中使用的糖基供体种类。示例性糖基供体种类具有根据式(X)的结构：
其中w是选自1至20的整数。在一个例子中，w选自1-8。整数p选自0和1。F是脂质部分；Z＊是选自单糖和寡糖的糖基部分；每个La是独立地选自单键、官能团、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、和取代或未取代的杂环烷基的连接体部分；每个R6c是独立地选择的修饰基团，例如本文描述的线性或分支聚合修饰基团(例如，PEG)；A1是选自P(磷)和C(碳)的成员；Y3是选自氧(O)和硫(S)的成员；Y4是选自O、S、SR1、OR1、OQ、CR1R2和NR3R4的成员；E2、E3和E4是独立地选自CR1R2、O、S和NR3的成员；并且每个W是独立地选自SR1、OR1、OQ、NR3R4、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、和取代或未取代的杂环烷基的成员，其中每个Q是独立地选自H、单个负电荷和阳离子(例如，Na+或K+)的成员。每个R1、每个R2、每个R3和每个R4是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、和取代或未取代的杂环烷基的成员。
本发明的另外方面、优点和目的由于下述详述将是显而易见的。
附图简述
图1A和图1B(分别为SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9)各自显示因子VIII的示例性氨基酸序列。
图2是示例性因子VIII氨基酸序列，其中B结构域(氨基酸残基741-1648)被去除(SEQ ID NO：3)。本发明的示例性多肽包括其中缺失的B结构域用至少一个氨基酸残基替换的那些(B结构域替换序列)。在一个实施方案中，在Arg740和Glu1649之间的B结构域替换序列包括至少一个O联或N联糖基化序列。
图3是B结构域缺失的因子VIII的示例性氨基酸序列(SEQ IDNO：4)。
图4是B结构域缺失的因子VIII的示例性氨基酸序列(SEQ IDNO：5)。
图5B结构域缺失的因子VIII的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。
图6是描述本发明的示例性实施方案的表，其中本发明的特定多肽与本发明的特定N联糖基化序列结合使用。图6中的每行代表本发明的一个示例性实施方案，其中在多肽的氨基酸序列内的所示位置处将N联糖基化序列引入多肽内。
发明详述
I.缩写
PEG，聚(乙二醇)；m-PEG，甲氧基-聚(乙二醇)；PPG，聚(丙二醇)；m-PPG，甲氧基-聚(丙二醇)；Fuc，岩藻糖或岩藻糖基；Gal，半乳糖或半乳糖基；GalNAc，N-乙酰半乳糖胺或N-乙酰半乳糖胺基；Glc，葡萄糖或葡萄糖基；GlcNAc，N-乙酰葡糖胺或N-乙酰葡糖胺基；Man，甘露糖或甘露糖基；ManAc，乙酸甘露糖胺或乙酸甘露糖胺基；Sia，唾液酸或唾液酸基；和NeuAc，N-乙酰神经酰胺或N-乙酰神经酰胺基。
II.定义
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语一般具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。一般地，本文使用的命名法以及细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学和杂交中的实验室操作是本领域众所周知且通常采用的那些。标准技术用于核酸和肽合成。技术和操作一般根据本领域的常规方法和各种一般参考文献来执行(一般参见，Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，其通过引用合并入本文)，所述参考文献在本文件自始至终提供。本文使用的命名法以及下文描述的分析化学和有机合成化学的实验室操作是本领域众所周知且通常采用的那些。标准技术或其修饰用于化学合成和化学分析。
本文描述的所有寡糖用关于非还原糖的名称或缩写(即，Gal)进行描述，随后为糖苷键的构型(α或β)、环键(1或2)、键中涉及的还原糖的环位置(2、3、4、6或8)，并且随后为还原糖的名称或缩写(即，GlcNAc)。每种糖优选是吡喃糖。关于标准糖生物学命名法的综述，参见例如，Essentials of Glycobiology Varki等人编辑CSHL Press(1999)。寡糖可以包括糖基模拟部分作为糖组分之一。寡糖被视为具有还原末端和非还原末端，糖是否在还原末端处事实上是还原糖。
术语“糖基部分”意指衍生自糖残基的任何原子团。“糖基部分”包括单和寡糖并且包括“糖基模拟部分”。
如本文所使用的，术语“糖基模拟部分”指在结构上与糖基部分(例如己糖或戊糖)类似的部分。“糖基模拟部分”的例子包括这样的部分，其中糖基部分的糖苷氧或环氧或两者已用键或另一个原子(例如，硫)或另一个部分(例如碳(例如，CH2)或含氮基团(例如，NH))替换。例子包括取代或未取代的环己基衍生物、环硫醚、环仲胺、包括硫代糖苷键的部分等。在一个例子中，“糖基模拟部分”在酶促催化的反应中转移到多肽的氨基酸残基或糖肽的糖基部分上。这可以例如通过用离去基团例如卤素激活“糖基模拟部分”来完成。
术语“核酸”或“多核苷酸”指以单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非明确限制，否则该术语包括包含天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述天然核苷酸的已知类似物具有与参考核酸相似的结合性质，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则特定核酸序列还暗示包括其保守修饰的变体(例如简并密码子置换)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指示的序列。特别地，简并密码子置换可以通过产生这样的序列来达到，在所述序列中一个或多个所选择的(或所有)密码子的第三个位置由混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换(Batzer等人，Nucleic AcidRes.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol. Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA和由基因编码的mRNA互换使用。
术语“基因”意指涉及产生多肽链的DNA区段。它可以包括在编码区前和后的区域(前导区和尾部)以及个别编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
术语“经分离的”当应用于核酸或蛋白质时，指核酸或蛋白质基本上不含它在自然状态下与之结合的其他细胞组分。它优选处于同质状态，尽管它可以在干燥或水溶液中。纯度和同质性一般使用分析化学技术进行测定，所述分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。其为制剂中存在的占优势种类的蛋白质或核酸是基本上纯化的。特别地，经分离的基因与开放读码框分开，所述开放读码框侧接基因并且编码除目的基因外的蛋白质。术语“经纯化的”指核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一个条带。特别地，它意指核酸或蛋白质是至少85％纯的，更优选至少95％纯的，并且最优选至少99％纯的。
术语“氨基酸”指天然存在的和合成氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及随后被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指这样的化合物，其具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，即与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲锍。此类类似物具有经修饰的R基(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”指这样的化学化合物，其具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。
术语“不带电的氨基酸”指不包括酸性(例如，-COOH)或碱性(例如，-NH2)官能团的氨基酸。碱性氨基酸包括赖氨酸(K)和精氨酸(R)。酸性氨基酸包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。“不带电的氨基酸”包括例如甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)，以及包括-OH、-SH或-SCH3基团的氨基酸(例如，苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)和甲硫氨酸(M))。
存在允许以位点特异性方式将非天然氨基酸衍生物或类似物掺入多肽链内的本领域已知的各种方法，参见例如，WO 02/086075。
氨基酸在本文中可以通过通常已知的三字母符号或通过由IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission推荐的单字母符号提及。同样地，核苷酸可以通过其通常公认的单字母编码提及。
“保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列。就特定的核酸序列而言，“保守修饰的变体”指编码等同或基本上等同的氨基酸序列的核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时，指基本上等同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上等同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全都编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中丙氨酸由密码子指定的每个位置处，密码子可以改变为所述的任何相对应密码子而不改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其为保守修饰的变体的一个种类。本文编码多肽的每一个核酸序列也描述核酸的每一个可能的沉默变异。技术人员应认识到核酸中的每个密码子(除AUG和TGG外，所述AUG通常为甲硫氨酸的唯一密码子，所述TGG通常为色氨酸的唯一密码子)可以进行修饰，以产生功能上等同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异在每个所述序列中暗示。
就氨基酸序列而言，技术人员应认识到关于核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别置换、缺失或添加(其改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸)是“保守修饰的变体”，其中改变导致氨基酸由化学上相似的氨基酸置换。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域众所周知的。此类保守修饰的变体附加于并且不排除本发明的多态变体、种间同系物和等位基因。
下述8个组各自包含彼此为保守置换的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)
(参见例如，Creighton，Proteins(1984))。
“肽”指包括通过酰胺键连接在一起的衍生自氨基酸的单体。本发明的肽在大小方面可以从例如2个氨基酸到数百或数千个氨基酸不等。较大的肽(例如至少10、至少20、至少30或至少50个氨基酸残基)备选地称为“多肽”或“蛋白质”。另外，还包括非天然氨基酸，例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸、高精氨酸和高苯丙氨酸。非基因编码的氨基酸也可以在本发明中使用。此外，已进行修饰以包括反应基团、糖基化序列、聚合物、治疗部分、生物分子等的氨基酸也可以在本发明中使用。在本发明中使用的所有氨基酸都可以是D-或L-同分异构体。L-同分异构体一般是优选的。此外，其他模拟肽在本发明中也是有用的。如本文所使用的，“肽”或“多肽”指糖基化和非糖基化的肽或“多肽”。还包括的是通过表达多肽的系统不完全糖基化的多肽。关于一般综述，参见Spatola，A.F.，in CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS，PEPTIDES AND PROTEINS，B.Weinstein，编辑，Marcel Dekker，NewYork，第267页(1983)。术语“多肽”还包括那种多肽的所有可能形式，例如突变形式(一个或多个突变)、截短形式、延长形式、包括多肽的融合蛋白、加标记的多肽、变体，其中特定结构域被去除或部分去除。术语“多肽”包括那种多肽的单体、寡聚物和聚合物。例如，术语“血管性血友病因子(von Willebrand Factor)”(vWF)包括vWF的单体、二聚和寡聚形式。
在本申请中，氨基酸残基根据其距离多肽的N末端氨基酸(例如，N末端甲硫氨酸)的相对位置进行编号(一般为上标)，所述N末端氨基酸编号为“1”。N末端氨基酸可以是甲硫氨酸(M)，编号为“1”。如果多肽的N末端不由甲硫氨酸开始，那么与每个氨基酸残基相关的编号可以容易地进行调整，以反映N末端甲硫氨酸的不存在。应当理解示例性多肽的N末端可以由或不由甲硫氨酸开始。
术语“亲本多肽”指这样的任何多肽，其具有不包括本发明的“外源”N联糖基化序列的氨基酸序列。然而，“亲本多肽”可以包括一个或多个天然存在的(内源)N联糖基化序列。例如，野生型多肽可以包括N联糖基化序列“NLT”。术语“亲本多肽”指任何多肽，包括野生型多肽、融合多肽、合成多肽、重组多肽(例如，治疗多肽)以及其任何变体(例如，先前通过氨基酸的一个或多个替换、氨基酸插入、氨基酸缺失等进行修饰的)，只要此类修饰不等于形成本发明的N联糖基化序列。在一个实施方案中，亲本多肽的氨基酸序列、或编码亲本多肽的核酸序列是限定的且是以任何方式可公开获得的。例如，亲本多肽是野生型多肽，并且野生型多肽的氨基酸序列或核苷酸序列是可公开获得的蛋白质数据库(例如，EMBL Nucleotide Sequence Database、NCBIEntrez、ExPasy、Protein Data Bank等)的部分。在另一个例子中，亲本多肽不是野生型多肽，但用作治疗多肽(即，经认可的药物)，并且此类多肽的序列可在科学出版物或专利中公开获得。在另外一个例子中，亲本多肽的氨基酸序列或编码亲本多肽的核酸序列在本发明的时间处以任何方式是可公开获得的。在一个实施方案中，亲本多肽是较大结构的部分。例如，亲本多肽与抗体的恒定区(Fc)或CH2结构域相对应，其中这些结构域可以是完整抗体的部分。在一个实施方案中，亲本多肽不是具有已知序列的抗体。
术语“突变体多肽”或“多肽变体”指这样的多肽形式，其中它的氨基酸序列不同于其相对应野生型形式、天然存在的形式或其他亲本形式的氨基酸序列。突变体多肽可以包含一个或多个突变，例如替换、插入、缺失等，这导致突变体多肽。
术语“序列子多肽”指在其氨基酸序列中包括“外源N联糖基化序列”的多肽变体。“序列子多肽”包含至少一个外源N联糖基化序列，还可以包括一个或多个内源(例如，天然存在的)N联糖基化序列。
术语“外源N联糖基化序列”指引入亲本多肽(例如，野生型多肽)的氨基酸序列内的N联糖基化序列，其中亲本多肽不包括N联糖基化序列，或包括在不同位置处的N联糖基化序列。在一个例子中，将N联糖基化序列引入不具有N联糖基化序列的野生型多肽内。在另一个例子中，野生型多肽天然地包括在第一个位置处的第一个N联糖基化序列。将第二个N联糖基化在第二个位置处引入这个野生型多肽内。这种修饰导致在第二个位置处具有“外源N联糖基化序列”的多肽。外源N联糖基化序列可以通过突变引入亲本多肽内。备选地，具有外源N联糖基化序列的多肽可以通过化学合成进行制备。
术语“与亲本多肽相对应”(或这个术语的语法变异)用于描述本发明的序列子多肽，其中序列子多肽的氨基酸序列仅由于本发明的至少一个外源N联糖基化序列的存在而不同于相对应亲本多肽的氨基酸序列。一般地，序列子多肽和亲本多肽的氨基酸序列显示高同一性百分比。在一个例子中，“与亲本多肽相对应”意指序列子多肽的氨基酸序列与亲本多肽的氨基酸序列具有至少约50％同一性，至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％同一性。在另一个例子中，编码序列子多肽的核酸序列与编码亲本多肽的核酸序列具有至少约50％同一性，至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约98％同一性。。
术语“将糖基化序列(例如，N联糖基化序列)引入(或加入等)亲本多肽”(或其语法变异)内，或“修饰亲本多肽”以包括糖基化序列(或其语法变异)，不一定意指亲本多肽是用于此类转变的物理原材料，而是意指亲本多肽提供用于制备另一个多肽的指导氨基酸序列。在一个例子中，“将糖基化序列引入亲本多肽内”意指关于亲本多肽的基因通过合适突变进行修饰，以产生编码序列子多肽的核苷酸序列。在另一个例子中，“将糖基化序列引入亲本多肽内”意指所得到的多肽使用亲本多肽序列作为指导在理论上进行设计。所设计的多肽随后可以通过化学或其他方式产生。
术语“引导多肽”指本发明的序列子多肽，其可以是例如通过本发明的方法有效糖基化的和/或糖缀合的(例如，糖基PEG化的)。对于作为引导多肽合适的本发明的序列子多肽，当实施合适的发育条件时，此类多肽优选是糖基化的或糖缀合的(例如，糖基PEG化的)，其中反应得率为至少约50％，优选至少约60％，更优选至少约70％，并且更加优选约80％、约85％、约90％或约95％。最优选的是这样的本发明的引导多肽，其可以是糖基化的或糖缀合的(例如，糖基PEG化的)，其中反应得率超过80％、超过85％、超过90％、或超过95％。在一个优选实施方案中，引导多肽是以这样的方式糖基化的或糖基PEG化的，使得每个N联糖基化序列的仅一个氨基酸残基是糖基化的或糖缀合的(例如，糖基PEG化的)(单糖基化)。在各种实施方案中，糖基化的或糖缀合的单个氨基酸残基位于外源N联糖基化序列内。
术语“文库”指不同多肽的集合，文库的每个成员与共同的亲本多肽相对应。文库中的每个多肽种类称为文库的“成员”。优选地，本发明的文库是具有足够数目和多样性的多肽的集合，以提供从其中鉴定引导多肽的群体。文库包括至少2个不同多肽。在一个实施方案中，文库包括约2至约10个成员。在另一个实施方案中，文库包括约10至约20个成员。在另外一个实施方案中，文库包括约20至约30个成员。在一个进一步的实施方案中，文库包括约30至约50个成员。在另一个实施方案中，文库包括约50至约100个成员。在另外一个实施方案中，文库包括超过100个成员。文库的成员可以是混合物的部分或可以彼此分离。在一个例子中，文库的成员是任选包括其他组分的混合物的部分。例如，至少2个序列子多肽存在于大量细胞培养肉汤中。在另一个例子中，文库的成员可以各自分开表达并且是任选分离的。经分离的序列子多肽可以任选包含在多孔容器中，其中每个孔包含不同类型的序列子多肽。
术语本发明的“CH2”结构域意欲描述免疫球蛋白重链恒定CH2结构域。在限定免疫球蛋白CH2结构域中，参考一般而言的免疫球蛋白且特别参考如通过Kabat E.A.(1978)Adv.Protein Chem.32：1-75应用于人IgG1的免疫球蛋白的结构域结构。
术语“包括CH2结构域的多肽”或“包括至少一个CH2结构域的多肽”意欲包括完整抗体分子、抗体片段(例如，Fc结构域)、或包括与免疫球蛋白的CH2区域等价的区域的融合蛋白。
术语“多肽缀合物”指其中如本文所述多肽用糖部分(例如，经修饰的糖)进行糖缀合的本发明的种类。在一个代表性例子中，多肽是具有外源O联糖基化序列的序列子多肽。
如本文所使用的，“接近脯氨酸残基”或“与脯氨酸残基接近”指这样的氨基酸，其远离脯氨酸残基小于约10个氨基酸，优选地，远离脯氨酸残基小于约9、8、7、6或5个氨基酸，更优选地，远离脯氨酸残基小于约4、3或2个氨基酸。“接近脯氨酸残基”的氨基酸可以在脯氨酸残基的C或N末端侧上。
术语“唾液酸”指九碳羧化糖家族的任何成员。唾液酸家族的最常见成员是N-乙酰-神经氨酸(2-酮-5-乙酰胺-3，5-双脱氧-D-甘油-D-galactononulopyranos-1-酮酸(通常缩写为Neu5Ac、NeuAc或NANA)。该家族的第二个成员是N-羟乙酰-神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基是羟基化的。第三个唾液酸家族成员是2-酮-3-脱氧-nonulosonic acid(KDN)(Nadano等人(1986)J.Biol.Chem.261：11550-11557；Kanamori等人，J.Biol. Chem.265：21811-21819(1990))。还包括的是9-取代唾液酸例如9-O-C1-C6酰基-Neu5Ac，如9-O-乳酰-Neu5Ac或9-O-乙酰-Neu5Ac、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。关于唾液酸家族的综述，参见例如，Varki，Glycobiology 2：25-40(1992)；Sialic Acids：Chemistry，Metabolism and Function，R.Schauer，编辑(Springer-Verlag，New York(1992))。在唾液酸化操作中唾液酸化合物的合成和使用公开于1992年10月1日公开的国际申请WO 92/16640中。
如本文所使用的，术语“经修饰的糖”指天然或非天然存在的碳水化合物。在一个实施方案中，“经修饰的糖”使用本发明的方法酶促加入多肽的氨基酸或糖基残基上。经修饰的糖选自许多酶底物，包括但不限于糖核苷酸(单、二和三磷酸盐)、活化糖(例如，糖基卤化物、糖基甲磺酸盐)和既未活化也不是核苷酸的糖。“经修饰的糖”用“修饰基团”共价官能化。有用的修饰基团包括但不限于，聚合修饰基团(例如，水溶性聚合物)、治疗部分、诊断部分、生物分子等。在一个实施方案中，修饰基团不是天然存在的糖基部分(例如，天然存在的多糖)。修饰基团优选是非天然存在的。在一个例子中，“非天然存在的修饰基团”是聚合修饰基团，其中至少一个聚合部分是非天然存在的。在另一个例子中，非天然存在的修饰基团是经修饰的碳水化合物。用修饰基团官能化的部位这样进行选择，使得它不阻止“经修饰的糖”酶促加入多肽。“经修饰的糖”也指任何糖基模拟部分，其用修饰基团官能化，并且是天然或经修饰的酶例如糖基转移酶的底物。
如本文所使用的，术语“聚合修饰基团”是包括至少一个聚合部分(聚合物)的修饰基团。在一个例子中，当加入多肽时，聚合修饰基团可以改变此类多肽的至少一种生物学性质，例如它的生物利用度、生物活性、它的体内半衰期或免疫原性。示例性聚合物包括水溶性和水不溶性聚合物。聚合修饰基团可以是线性或分支的，并且可以包括一个或多个独立选择的聚合部分，例如聚(亚烷基二醇)及其衍生物。在一个例子中，聚合物是非天然存在的。在一个示例性实施方案中，聚合修饰基团包括水溶性聚合物，例如聚(乙二醇)及其衍生物(PEG，m-PEG)、聚(丙二醇)及其衍生物(PPG，m-PPG)等。在一个优选实施方案中，聚(乙二醇)或聚(丙二醇)具有基本上均匀分散的分子量。在一个实施方案中，聚合修饰基团是天然存在或非天然存在的多糖(例如，多唾液酸)。
术语“水溶性的”指在水中具有一定可检测程度的溶解性的部分。检测和/或定量水溶性的方法是本领域众所周知的。示例性水溶性聚合物包括肽、寡糖和多糖、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等。肽可以具有混合序列或可以由单一氨基酸组成[聚(氨基酸)，例如聚(赖氨酸)]。示例性多糖是多(唾液酸)。示例性聚(醚)是聚(乙二醇)，例如，m-PEG。聚(乙烯亚胺)是示例性聚胺，并且聚(丙烯)酸是代表性聚(羧酸)。
水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇)(即，PEG)。然而，应当理解其他相关聚合物也适合于在本发明的实践中使用，并且术语PEG或聚(乙二醇)的使用在这方面意欲是包括的而不是排除的。术语PEG包括以其任何形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、双功能PEG、多臂PEG、叉状PEG、分支PEG、悬垂PEG(即，具有与聚合物主链悬垂的一个或多个官能团的PEG或相关聚合物)、或其中具有可降解连接的PEG。同样地，术语聚(环氧烷)意欲包括此类材料的所有形式，并且包括掺入超过一个类型的聚(环氧烷)的材料，例如PEG和PPG的组合。
聚合物主链可以是线性或分支的。分支聚合物主链是本领域一般已知的。一般地，分支聚合物具有中心分支核心部分和与中心分支核心连接的多条线性聚合物链。PEG通常以分支形式使用，其可以通过将环氧乙烷加入各种多元醇中进行制备，所述多元醇例如甘油、季戊四醇和山梨糖醇。中心分支部分也可以衍生自几种氨基酸，例如赖氨酸或半胱氨酸。在一个例子中，分支聚(乙二醇)可以以一般形式表示为R(-PEG-OH)m，其中R表示核心部分，例如甘油或季戊四醇，并且m表示臂的数目。多臂PEG分子例如美国专利号5,932,462中描述的那些也可以用作聚合物主链，所述专利通过引用整体合并入本文。
许多其他聚合物也适合于本发明。非肽和水溶性的聚合物主链在本发明中特别有用。合适的聚合物的例子包括但不限于，其他聚(亚烷基二醇)，例如聚(丙二醇)(“PPG”)、乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯属醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)、聚(α-羟酸)、聚(乙烯醇)、聚膦腈、聚噁唑啉、聚(N-丙酰基吗啉)，例如通过引用整体合并入本文的美国专利号5,629,384中描述的，以及其共聚物、三聚物和混合物。尽管聚合物主链的每条链的分子量可以改变，但它一般为约100Da至约100,000Da，通常约5,000Da至约80,000Da。
如本文所使用的，术语“糖缀合”指酶促介导的经修饰的糖种类与多肽的氨基酸或糖基残基的缀合，所述多肽例如本发明的突变型人生长激素。在一个例子中，经修饰的糖与一个或多个修饰基团共价附着。“糖缀合”的亚属是“二醇glycol-PEG化”或“糖基PEG化”，其中经修饰的糖的修饰基团是聚(乙二醇)或其衍生物，例如烷基衍生物(例如，m-PEG)或具有反应性官能团的衍生物(例如，H2N-PEG、HOOC-PEG)。
术语“大规模”和“工业规模”可互换使用，并且指这样的反应循环，其在单个反应循环完成时产生至少约250mg、优选至少约500mg、和更优选至少约1克糖缀合物。
术语“N联糖基化序列”或“序列子”指包括至少一个天冬酰胺(N)残基的任何氨基酸序列(例如包含约3至约9个氨基酸、优选约3至约6个氨基酸)。在一个实施方案中，N联糖基化序列是酶例如寡糖基转移酶的底物，优选当多肽的氨基酸序列的部分时。在一个一般的实施方案中，酶通过修饰上述天冬酰胺残基的氨基将糖基部分转移到N联糖基化序列上，所述天冬酰胺残基被称为“糖基化位点”。本发明区分在野生型多肽或其任何其他亲本形式中天然存在的N联糖基化序列(内源N联糖基化序列)和“外源N联糖基化序列”。包括外源N联糖基化序列的多肽被称为“序列子多肽”。亲本多肽的氨基酸序列可以通过重组技术、化学合成或其他方式进行修饰，以包括外源N联糖基化序列。
如本文所使用的，术语“糖基连接基团”指修饰基团(例如，PEG部分、治疗部分、生物分子)与之共价附着的糖基残基；所述糖基连接基团使修饰基团与缀合物的其余部分连接。在本发明的方法中，“糖基连接基团”变得与糖基化或未糖基化的多肽共价附着，从而使修饰基团与多肽的氨基酸和/或糖基残基连接。“糖基连接基团”一般通过“经修饰的糖”与多肽的氨基酸和/或糖基残基的酶促附着而衍生自“经修饰的糖”。糖基连接基团可以是糖衍生的结构，其在修饰基团-经修饰的糖盒形成过程中降解(例如，氧化→希夫碱形成→还原)，或糖基连接基团可以是“完整的糖基连接基团”。“糖基连接基团”可以包括糖基模拟部分。例如，用于将经修饰的糖加入糖基化多肽中的糖基转移酶(例如，唾液酸转移酶)显示出对于糖基模拟底物的耐受性(例如，其中糖部分是糖基模拟部分例如唾液酸模拟部分的经修饰的糖)。经修饰的糖基模拟糖的转移导致具有糖基连接基团的缀合物，所述糖基连接基团为糖基模拟部分。
术语“完整的糖基连接基团”指衍生自糖基部分的糖基连接基团，其中使修饰基团与缀合物的其余部分连接的糖单体未降解，例如使用的酶促氧化。例如，环结构通过经由高碘酸钠氧化而打开，或其中。本发明的示例性“完整的糖基连接基团”是唾液酸部分，其中C-6侧链是完整的(CHOH-CHOH-CH2OH)。
如本文所使用的，术语“靶向部分”指将选择性定位在身体的特定组织或区域中的种类。定位通过分子决定簇的特异性识别、靶向试剂或缀合物的分子大小、离子相互作用、疏水性相互作用等介导。使试剂靶向特定组织或区域的其他机制是本领域技术人员已知的。示例性靶向部分包括抗体、抗体片段、转铁蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白质、β-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO等。
术语“连接基团”是使2个部分连接的任何化学基团。在一个例子中，连接基团包括至少一个杂原子。示例性连接基团包括醚、硫醚、胺、甲酰胺、磺胺、肼、羰基、氨基甲酸盐、尿素、硫脲、酯和碳酸酯。
如本文所使用的，“治疗部分”指对于治疗有用的任何试剂，包括但不限于抗生素、抗炎剂、抗肿瘤药物、细胞毒素和放射性试剂。“治疗部分”包括生物活性试剂的药物前体、其中超过一个治疗部分与载体结合的构建体，例如多价试剂。治疗部分还包括蛋白质和包括蛋白质的构建体。示例性蛋白质包括但不限于，促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、干扰素(例如，干扰素-α、-β、-γ)、白介素(例如，白介素II)、血清蛋白质(例如，因子VII、VIIa、VIII、IX和X)、人绒毛膜促性腺素(HCG)、促卵泡激素(FSH)和促黄体激素(LH)和抗体融合蛋白(例如肿瘤坏死因子受体((TNFR)/Fc结构域融合蛋白))。
如本文所使用的，“抗肿瘤药物”意指对抗癌症有用的任何试剂，包括但不限于细胞毒素和试剂例如抗代谢药、烷化剂、蒽环类、抗生素、抗有丝分裂药、丙卡巴肼、羟基脲、天冬酰胺酶、皮质类固醇、干扰素和放射性试剂。在术语“抗肿瘤药物”的范围内还包括的是具有抗肿瘤活性的多肽例如TNF-α的缀合物。缀合物包括但不限于在治疗蛋白质和本发明的糖蛋白之间形成的那些。代表性缀合物是在PSGL-1和TNF-α之间形成的那种。
如本文所使用的，“细胞毒素或细胞毒素剂”意指对细胞有害的任何试剂。例子包括泰素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。其他毒素包括但不限于例如蓖麻蛋白、CC-1065和类似物——多卡米星。另外其他的毒素包括白喉毒素和蛇毒(例如，眼镜蛇毒)。
如本文所使用的，“放射性试剂”包括在诊断或破坏肿瘤中有效的任何放射性同位素。例子包括但不限于铟-111、钴-60。此外，天然存在的放射性元素例如铀、镭和钍(其一般代表放射性同位素的混合物)是放射性试剂的合适例子。金属离子一般与有机螯合部分进行螯合。
许多有用的螯合基团、冠醚、穴状配体等是本领域已知的，并且可以掺入本发明的化合物内(例如，EDTA、DTPA、DOTA、NTA、HDTA等及其膦酸酯类似物，例如DTPP、EDTP、HDTP、NTP等)。参见例如Pitt等人，“The Design of Chelating Agents for the Treatment ofIron Overload，”In，INORGANIC CHEMISTRY IN BIOLOGY ANDMEDICINE；Martell，编辑；American Chemical Society，Washington，D.C.，1980，第279-312页；Lindoy，THE CHEMISTRY OF MACROCYCLICLIGAND COMPLEXES；Cambridge University Press，Cambridge，1989；Dugas，BIOORGANIC CHEMISTRY；Springer-Verlag，New York，1989，和其中包含的参考文献。
此外，允许螯合剂、冠醚和环糊精与其他分子附着的许多途径是本领域技术人员可用的。参见例如，Meares等人，“Properties of In VivoChelate-Tagged Proteins and Polypeptides.”In，MODIFICATION OFPROTEINS：FOOD，NUTRITIONAL，AND PHARMACOLOGICAL ASPECTS；”Feeney，等人，编辑，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982，第370-387页；Kasina等人，Bioconjugate Chem.，9：108-117(1998)；Song等人，Bioconjugate Chem.，8：249-255(1997)。
如本文所使用的，“药学上可接受的载体”包括这样的任何材料，当与缀合物相组合时，所述材料保留缀合物的活性并且与受试者的免疫系统不反应。“药学上可接受的载体”包括固体和液体例如媒介物、稀释剂和溶剂。例子包括但不限于，标准药学载体中的任何，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳状液例如油/水乳状液、和各种类型的湿润剂。其他载体还可以包括无菌溶液、片剂包括包衣片和胶囊。一般地，此类载体包含赋形剂例如淀粉、乳、糖、特定类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或钙、滑石、蔬菜脂肪或油、树胶、二醇或其他已知赋形剂。此类载体还可以包括调味和颜色添加剂或其他成分。包括此类载体的组合物通过众所周知的常规方法进行配制。
如本文所使用的，“施用”意指经口施用，作为栓剂施用，局部接触，静脉内、腹膜内、肌内、损伤内或皮下施用，通过吸入施用，或给受试者植入缓慢释放装置例如微型渗透泵。施用通过任何途径包括肠胃外和经粘膜(例如，经口、鼻、阴道、直肠或经皮)，特别是通过吸入。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、小动脉内、真皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。此外，当注射是治疗肿瘤例如诱导细胞凋亡时，施用可以直接对于肿瘤和/或进入肿瘤周围的组织内。其他递送方式包括但不限于，脂质体制剂的使用、静脉内输注、经皮贴剂等。
术语“改善”指病理状态或病状的治疗中的任何成功标记，包括任何客观或主观参数，例如症状的减轻、缓解或减少，或患者的身体或精神正常中的改善。症状的改善可以基于客观或主观参数；包括体格检查和/或精神评估的结果。
术语“疗法”指疾病或病状的“治疗”或“处理”，包括预防疾病或病状在受试者(例如，人)中发生，所述受试者可能对该疾病易感但仍未经历或显示出疾病的症状(预防治疗)，抑制疾病(减缓或阻止其发展)、提供来自疾病的症状或副作用的缓解，和缓解疾病(引起疾病的消退)。
术语“有效量”或“有效的量”或“治疗有效量”或任何语法上等价的术语意指这样的量，当施用于动物或人用于治疗疾病时，所述量足以实现对于那种疾病的治疗。
术语“经分离的”指基本上或实际上不含用于产生材料的组分的材料。对于本发明的多肽缀合物，术语“经分离的”指基本上或实际上不含组分的材料，所述组分通常在用于制备多肽缀合物的混合物中伴随材料。“经分离的”和“纯的”可互换使用。一般地，本发明的经分离的多肽缀合物具有优选表示为范围的纯度水平。关于多肽缀合物的纯度范围的下限是约60％、约70％或约80％，并且纯度范围的上限是70％、约80％、约90％或超过约90％。
当多肽缀合物超过约90％纯时，其纯度也优选表示为范围。纯度范围的下限是约90％、约92％、约94％、约96％或约98％。纯度范围的上限是约92％、约94％、约96％、约98％或约100％纯度。
纯度通过任何领域公认的分析方法(例如，在银染色的凝胶上的条带强度、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC、质谱法或相似方法)进行测定。
如本文所使用的，“群体的基本上每个成员”描述本发明的多肽缀合物群体的特征，其中将加入多肽中的所选择百分比的经修饰的糖加入多肽上的多个等同的受体位点中。“群体的基本上每个成员”说的是与经修饰的糖缀合的多肽上的位点的“同质性”，并且指本发明的缀合物，所述本发明的缀合物是至少约80％、优选至少约90％和更优选至少约95％同质的。
“同质性”指跨越经修饰的糖与之缀合的受体部分群体的结构一致性。因此，在其中每个经修饰的糖部分与受体位点(其具有和每一个其他经修饰的糖与之缀合的受体位点相同的结构)缀合的本发明的多肽缀合物中，多肽缀合物被说成是约100％同质的。同质性一般表示为范围。关于多肽缀合物的同质性范围的下限是约50％、约60％、约70％或约80％，并且纯度范围的上限是约70％、约80％、约90％或超过约90％。
当多肽缀合物超过或等于约90％同质时，其同质性也优选表示为范围。同质性范围的下限是约90％、约92％、约94％、约96％或约98％。纯度范围的上限是约92％、约94％、约96％、约98％或约100％同质性。多肽缀合物的纯度一般通过本领域技术人员已知的一种或多种方法进行测定，例如液相色谱法-质谱法(LC-MS)、基质辅助的激光解吸飞行时间质谱法(MALDITOF)、毛细管电泳法等。
“基本上均匀的糖型”或“基本上均匀的糖基化模式”当指糖肽种类时，指通过目的糖基转移酶(例如，GalNAc转移酶)而被糖基化的受体部分的百分比。例如，在α1，2岩藻糖基转移酶的情况下，如果基本上所有(如下定义)Galβ1，4-GlcNAc-R及其唾液酸化类似物在本发明的肽缀合物中是岩藻糖基化的，那么显示基本上均匀的岩藻糖基化模式。本领域技术人员应当理解，原材料可以包含糖基化的受体部分(例如，岩藻糖基化的Galβ1，4-GlcNAc-R部分)。因此，经计算的糖基化百分比将包括通过本发明的方法糖基化的受体部分，以及在原材料中已糖基化的那些受体部分。
在“基本上均匀的”上文定义中的术语“基本上”一般意指对于特定糖基转移酶至少约40％、至少约70％、至少约80％，或更优选至少约90％，且更加优选至少约95％的受体部分是糖基化的。
当取代基通过其从左到右书写的常规化学式指定时，它们相等地包括化学上等同的取代物，这将起因于从右到左书写结构，例如-CH2O-意欲还描述-OCH2-。
除非另有说明，否则术语“烷基”本身或作为另一个取代物的部分意指直链或支链、或环状(即环烷基)烃原子团，或其组合，其可以是完全饱和的、单或多不饱和的，并且可以包括具有指定碳原子数目(即，C1-C10意指1至10个碳)的二价(例如烷撑)和多价原子团。饱和烃原子团的例子包括但不限于基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和同分异构体等。不饱和的烷基是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和的烷基的例子包括但不限于，乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1和3-丙炔基、3-丁炔基、以及更高级的同系物和同分异构体。除非另有说明，否则术语“烷基”也意欲包括在下文更详细地定义的那些烷基衍生物，例如“杂烷基”。局限于烃基团的烷基命名为“同烷基(homoalkyl)”。
术语“烷撑”本身或作为另一个取代物的部分意指衍生自烷烃的二价原子团，例如但不限于-CH2CH2CH2CH2-，并且进一步包括下文描述为“杂烷撑”的那些基团。一般地，烷基(或烷撑)基团将具有1至24个碳原子，其中具有10个或更少碳原子的那些基团在本发明中优选。“低级烷基”或“低级烷撑”是一般具有8个或更少碳原子的较短链的烷基或烷撑基团。
术语“烷氧基”、“烷氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规意义使用，并且分别指经由氧原子、氨基或硫原子与分子的其余部分附着的那些烷基。
除非另有说明，否则术语“杂烷基”本身或与另一个术语相组合意指稳定的直链或支链、或环状烃原子团、或其组合，由所述数目的碳原子和选自O、N、Si和S的至少一个杂原子组成，并且其中氮和硫原子可以任选是氧化的，并且氮杂原子可以任选是季铵化的。杂原子O、N、S和Si可以置于杂烷基的任何内部位置处或在其上烷基与分子的其余部分附着的位置处。例子包括但不限于-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2，-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。高达2个杂原子可以是相邻的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂烷撑”本身或作为另一个取代物的部分意指衍生自杂烷基的二价原子团，例如但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂烷撑基团，杂原子也可以占据一个或两个链末端(例如，烷撑氧基(alkyleneoxy)、烷撑二氧基、烷撑氨基、烷撑二氨基等)。再进一步地，对于烷撑和杂烷撑连接基团，连接基团的方向不由其中连接基团的式书写的方向暗示。例如，式-CO2R’-代表-C(O)OR’和-OC(O)R’。
除非另有说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其他术语相组合分别代表“烷基”和“杂烷基”的环状形式。此外，对于杂环烷基，杂原子可以占据在其上杂环与分子的其余部分附着的位置。环烷基的例子包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的例子包括但不限于，1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另有说明，否则术语“卤素”或“卤代”本身或作为另一个取代物的部分意指氟、氯、溴或碘原子。此外，术语例如“卤烷基”意欲包括单卤烷基和多卤烷基。例如，术语“卤(C1-C4)烷基”意欲包括但不限于，三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另有说明，否则术语“芳基”意指其可以为单环或多环(优选1至3个环)的多不饱和、芳香族取代基，所述环融合在一起或共价连接。术语“杂芳基”指包含选自N、O、S、Si和B的1至4种杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选是氧化的，并且氮原子任选是季铵化的。杂芳基可以通过杂原子与分子的其余部分附着。芳基和杂芳基的非限制性例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹噁啉基、5-喹噁啉基、3-喹啉基、和6-喹啉基。关于上述芳环和杂芳环系统各自的取代物选自下文描述的可接受的取代物。
为了间短起见，术语“芳基”当与其他术语相组合使用时(例如，芳氧基、芳硫氧基(arylthioxy)、芳烷基)包括如上定义的芳环和杂芳环。因此，术语“芳烷基”意欲包括其中芳基与烷基附着的那些原子团(例如苯甲基、苯乙基、吡啶甲基等)，包括其中碳原子(例如，亚甲基)已由例如氧原子替换的那些烷基(例如，苯氧甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
上述术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)各自意欲包括取代或未取代形式的所示原子团。关于每种类型原子团的优选取代物在下文提供。
关于烷基和杂烷基原子团(包括通常称为烷撑、烯基、杂烷撑、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代物在属类上称为“烷基取代物”，并且它们可以是选自但不限于下述的各种基团中的一种或多种：数目为0至(2m’+1)的取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2，其中m’是此类原子团中的碳原子的总数目。R’、R”、R”’和R””各自优选独立地指氢，取代或未取代的杂烷基，取代或未取代的芳基例如由1-3个卤素取代的芳基，取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或芳烷基。当本发明的化合物包括超过一个R基团时，例如R基团各自独立地选择为每个R’、R”、R”’和R””基团，当存在这些基团中的超过一个时。当R’和R”与相同氮原子附着时，它们可以与氮原子相组合，以形成5-、6-或7-成员环。例如，-NR’R”意欲包括但不限于，1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据取代物的上文讨论，本领域技术人员应当理解术语“烷基”意欲包括包含这样的基团，其包括与除氢基团外的基团结合的碳原子，例如卤烷基(例如，-CF3和-CH2CF3)和芳基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
类似于对于烷基原子团描述的取代物，关于芳基和杂芳基的取代物在属类上称为“芳基取代物”。取代物选自例如：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO2R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)2R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-CN和-NO2、-R’、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，数目为0至芳环系统上的开放效价的总数目；并且其中R’、R”、R”’和R””优选独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、和取代或未取代的杂芳基。当本发明的化合物包括超过一个R基团时，例如R基团各自独立地选择为每个R’、R”、R”’和R””基团，当存在这些基团中的超过一个时。
芳环或杂芳环的邻近原子上的2个取代物可以任选由式-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代物替换，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR’-或单键，并且q是0至3的整数。备选地，芳环或杂芳环的邻近原子上的2个取代物可以任选由式-A-(CH2)r-B-的取代物替换，其中A和B独立地是-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR’-或单键，并且r是1至4的整数。如此形成的新环的单键之一可以任选由双键替换。备选地，芳环或杂芳环的邻近原子上的2个取代物可以任选由式-(CRR’)s-X-(CR”R”’)d-的取代物替换，其中s和d独立地是0至3的整数，并且X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR’-。取代物R、R’、R”和R”’优选独立地选自氢或取代或未取代的(C1-C6)烷基。
如本文所使用的，术语“酰基”描述包含羰基残基C(O)R的取代物。关于R的示例性种类包括H、卤素、烷氧基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、和取代或未取代的杂环烷基。
如本文所使用的，术语“融合的环系统”意指至少2个环，其中每个环具有与另一个环共同的至少2个原子。“融合的环系统可以包括芳香族以及非芳香族环。“融合的环系统”的例子是萘、吲哚、喹啉、色烯等。
如本文所使用的，术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)、硼(B)和磷(P)。
符号“R”是代表取代基的一般缩写。示例性取代基包括取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、和取代或未取代的杂环烷基。
术语“药学上可接受的盐”包括依赖于在本文描述的化合物上发现的具体取代物，用分别地无毒酸或碱制备的盐。当本发明的化合物包含相对酸性的功能性时，通过使此类化合物(例如，其中性形式)与足够量的所需碱纯粹或在合适的惰性溶剂中相接触，可以获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的例子包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐、或相似盐。当本发明的化合物包括相对碱性的功能性时，通过使此类化合物(例如，其中性形式)与足够量的所需酸纯粹或在合适的惰性溶剂中相接触，可以获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的例子包括衍生自无机酸的那些，所述无机酸如盐酸、磺酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、单氢碳酸、磷酸、单氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、单氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等，以及衍生自相对无毒的有机酸的盐，所述有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、延胡索酸、乳酸、扁桃酸、苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等。还包括的是氨基酸的盐例如精氨酸盐(arginate)等，和有机酸例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸)的盐等(参见例如，Berge等人，Journal ofPharmaceutical Science，66：1-19(1977))。本发明的特定特异性化合物包含碱性和酸性功能性，其允许化合物转变成碱或酸加成盐。
化合物的中性形式优选通过使盐与碱或酸相接触并且以常规方式分离亲本化合物而再生。化合物的亲本形式在特定物理性质(例如在极性溶剂中的溶解性)方面不同于各种盐形式，但在其他方面盐等价于化合物的亲本形式用于本发明的目的。
除盐形式外，本发明提供了以药物前体形式的化合物。本文描述的化合物的药物前体是在生理条件下容易地经历化学变化以提供本发明的化合物的那些化合物。此外，药物前体可以在离体环境中通过化学或生物化学方法转变成本发明的化合物。例如，当与合适的酶或化学试剂一起置于经皮贴剂储库中时，药物前体可以缓慢地转变成本发明的化合物。
本发明的特定化合物可以以非溶剂化形式以及溶剂化形式包括水合物形式存在。一般而言，溶剂化形式等价于非溶剂化形式，并且包括在本发明的范围内。本发明的特定化合物可以以多结晶或无定形形式存在。一般而言，所有物理形式对于由本发明考虑的用途是等价的，并且预期在本发明的范围内。
本发明的特定化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋物、非对映异构体、几何异构体和个别同分异构体包括在本发明的范围内。
本发明的化合物可以制备为单一同分异构体(例如，对映体、顺式-反式、位置、非对映体)或制备为同分异构体的混合物。在一个优选实施方案中，化合物制备为基本上单一的同分异构体。制备基本上同分异构纯的化合物的方法是本领域已知的。例如，对映体富集的混合物和纯的对映体化合物可以通过使用对映体纯的合成中间产物与这样的反应相组合进行制备，所述反应使得手性中心处的立体化学不改变或导致其完全倒置。备选地，沿着合成途径的最终产物或中间产物可以解析(resovle)成单一立体异构体。用于使特定立体中心倒置或不改变的技术，以及用于解析立体异构体的混合物的技术，是本领域众所周知的，并且选择用于特定情况的合适方法完全在本领域技术人员的能力内。一般参见，Furniss等人(编辑)，VOGEL’S ENCYCLOPEDIA OF PRACTICALORGANIC CHEMISTRY第5版，Longman Scientific and Technical Ltd.，Essex，1991，第809-816页；和Heller，Acc.Chem.Res.23：128(1990)。
本文使用的外消旋、ambiscalemic和scalemic或对映体纯的化合物的图示取自Maehr，J.Chem.Ed.，62：114-120(1985)：实心和折断的(broken)楔形用于指示手性单元的绝对构型；波浪线指示它代表的键可以产生的任何立体化学牵涉的否认；实心和折断的粗线是指示所示相对构型但不暗示任何绝对立体化学的几何学描述符；并且楔形轮廓和虚线或折线指示不确定的绝对构型的对映体纯的化合物。
术语“对映体过量”和非对映体过量”在本文中可互换使用。具有单个立体中心的化合物被称为以“对映体过量”存在，具有至少2个立体中心的化合物被称为以“非对映体过量”存在。
本发明的化合物还可以包含在构成此类化合物的一个或多个原子处的非天然比例的原子同位素。例如，化合物可以用放射性同位素进行放射性标记，所述放射性同位素例如氘(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)。放射性或非放射性的本发明的化合物的所有同位素变异意欲包括在本发明的范围内。
如本文所使用的，“活性官能团”指基团，包括但不限于，烯属烃、乙炔、醇、酚、醚、氧化物、卤化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸酯、异氰酸酯、硫氰酸酯、异硫氰酸酯、胺、肼、腙、酰肼、重氮基、重氮、硝基、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亚砜、砜、磺酸、亚磺酸、缩醛、缩酮、酐、硫酸盐、次磺酸异腈、脒、酰亚胺、亚氨酸酯(imidates)、硝酮、羟胺、肟、羟肟酸、硫羟肟酸、丙二烯、原酸酯、亚硫酸盐、烯胺、炔胺、尿素、假尿素、氨基脲、碳化二亚胺、氨基甲酸酯、亚胺、叠氮化物、偶氮化合物、氧化偶氮化合物、和亚硝基化合物。反应性官能团还包括用于制备生物缀合物的那些，例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺等。制备这些官能团中每一种的方法是本领域众所周知的，并且其用于具体用途的应用或修饰在本领域技术人员的能力内(参见例如，Sandler和Karo，编辑ORGANIC FUNCTIONAL GROUPPREPARATIONS，Academic Press，San Diego，1989)。
“非共价蛋白质结合基团”是以结合方式与完整或变性多肽相互作用的部分。相互作用在生物环境中可以是可逆的或不可逆的。“非共价蛋白质结合基团”掺入本发明的螯合剂或复合物内，给试剂或复合物提供了以非共价方式与多肽相互作用的能力。示例性非共价相互作用包括疏水性-疏水性和静电相互作用。示例性“非共价蛋白质结合基团”包括阴离子基团，例如磷酸盐、硫代磷酸盐、膦酸盐、羧酸盐、硼酸盐、硫酸盐、砜、磺酸盐、硫代硫酸盐和硫代磺酸盐。
“酶截短”或“截短的酶”或语法变体以及“结构域缺失的酶”或语法变体指这样的酶，其具有比相对应天然存在的酶更少的氨基酸残基，但保留特定酶促活性。可以缺失任何数目的氨基酸残基，只要酶保留活性。在某些实施方案中，可以缺失结构域或结构域的部分，例如，可以缺失膜锚着结构域，留下可溶性酶。某些GalNAcT酶例如GalNAc-T2具有C末端凝集素结构域，其可以缺失而不减少酶促活性。
“重折叠表达系统”指具有氧化细胞内环境的细菌或其他微生物，当在这种微生物中表达时，其具有以其正确/活性形式重折叠含二硫化物蛋白质的能力。例子包括基于大肠杆菌的系统(例如，OrigamiTM(经修饰的大肠杆菌trxB-/gor-)，Origami 2TM等、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如，荧光)。关于OrigamiTM技术的示例性参考文献，参见例如，Lobel等人(2001)Endocrine 14(2)，205-212；和Lobel等人(2002)Protein Express.Purif.25(1)，124-133。
III.前言
本发明提供了包括至少一个外源N联糖基化序列(序列子多肽)的多肽。每个多肽与亲本多肽相对应。亲本多肽可以是任何多肽，包括野生型多肽和对于其氨基酸序列或核苷酸序列是已知的其他多肽(例如药学药物)。在一个实施方案中，亲本多肽不包括N联糖基化序列。在另一个实施方案中，亲本多肽(例如，野生型多肽)天然地包括N联糖基化序列。与此类亲本多肽相对应的序列子多肽包括在不同位置处的另外N联糖基化序列。在一个实施方案中，亲本多肽是治疗多肽，例如人生长激素(hGH)、促红细胞生成素(EPO)、治疗抗体、骨形态生成蛋白(例如，BMP-7)或血液因子(例如，因子VI、因子VIII或因子IX)。因此，本发明提供了治疗多肽变体，其在其氨基酸序列内包括一个或多个外源N联糖基化序列。
在一个实施方案中，N联糖基化序列是酶(例如寡糖基转移酶，例如PglB)的底物。酶催化糖基部分从糖基供体种类(例如，脂质-焦磷酸盐连接的糖基部分)到天冬酰胺(N)残基的转移，所述天冬酰胺(N)残基是N联糖基化序列的部分。可以与糖基化序列缀合的示例性糖基部分包括GlcNAc、GlcNH、bacillosamine、6-hydroybacillosamine、GalNAc、GalNH、GlcNAc-GlcNAc、GlcNAc-GlcNH、GlcNAc-Gal、GlcNAc-GlcNAc-Gal-Sia、GlcNAc-Gal-Sia、GlcNAc-GlcNAc-Man和GlcNAc-GlcNAc-Man(Man)2。示例性糖基供体种类在本文中描述。
因此，本发明提供了多肽缀合物，其中经修饰的或未经修饰的糖部分与本发明的N联糖基化序列附着。本发明进一步提供了制备此类多肽缀合物的方法。在一个代表性实施方案中，该方法是无细胞的体外方法，其中在糖基供体种类是其的底物的寡糖基转移酶的存在下，使多肽与糖基供体种类(例如脂质-焦磷酸盐连接的糖基部分，例如十一异戊烯-焦磷酸盐连接的糖基部分)相接触(例如，在反应容器中)。在这个糖基供体种类中的糖基部分是任选用修饰基团例如水溶性聚合修饰基团衍生的。该酶将经修饰的或未经修饰的糖基部分转移到多肽上，从而产生多肽缀合物。当修饰基团包括至少一个聚(乙二醇)部分时，那么此类糖基化反应被称为糖基PEG化。
在另一个代表性方法中，上述酶促反应在多肽在其中表达的宿主细胞内发生。寡糖基转移酶可以内源存在于宿主细胞中，或可以在宿主细胞中过表达。根据这种方法的细胞内糖基化提供了超过无细胞的体外糖基化的各种优点。例如，不需要在糖基化前从细胞培养中纯化多肽。此外，可以利用其他内源或共表达的酶，其可以用于进一步修饰最初形成的糖基化多肽。
本发明的糖修饰(例如糖基PEG化)方法可以对掺入N联糖基化序列的任何多肽进行实践。在一个实施方案中，由于例如通过免疫系统或网状内皮系统(RES)减少的清除率或减少的摄取率，本发明的方法提供了具有增加的治疗半衰期的多肽缀合物。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了用于掩蔽多肽上的抗原决定簇的方法，从而减少或消除针对多肽的宿主免疫应答。使用合适的经修饰的糖使靶向试剂与多肽选择性附着，可以用于将多肽靶向对于特定靶向试剂特异的特定组织或细胞表面受体。还提供的是显示出针对经由蛋白水解的降解增强的抗性的多肽，通过改变多肽上由蛋白水解酶切割或识别的特定位点达到的结果。在一个实施方案中，此类位点由本发明的N联糖基化序列替换，或部分由本发明的N联糖基化序列替换。
此外，本发明的方法可以用于调节亲本多肽的“生物活性谱”。本发明人已认识到使用本发明的方法使修饰基团例如水溶性聚合物(例如，mPEG)与亲本多肽附着，不仅可以改变所得到的多肽种类的生物利用度、药效性质、免疫原性、代谢稳定性、生物分布和水溶性，还可以导致不希望有的治疗活性的减少或所需治疗活性的增加。例如，前者已对于造血试剂促红细胞生成素(EPO)观察到。例如，特定以化学方法PEG化的EPO变体显示减少的促红细胞生成素活性，而野生型多肽的组织保护活性得到维持。此类结果在例如美国专利6,531,121；WO2004/096148、WO2006/014466、WO2006/014349、WO2005/025606和WO2002/053580中描述。对于评估所选多肽的差异生物活性有用的示例性细胞系概括于下表1中：
表1：用于多种多肽的生物学评估的细胞系
在一个实施方案中，本发明的多肽缀合物显示对于生物学靶蛋白质(例如，受体)、天然配体或非天然配体例如抑制剂减少或增强的结合亲和力。例如，取消对于一类特异性受体的结合亲和力可以减少或消除相关的细胞信号传导和下游生物学事件(例如，免疫应答)。因此，本发明的方法可以用于制备多肽缀合物，和缀合物与之相对应的亲本多肽相比较，其具有等同、相似或不同的治疗谱。本发明的方法可以用于鉴定具有特定(例如，改善的)生物学功能的糖基PEG化治疗剂，并且用于“微调”任何治疗多肽或其他生物学活性多肽的治疗谱。GlycoPEGylationTM是Neose Technologies的商标，并且指共同拥有的专利和专利申请例如，(WO2007/053731；WO2007/022512；WO2006/127896；WO2005/055946；WO2006/121569；和WO2005/070138)中公开的技术。
IV.组合物
多肽
在一个方面，本发明提供了具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包括本发明的至少一个外源N联糖基化序列(序列子多肽)。N联糖基化序列在本文下文中描述。在一个实施方案中，多肽的氨基酸序列包括外源N联糖基化序列，其是一种或多种野生型、突变型或截短的寡糖基转移酶的底物。示例性寡糖基转移酶在本文下文中描述，并且包括本文描述的那些酶的全长或截短形式(例如，SEQ ID NO：102至114)。
在一个示例性实施方案中，通过重组技术经由改变相对应亲本多肽(例如，野生型多肽)的氨基酸序列来产生本发明的多肽。用于制备重组多肽的方法是本领域技术人员已知的。示例性方法在本文下文中描述。多肽的氨基酸序列可以包括天然存在的和外源(即，非天然存在的)N联糖基化序列的组合。
本发明的多肽或亲本多肽可以是任何多肽。在多种实施方案中，多肽是治疗多肽。在一个例子中，多肽是重组多肽。多肽可以是糖肽并且可以具有任何数目的氨基酸。在一个实施方案中，本发明的多肽具有约5kDa至约500kDa的分子量。在另一个实施方案中，多肽具有约10kDa至约400kDa、约10kDa至约350kDa、约10kDa至约300kDa、约10kDa至约250kDa、约10kDa至约200kDa或约10kDa至约150kDa的分子量。在另一个实施方案中，多肽具有约10kDa至约100kDa的分子量。在另外一个实施方案中，多肽具有约10kDa至约50kDa的分子量。在一个进一步的实施方案中，多肽具有约10kDa至约25kDa的分子量。
示例性多肽包括野生型多肽及其片段，以及由其天然存在的配对物进行修饰(例如，通过突变或截短)的多肽。多肽还可以是融合蛋白。示例性融合蛋白包括其中多肽与荧光蛋白质(例如，GFP)、治疗多肽、抗体、受体配体、蛋白质性质的毒素、MBP、His-标签等融合的融合蛋白。
在一个例子中，本发明的多肽包括本发明的N联糖基化序列，并且另外包括O联糖基化序列。示例性O联糖基化序列和用于糖基化O联糖基化序列的示例性酶在2007年7月23日提交的美国专利申请11/781,885中描述，所述美国专利申请通过引用整体合并入本文。使用GlcNAc转移酶的O联糖基化序列在2008年6月4日提交的美国临时专利申请60/941,926和PCT/US2008/065825中描述，所述专利的公开内容也整体合并入本文。
在一个实施方案中，多肽是治疗多肽，例如目前用作药学试剂(即，经认可的药物)的那些。多肽的非限制性选择显示于2006年6月8日提交的美国专利申请10/552,896的图28中，所述美国专利申请通过引用合并入本文。
示例性多肽包括生长因子，例如肝细胞生长因子(HGF)、神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(例如，FGF-1、FGF-2、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-19、FGF-20、FGF-21、FGF-22和FGF-23)、角质化细胞生长因子(KGF)、巨核细胞生长和发育因子(MGDF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、转化生长因子(例如，TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3)、血管内皮生长因子(VEGF；例如，VEGF-2)、VEGF抑制剂例如VEGF-TRAP(Aflibercept)、骨生长因子(BGF)、神经胶质生长因子、肝素结合的促神经突生长因子(HBNF)、C1酯酶抑制剂，激素例如人生长激素(hGH)、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和甲状旁腺激素、促滤泡素(例如，促滤泡素-α、促滤泡素-β)、滤泡抑素、促黄体激素(LH)，以及细胞因子，例如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18)、干扰素(例如，INF-α、INF-β、INF-γ、INF-ω、INF-τ)和胰岛素。
其他示例性多肽包括酶，例如葡糖脑苷酯酶、α-半乳糖苷酶(例如，FabrazymeTM)、酸性-α-葡糖苷酶(酸性麦芽糖酶)、艾杜糖醛酸酶例如α-L-艾杜糖醛酸酶(例如，AldurazymeTM)、甲状腺过氧化物酶(TPO)、β-葡糖苷酶(参见例如，美国专利申请号10/411,044中描述的酶)、芳基硫酸酯酶、天冬酰胺酶、α-葡糖神经酰胺酶(glucoceramidase)(例如，伊米苷酶)、鞘磷脂酶、丁酰胆碱酯酶、尿激酶和α-半乳糖苷酶A(参见例如，美国专利号7,125,843中描述的酶)。
其他示例性亲本多肽包括骨形态发生蛋白质(例如，BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15)、神经营养素(例如，NT-3、NT-4、NT-5)、促红细胞生成素(EPO)、新红细胞生成刺激蛋白质(NESP；例如，Aranesp)、生长分化因子(例如，GDF-5)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、肌肉生长抑制素(myostatin)、神经生长因子(NGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF；例如，)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、α1-抗胰蛋白酶(ATT或α-1蛋白酶抑制剂)、组织型纤溶酶原激活物(TPA)、水蛭素、瘦素、尿激酶、人DNA酶、胰岛素、乙型肝炎表面蛋白质(HbsAg)、人绒毛膜促性腺素(hCG)、骨桥蛋白、护骨素(osteoprotegrin)、蛋白质C、生长调节素-1、促生长素、生长激素、嵌合白喉毒素-IL-2、胰高血糖素样肽(例如，GLP-1和GLP-2)、凝血酶、血小板生成素、凝血酶敏感蛋白-2、抗凝血酶III(AT-III)、前动力蛋白(prokinetisin)、CD4、α-CD20、肿瘤坏死因子(例如，TNF-α)、TNF-α抑制剂、TNF受体(TNF-R)、P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)、补体、转铁蛋白、糖基化依赖性细胞粘附分子(GlyCAM)、神经细胞粘附分子(N-CAM)、TNF受体-IgG Fc区融合蛋白、extendin-4、BDNF、β-2-微球蛋白、睫状神经营养因子(CNTF)、淋巴毒素-β受体(LT-β受体)、纤维蛋白原、GDF(例如，GDF-1、GDF-2、GDF-3、GDF-4、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、GDF-11、GDF-12、GDF-13、GDF-14、GDF-15)、GLP-1、胰岛素样生长因子(例如，IGF1)、胰岛素样生长因子结合蛋白(例如，IGB-5)、IGF/IBP-2、IGF/IBP-3、IGF/IBP-4、IGF/IBP-5、IGF/IBP-6、IGF/IBP-7、IGF/IBP-8、IGF/IBP-9、IGF/IBP-10、IGF/IBP-11、IGF/IBP-12和IGF/IBP-13。关于上文列出的多肽中的某些的示例性氨基酸序列在美国专利号：7,214,660中描述，所述所有专利通过引用合并入本文。
在一个例子中，多肽是血管性血友病因子(vWF)或vWF的部分。重组vWF已得到描述(参见例如，Fischer B.E.等人，Cell.Mol.Life Sci.1997，53：943-950，其通过引用合并入本文。在另一个例子中，多肽是切割vWF的蛋白酶(vWF-蛋白酶、vWF-降解蛋白酶)。
在一个例子中，本发明的多肽是血液凝固因子(血液因子)。示例性血液因子包括因子V、因子VII、因子VIII(例如，因子VIII-2、因子VIII-3)、因子IX、因子X和因子XIII。在另一个例子中，多肽是血液因子抑制剂(例如，因子Xa抑制剂)。
在一个具体例子中，多肽是因子VIII。因子VIII和因子VIII变体是本领域已知的。例如，美国专利号5,668,108描述了因子VIII变体，其中在位置1241处的天冬氨酸由谷氨酸替换。美国专利号5,149,637描述了包括糖基化或未糖基化的C末端部分的因子VIII变体，并且美国专利号5,661,008描述了包括通过至少3个氨基酸残基与氨基酸1649至2332连接的氨基酸1-740的因子VIII变体。因此，因子VIII的变体、衍生物、修饰和复合物是本领域众所周知的，并且包括在本发明的范围内。用于产生因子VIII的表达系统也是本领域众所周知的，并且包括原核和真核细胞，如美国专利号5,633,150、5,804,420和5,422,250中例示的。上文讨论的因子VIII序列中的任何都可以进行修饰，以包括外源O联、S联或N联糖基化序列。
在一个例子中，因子VIII是全长或野生型因子VIII多肽。关于全长因子VIII多肽的示例性氨基酸序列显示于图1A和1B(SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9)中。在另外一个例子中，多肽是因子VIII多肽，其中B结构域包括比野生型或全长因子VIII的B结构域更少的氨基酸残基。这些因子VIII多肽被称为B结构域缺失的或部分B结构域缺失的因子VIII。本领域技术人员将能够鉴定在给定因子VIII多肽内的B结构域。在一个例子中，B结构域包括在2个侧翼序列IEPR(在N末端侧上)和EITR(在C末端侧上)之间的氨基酸残基。然而，本领域技术人员应当理解这2个侧翼序列可以不存在，或可以例如通过突变进行修饰。在因子VIII多肽内的B结构域的一般定位在下图中举例说明：
在示例性因子VIII多肽内的B结构域：
......IEPR-B结构域-EITR...。
在一个例子中，B结构域在全长因子VIII序列(例如，图1B中所示的序列)的氨基酸残基Arg740和Glu1649之间发现：
...IEPR740-B结构域-E1649ITR...。
在一个实施方案中，本发明的因子VIII多肽不包括通常与B结构域结合的任何氨基酸残基(完全B结构域缺失)。根据这个实施方案的示例性氨基酸序列显示于图2中，其中全长因子VIII序列(图1B)的Arg740和Glu1649之间的所有氨基酸残基被去除。在另一个实施方案中，原始B结构域替换为另一个序列(B结构域替换序列)。在一个例子中，因子VIII多肽的B结构域替换序列包括至少2个氨基酸。例如，至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个氨基酸残基在图2中的Arg740和Glu1649之间发现。替换序列可以包括任何数目的氨基酸残基，并且可以具有任何氨基酸序列。
在一个例子中，替换B结构域的序列包括部分B结构域序列。例如，替换B结构域的序列包括B结构域的约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14或超过14个N末端氨基酸(例如，在图2中的Arg740和Glu1649之间)。例如，替换序列可以包括选自SFSQN、SFSQNS、SFSQNSR和SFSQNSRH的部分N末端B结构域序列。在另一个例子中，替换B结构域的序列包括原始B结构域的约2、约4、约6、约8、约10、约12、约14或超过14个C末端氨基酸(例如，在图2中的Arg740和Glu1649之间)。例如，替换序列可以包括选自QR、HQR、RHQR、KRHQR、LKRHQR、VLKRHQR和PPVLKRHQR的部分C末端B结构域序列。在另外一个例子中，替换B结构域的氨基酸序列包括超过一个部分序列的组合。例如，替换序列包括与原始B结构域的部分C末端序列连接的部分N末端序列，其中N末端和C末端B结构域任选经由另外的氨基酸残基例如一个或多个精氨酸残基连接。关于B结构域缺失的因子VIII多肽的示例性氨基酸序列包括图3-5(SEQ ID NO：4-6)中所示的那些序列。
在一个实施方案中，B结构域替换序列包括天然或非天然存在的(例如，外源)N联或O联糖基化序列。在一个例子中，原始B结构域以这样的方式进行截短，以便使得原始B结构域中天然存在的O联或N联糖基化序列中的至少一个保持完整。在另一个例子中，如上所述的部分B结构域序列的组合导致糖基化序列的形成。例子可以在图5中观察到：P749SQNP。
在另外一个例子中，B结构域替换序列包括天然存在的B结构域中不存在的氨基酸序列，其中这个非天然存在的序列包括外源O联或N联糖基化序列(例如，本发明的O联糖基化序列)。在一个例子中，B结构域替换序列包括本发明的外源O联糖基化序列，例如PTP、PTEI、PTEIP、PTQA、PTQAP、PTINT、PTINTP、PTTVS、PTTVL、PTQGAM、PTQGAMP、TETP、PTVL、PTVLP、PTLSP、PTDAP、PTENP、PTQDP、PTASP、PTTVSP、PTQGA、PTSAV、PTTLYV、PTTLYVP、PSSGP或PSDGP。在另一个例子中，B结构域替换序列包括本发明的外源N联糖基化序列，例如NLT。
在一个实施方案中，本发明提供了这样的因子VIII多肽，其包括根据图1A、图1B、图2、图3、图4或图5的氨基酸序列，并且进一步包括在N末端处或在选自1至740的氨基酸位置处(重链)引入所述氨基酸序列内的外源N联糖基化序列。在另一个示例性实施方案中，本发明提供了这样的因子VIII多肽，其包括根据图4的氨基酸序列，并且进一步包括在选自782至1,465的氨基酸位置处(轻链)引入所述氨基酸序列内的外源N联糖基化序列。在另一个示例性实施方案中，本发明提供了这样的因子VIII多肽，其包括根据图1A、图1B、图2、图3、图4或图5的氨基酸序列，并且进一步包括在所述因子VIII多肽的轻链内的氨基酸位置处引入所述氨基酸序列内的外源N联糖基化序列。在另一个示例性实施方案中，本发明提供了这样的因子VIII多肽，其包括根据图4的氨基酸序列，并且进一步包括在选自741至781的氨基酸位置处(B结构域片段)引入所述氨基酸序列内的外源N联糖基化序列。在另一个示例性实施方案中，本发明提供了这样的因子VIII多肽，其包括根据图1A、图1B、图2、图3、图4或图5的氨基酸序列，并且进一步包括在所述因子VIII多肽的B结构域或B结构域片段内引入所述氨基酸序列内的外源N联糖基化序列。在一个例子中，本发明的因子VIII多肽在CHO细胞中产生。在另一个例子中，因子VIII多肽使用本领域已知的trxB gor突变型大肠杆菌表达系统(Origami)产生。
在另一个例子中，多肽是2个或更多个多肽之间的融合蛋白。在另一个例子中，多肽是2个或更多个多肽之间的复合物。在一个示例性实施方案中，复合物包括血液因子。在另一个示例性实施方案中，复合物包括因子VIII。这种复合物中的因子VIII多肽可以是全长、B结构域缺失、或部分B结构域缺失的因子VIII。在一个例子中，复合物在因子VIII和血管性血友病因子(vWF)之间形成。
还在本发明的范围内是其为抗体的多肽。术语抗体意欲包括免疫球蛋白、抗体片段(例如，Fc结构域)、单链抗体、Lama抗体、纳米抗体等。在该术语中还包括的是抗体融合蛋白，例如Ig嵌合体。优选的抗体包括人源化、单克隆抗体或其片段。此类抗体的所有已知同种型在本发明的范围内。示例性抗体包括针对生长因子的那些，所述生长因子例如内皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(例如针对VEGF-A的单克隆抗体，例如雷尼珠单抗(ranibizumab)(LucentisTM))和成纤维细胞生长因子，例如FGF-7、FGF-21和FGF-23)和针对其分别受体的抗体。其他示例性抗体包括抗TNF抗体，例如抗TNF-α单克隆抗体(参见例如，美国专利申请号10/411,043)、TNF受体-IgG Fc区融合蛋白(例如，EnbrelTM)、抗HER2单克隆抗体(例如，HerceptinTM)、针对呼吸道合胞病毒的蛋白质F的单克隆抗体(例如，SynagisTM)、针对TNF-α的单克隆抗体(例如，RemicadeTM)，针对糖蛋白例如IIb/IIIa的单克隆抗体(例如，ReoproTM)，针对CD20(例如，RituxanTM)、CD4、α-CD3、CD40L和CD154(例如，鲁利单抗)的单克隆抗体，针对PSGL-1和CEA的单克隆抗体。上文列出的多肽中任何的任何经修饰的(例如突变的)形式也在本发明的范围内。
在一个示例性实施方案中，亲本多肽是包括(SEQ ID NO：7)的氨基酸序列的EPO，其在下文显示：
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr LeuLeu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn24Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu HisCys Ser Leu Asn Glu Asn38 Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn PheTyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val TrpGln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala LeuLeu Val Asn83 Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val AspLys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala LeuGly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser126 Ala Ala ProLeu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr SerAsn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys ArgThr Gly Asp。
在一个示例性实施方案中，亲本多肽包括具有由不带电的氨基酸(例如甘氨酸或丙氨酸)替换碱性氨基酸残基(例如精氨酸或赖氨酸)的至少一个突变的氨基酸序列。在另一个实施方案中，EPO多肽包括具有选自Arg139至Ala139、Arg143至Ala143和Lys154至Ala154的至少一个突变的氨基酸序列。
N联糖基化序列
本发明的N联糖基化序列可以是任何的短氨基酸序列。在一个实施方案中，N联糖基化序列包括约3至约20、优选约3至约10、更优选约3至约9且最优选约3至约7个氨基酸残基。本发明的N联糖基化序列包括具有氨基的至少一个氨基酸残基。在一个实施方案中，本发明的N联糖基化序列包括至少一个天冬酰胺(N)残基。在另一个实施方案中，当对序列子多肽实施酶促糖基化或糖缀合反应时，天冬酰胺残基的氨基是糖基化的。在这个反应过程中，氨基的氢原子由糖基部分替换。接受糖基部分的氨基酸残基被称为“糖基化的位点”或“糖基化位点”。
在一个实施方案中，本发明的N联糖基化序列天然存在于野生型多肽中。此类野生型多肽的多肽缀合物在本发明的范围内。在另一个实施方案中，N联糖基化序列不存在于相对应的亲本多肽(外源N联糖基化序列)中，或不存在于其的相同位置处。外源N联糖基化序列引入亲本多肽内产生本发明的序列子多肽。N联糖基化序列可以通过突变引入亲本多肽内。在另一个例子中，N联糖基化序列通过序列子多肽的化学合成引入亲本多肽的氨基酸序列内。
在一个实施方案中，本发明的N联糖基化序列包括根据式(I)(SEQID NO：1)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，N联糖基化序列包括根据式(II)(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列。在另外一个实施方案中，N联糖基化序列由根据式(I)的氨基酸序列组成。在一个进一步的实施方案中，N联糖基化序列由根据式(II)的氨基酸序列组成：
X1NX2X3X4(I)(SEQ ID NO：1)
X1DX2’N X2X3X4(II)(SEQ ID NO：2)。
在式(I)和式(II)中，N是天冬酰胺，并且D是天冬氨酸。在一个实施方案中，X3是苏氨酸(T)。在另一个实施方案中，X3是丝氨酸(S)。X1存在或不存在。当存在时，X1可以是任何氨基酸。在一个实施方案中，X1是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)和脯氨酸(P)的成员。X4存在或不存在。当存在时，X4可以是任何氨基酸。在一个实施方案中，X4是选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、半胱氨酸(C)、脯氨酸(P)的成员。
在式(I)和式(II)中，X2可以是任何氨基酸。在一个优选实施方案中，X2不是脯氨酸(P)。X2’可以是任何氨基酸。在一个实施方案中，X2’不是脯氨酸。在一个实施方案中，X2和X2’是独立地选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)和半胱氨酸(C)的成员。N联糖基化序列可以包括另外的C或N末端氨基酸残基。在一个实施方案中，另外的氨基酸用于调节在糖基化位点附近的多肽的三级结构。
在一个实施方案中，式(I)中的X2是不带电的氨基酸。在一个示例性实施方案中，N联糖基化序列是选自X1NGSX4、X1NGTX4、X1NASX4、X1NATX4、X1NVSX4、X1NVTX4、X1NLSX4、X1NLTX4、X1NISX4、X1NITX4、X1NFSX4、X1NFTX4、X1NSSX4、X1NSTX4、X1NTSX4、X1NTTX4、X1NCSX4、X1NCTX4、X1NYSX4和X1NYTX4的成员，其中X1和X4如上定义。在根据这个实施方案的一个例子中，X1不存在。在另一个例子中，X4不存在。在另外一个实施方案中，X1和X4都不存在。
因此，在另一个例子中，N联糖基化序列是选自NGS、NGT、NAS、NAT、NVS、NVT、NLS、NLT、NIS、NIT、NFS、NFT、NSS、NST、NTS、NTT、NCS、NCT、NYS和NYT的成员。
在一个实施方案中，N联糖基化序列是根据式(II)的延长的糖基化序列。在另一个实施方案中，当寡糖基转移酶是细菌起源的酶(例如，PglB)时，使用延长的糖基化序列。在另一个实施方案中，式(II)中的X2是不带电的氨基酸。在根据这个实施方案的一个例子中，N联糖基化序列是选自X1D X2′NGSX4、X1DX2′NGTX4、X1DX2′NASX4、X1DX2′NATX4、X1DX2′NVSX4、X1DX2′NVTX4、X1DX2′NLSX4、X1DX2′NLTX4、X1DX2′NISX4、X1DX2′NITX4、X1DX2′NFSX4和X1DX2′NFTX4的成员，其中X1、X2′和X4如上定义。
在另一个例子中，N联糖基化序列是选自D X2′NGS，DX2′NGT，DX2′NAS，DX2′NAT，DX2′NVS，DX2′NVT，DX2′NLS，DX2′NLT，DX2′NIS，DX2′NIT，DX2′NFS和DX2′NFT的成员，其中X2′如上定义。在另一个例子中，上述实施方案的任何中的X2′选自不带电的氨基酸。在一个例子中，X2′是G。在另一个例子中，X2′是A。在另外一个例子中，X2′是V。在一个进一步的例子中，X2′是L。在一个进一步的例子中，X2′是I。在一个进一步的实施方案中，X2′是F。
N联糖基化序列的定位
在一个实施方案中，当多肽的部分(例如，本发明的序列子多肽)时，N联糖基化序列是寡糖基转移酶(例如，Stt3p或PglB)的底物。在另一个例子中，糖基化序列是经修饰的酶例如具有缺失或截短的膜锚着结构域的酶的底物。本发明的每个N联糖基化序列在合适的糖基化反应过程中糖基化的效率可以依赖于酶的类型和性质，并且还可以依赖于糖基化序列的前后关系，特别是糖基化位点周围的多肽的三维结构。
一般地，N联糖基化序列可以在多肽的氨基酸序列内的任何位置处引入。在一个优选实施方案中，N联糖基化序列(在所使用的反应条件下)对于寡糖基转移酶是易接近的。在一个例子中，糖基化序列在亲本多肽的N末端处引入(即，在第一个氨基酸前或紧在第一个氨基酸后)(氨基末端突变体)。在另一个例子中，N联糖基化序列接近亲本多肽的氨基末端引入(例如，在N末端的10个氨基酸残基内)。在另一个例子中，N联糖基化序列紧在亲本多肽的最后一个氨基酸后定位于亲本多肽的C末端处(羧基末端突变体)。在另外一个例子中，N联糖基化序列接近亲本多肽的C末端引入(例如，在C末端的10个氨基酸残基内)。在另外一个例子中，N联糖基化序列定位于亲本多肽的N末端和C末端之间的任何地方(内部突变体)。一般优选经修饰的多肽是生物活性的，即使该生物活性由相对应的亲本多肽的生物活性改变。
影响序列子多肽的糖基化效率的重要因素是糖基化位点(例如，天冬酰胺侧链)对于糖基/糖基(saccharyl)转移酶和其他反应配偶体包括溶剂分子的易接近性。如果糖基化序列定位在多肽的内部结构域内，那么糖基化将可能是无效的。因此，在一个实施方案中，糖基化序列在与多肽的溶剂暴露表面相对应的多肽区域处引入。示例性多肽构象是其中糖基化序列的靶氨基不在内部定向的构象，与多肽的其他区域形成氢键。另一个示例性构象是其中氨基不太可能与附近蛋白质形成氢键的构象。
在一个例子中，N联糖基化序列在亲本蛋白质的预先选择的特定区域内产生。在自然界中，多肽主链的糖基化通常在多肽的环区域内出现，并且一般不在螺旋或β-片层结构内出现。因此，在一个实施方案中，通过将N联糖基化序列引入与环结构域相对应的亲本多肽区域内来产生本发明的序列子多肽。
例如，蛋白质BMP-7的晶体结构包含在Ala72和Ala86以及Ile96和Pro103之间的2个延长的环区域。产生其中N联糖基化序列置于多肽序列的这些区域内的BMP-7突变体，可以导致其中突变引起多肽的原始三级结构的很少破坏或无破坏的多肽。
然而，在β-片层或α-螺旋构象内包括的氨基酸位置处引入N联糖基化序列也可以导致序列子多肽，其在新近引入的N联糖基化序列处被有效糖基化。N联糖基化序列引入β-片层或α-螺旋结构域内可以引起多肽的结构改变，这进而使有效糖基化成为可能。
蛋白质的晶体结构可以用于鉴定野生型或亲本多肽的结构域，所述结构域最适合于引入N联糖基化序列，并且可以允许预先选择有希望的修饰位点。
当晶体结构无法获得时，多肽的氨基酸序列可以用于预先选择有希望的修饰位点(例如，环结构域与α-螺旋结构域的预测)。然而，即使多肽的三级结构是已知的，但结构动力学和酶/受体相互作用在溶液中也是可变的。因此，合适的突变位点的鉴定以及合适的糖基化序列的选择，可能涉及几种序列子多肽(例如，本发明的序列子多肽的文库)的产生，并且使用合适的筛选方案例如本文描述的那些就所需特征测试这些变体。
在一个实施方案中，其中亲本多肽是抗体或抗体片段，抗体或抗体片段的恒定区(例如，CH2结构域)用本发明的N联糖基化序列进行修饰。在一个例子中，N联糖基化序列以这样的方式引入，使得天然存在的糖基化序列被替换或在功能上受损。关于抗体的恒定区的氨基酸和核酸序列是本领域技术人员已知的。
在一个实施方案中，经过CH2结构域的所选区域执行序列子扫描，产生各自包括本发明的外源N联糖基化序列的抗体的文库。在另外一个实施方案中，对所得到的多肽变体实施旨在给糖基化序列添加糖基部分的酶促糖基化反应。充分糖基化的那些变体可以就其结合合适受体(例如，Fc受体，例如FcγRIIIa)的能力进行分析。在一个实施方案中，当与亲本抗体或其天然糖基化形式相比较时，此类糖基化抗体或抗体片段显示出对于Fc受体增加的结合亲和力。本发明的这个方面在2007年1月18日提交的美国临时专利申请60/881,130中进一步描述，所述美国临时专利申请的公开内容整体合并入本文。所述修饰可以改变抗体的效应子功能。在一个实施方案中，糖基化的抗体变体显示出减少的效应子功能，例如对于天然杀伤细胞表面上或杀伤T细胞表面上发现的受体减少的结合亲和力。在另一个例子中，当与未经修饰的抗体相比较时，抗体的糖缀合用于修饰经修饰的抗体的药代动力学和/或药效性质。例如，糖缀合的抗体具有比未经修饰的抗体更长的体内半衰期。
包括N联糖基化序列的肽连接体片段
在另一个实施方案中，不是将N联糖基化序列引入亲本多肽序列内，而是通过将肽连接体片段加入亲本多肽的N或C末端来延长亲本多肽的序列，其中肽连接体片段包括本发明的N联糖基化序列，例如“NLT”或“DFNVS”。肽连接体片段可以具有任何数目的氨基酸。在一个实施方案中，肽连接体片段包括至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约30、至少约50或超过50个氨基酸残基。肽连接体片段任选包括内部或末端氨基酸残基，其具有反应性官能团，例如氨基(例如，赖氨酸)或巯基(例如，半胱氨酸)。此类反应性官能团可以用于使多肽与另一个部分连接，所述另一个部分例如另一个多肽、细胞毒素、小分子药物或本发明的另一个修饰基团。本发明的这个方面在2007年1月18日提交的美国临时专利申请60/881,130中进一步描述，所述美国临时专利申请的公开内容整体合并入本文。
在一个实施方案中，由本发明的肽连接体片段修饰的亲本多肽是抗体或抗体片段。在根据这个实施方案的一个例子中，亲本多肽是scFv。本文描述的方法可以用于制备本发明的scFv，其中scFv或连接体用糖基部分或通过糖基连接基团与肽附着的修饰基团进行修饰。糖基化和糖缀合的示例性方法在例如PCT/US02/32263和美国专利申请号10/411,012中阐述，所述专利各自通过引用整体合并入本文。
在一个实施方案中，特定氨基酸残基包括在N联糖基化序列内，以调节突变多肽在特定生物体例如大肠杆菌的表达性、蛋白水解稳定性、多肽的结构特征和/或其他性质。
示例性多肽
本发明的N联糖基化序列可以引入任何亲本多肽内，产生本发明的序列子多肽。本发明的序列子多肽可以使用本领域已知和本文下文描述的方法来产生(例如，通过重组技术或化学合成)。在一个实施方案中，亲本序列以这样的方式进行修饰，使得N联糖基化序列插入亲本序列内，给亲本多肽的氨基酸序列添加氨基酸的整个长度和各自的数目。在另一个实施方案中，N联糖基化序列替换亲本多肽的一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，使用一个或多个预先存在的氨基酸将N联糖基化序列引入亲本多肽，以成为糖基化序列的部分。例如，维持亲本肽中的天冬酰胺残基，并且使紧在脯氨酸后的那些氨基酸突变，以产生本发明的N联糖基化序列。在另外一个实施方案中，采用氨基酸插入和已有氨基酸替换的组合，产生N联糖基化序列。
在特定实施方案中，本发明的特定亲本多肽与本发明的特定N联糖基化序列结合使用。示例性亲本多肽/N联糖基化序列组合概括于图6中。图6中的每行代表本发明的一个示例性实施方案。所示组合可以在本发明的所有方面使用，包括单个序列子多肽、多肽的文库、多肽缀合物和本发明的方法。本领域技术人员应当理解对于所示亲本多肽在图6中所述的实施方案可以同样地应用于本文阐述的其他亲本多肽。本领域技术人员还应当理解所列出的多肽可以以举例说明性方式与本文阐述的任何糖基化序列一起使用。
多肽的文库
用于鉴定多肽(当实施糖基化或糖缀合(例如，糖基PEG化)时，其是有效(例如，具有满意的得率)糖基化或糖缀合的(例如，糖基PEG化的))的一个策略是在亲本多肽的氨基酸序列内的各种不同位置处插入本发明的N联糖基化序列，例如包括β-片层结构域和α-螺旋结构域，并且随后就其充当寡糖基转移酶的有效底物的能力测试许多所得到的序列子多肽。
因此，在另一个方面，本发明提供了包括多个不同成员的序列子多肽的文库，其中文库的每个成员与共同的亲本多肽相对应，并且包括至少一个独立选择的本发明的外源N联糖基化序列。在一个实施方案中，文库的每个成员包括相同的N联糖基化序列，各自在亲本多肽内的不同氨基酸位置处。在另一个实施方案中，文库的每个成员包括不同的N联糖基化序列，然而，在亲本多肽的相同氨基酸位置处。与本发明的文库结合有用的N联糖基化序列在本文中描述。在一个实施方案中，在本发明的文库中有用的N联糖基化序列具有根据式(I)(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，在本发明的文库中有用的N联糖基化序列具有根据式(II)(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列。式(I)和式(II)在本文上文中描述。
在一个优选实施方案中，与本发明的文库结合有用的N联糖基化序列具有选自下述的氨基酸序列：X1NGSX4、X1NGTX4、X1NASX4、X1NATX4、X1NVSX4、X1NVTX4、X1NLSX4、X1NLTX4、X1NISX4、X1NITX4、X1NFSX4和X1NFTX4、X1D X2′NGSX4、X1DX2′NGTX4、X1DX2′NASX4、X1DX2′NATX4、X1DX2′NVSX4、X1DX2′NVTX4、X1DX2′NLSX4、X1DX2′NLTX4、X1DX2′NISX4s、X1DX2′NITX4、X1DX2′NFSX4和X1DX2′NFTX4，其中X1、X2′和X4如上定义。
在一个实施方案中，其中文库的每个成员具有共同的N联糖基化序列，亲本多肽具有包括“m”个氨基酸的氨基酸序列。在一个例子中，序列子多肽的文库包括(a)在亲本多肽内的第一个氨基酸位置(AA)n处具有N联糖基化序列的第一个序列子多肽，其中n是选自1至m的成员；和(b)至少一个另外的序列子多肽，其中在每个另外的序列子多肽中，N联糖基化序列在另外的氨基酸位置处引入，每个另外的氨基酸位置处选自(AA)n+x和(AA)n-x’其中x是选自1至(m-n)的成员。例如，第一个序列子多肽通过在第一个氨基酸位置处引入所选N联糖基化序列而产生。后续序列子多肽随后可以通过在氨基酸位置处引入相同的N联糖基化序列而产生，所述N联糖基化序列进一步朝向亲本多肽的N或C末端定位。
在这个背景中，当n-x是0(AA0)时，那么糖基化序列紧在亲本多肽的N末端氨基酸前引入。示例性序列子多肽可以具有部分序列：“NLTM1...”
第一个氨基酸位置(AA)n可以是亲本多肽的氨基酸序列内的任何地方。在一个实施方案中，选择第一个氨基酸位置处(例如，在环结构域的开始处)。
每个另外的氨基酸位置可以是亲本多肽内的任何地方。在一个例子中，序列子多肽的文库包括在选自(AA)n+p和(AA)n-p的氨基酸位置处具有N联糖基化序列的第二个序列子多肽，其中p选自1至约10、优选1至约8、更优选1至约6、更加优选1至约4且最优选1至约2。在一个实施方案中，序列子多肽的文库包括在氨基酸位置(AA)n处具有N联糖基化序列的第一个序列子多肽，和在氨基酸位置(AA)n+1或(AA)n-1处具有N联糖基化序列的第二个序列子多肽。
在另一个例子中，另外的氨基酸位置各自与先前选择的氨基酸位置紧邻。在另外一个例子中，每个另外的氨基酸位置确切地远离先前选择的氨基酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。
在亲本多肽的“给定氨基酸位置处”引入N联糖基化序列意指突变紧接着给定氨基酸位置(朝向C末端)的开始引入。引入可以通过完全插入(不替换任何已有氨基酸)或通过替换任何数目的已有氨基酸而发生。
在一个示例性实施方案中，如下产生序列子多肽的文库：通过在亲本多肽的连续氨基酸位置处引入N联糖基化序列，各自定位紧邻先前选择的氨基酸位置，从而在氨基酸链中“扫描”序列子多肽，直至达到所需的最终氨基酸位置。紧邻意指进一步朝向亲本多肽的N或C末端确切地一个氨基酸位置。例如，第一个突变体通过在氨基酸位置AAn处引入糖基化序列而产生。文库的第二个成员通过在氨基酸位置AAn+1处引入糖基化位点而产生，第三个突变体在AAn+2处，等等。这个操作已命名为“序列子扫描”。本领域技术人员应当理解序列子扫描可以涉及如此设计文库，使得第一个成员具有在氨基酸位置(AA)n处的糖基化序列，第二个成员在氨基酸位置(AA)n+2处，第三个在(AA)n+4处等。同样地，文库的成员可以通过糖基化序列的其他策略放置进行表征。例如：
A)成员1：(AA)n；成员2：(AA)n+3；成员3：(AA)n+6；成员4：(AA)n+9等。
B)成员1：(AA)n；成员2：(AA)n+4；成员3：(AA)n+8；成员4：(AA)n+12等。
C)成员1：(AA)n；成员2：(AA)n+5；成员3：(AA)n+10；成员4：(AA)n+15等。
在一个实施方案中，通过在亲本多肽的特定区域(例如从特定环区域的开始到那个环区域的结束)中扫描本发明的所选N联糖基化序列，制备序列子多肽的第一个文库。随后通过在多肽的另一个区域中扫描相同糖基化序列，制备第二个文库，“跳过”定位在第一个区域和第二个区域之间的那些氨基酸位置。省去的多肽链的部分可以例如对应于对于生物活性重要的结合结构域或已知不适合于糖基化的多肽序列的另一个区域。通过对于另外的多肽段执行“序列子扫描”，可以制备任何数目的另外文库。在一个示例性实施方案中，通过在整个多肽中扫描N联糖基化序列，在亲本多肽内的每个氨基酸位置引入突变而制备文库。
在一个实施方案中，文库的成员可以是多肽的混合物的部分。例如，用多种表达载体感染细胞培养，其中每个载体包括关于本发明的不同序列子多肽的核酸序列。在表达后，培养肉汤可以包含多个不同的序列子多肽，并且因此包括序列子多肽的文库。这种技术可以用于测定文库的哪个序列子多肽在给定表达系统中最有效地表达。
在另一个实施方案中，文库的成员彼此分离存在。例如，可以分离上述混合物的至少2个序列子多肽。经分离的多肽一起代表文库。备选地，分开表达文库的每个序列子多肽，并且任选分离序列子多肽。在另一个例子中，文库的每个成员通过化学方法进行合成并且任选进行纯化。
示例性多肽和多肽文库
示例性亲本多肽是重组人BMP-7。BMP-7作为示例性亲本多肽的选择用于举例说明性目的，并且不意欲限制本发明的范围。本领域技术人员应当理解任何亲本多肽(例如，本文阐述的那些)同样地适合于下述示例性修饰。因此获得的任何多肽变体都包括在本发明的范围内。本发明的生物活性的BMP-7变体包括部分或完整的任何BMP-7多肽，其包括不导致其生物活性基本上或完全丧失的至少一个修饰，如通过本领域技术人员已知的任何合适的功能测定法测量的。下述序列(140个氨基酸)代表全长BMP-7序列(序列S.1)的生物活性部分：
M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：10)
基于上述亲本多肽序列的示例性BMP-7变体多肽在下表3-11中列出。
在一个示例性实施方案中，将突变引入野生型BMP-7氨基酸序列S.1(SEQ ID NO：10)内，替换亲本序列中相对应数目的氨基酸，导致包含与亲本多肽相同数目的氨基酸残基的序列子多肽。例如，用N联糖基化序列“精氨酸-亮氨酸-苏氨酸”(NLT)直接置换通常在BMP-7中的3个氨基酸，并且随后朝向多肽的C末端顺次移动NLT序列，提供各自包括NLT的137个BMP-7变体。根据这个实施方案的示例性序列在下表3中列出。
表3：包括140个氨基酸的BMP-7变体的示例性文库，其中3个已有氨基酸由N联糖基化序列“NLT”替换
在位置1处的引入，替换3个已有氨基酸：
M1NLTSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：11)
在位置2处的引入，替换3个已有氨基酸：
M1SNLTKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：12)
在位置3处的引入，替换3个已有氨基酸：
M1STNLTQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：13)
通过以上述方式在整个序列中“扫描”糖基化序列，可以产生另外的BMP-7变体。因此获得的所有变体BMP-7序列在本发明的范围内。如此产生的最终序列子多肽具有下述序列：
在位置137处的引入，替换3个已有氨基酸：
M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENS S SDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACNLT(SEQ ID NO：14)
在另一个示例性实施方案中，通过给亲本序列添加一个或多个氨基酸，将N联糖基化序列引入野生型BMP-7氨基酸序列S.1(SEQ ID NO：10)内。例如，将N联糖基化序列NLT加入亲本BMP-7序列中，替换亲本序列中的2、1或0个氨基酸。在这个例子中，所加入的氨基酸残基的最大数目与所插入的糖基化序列的长度相对应。在一个示例性实施方案中，亲本序列延长确切地一个氨基酸。例如，将N联糖基化序列NLT加入亲本BMP-7肽中，替换通常存在于BMP-7中的2个氨基酸。根据这个实施方案的示例性序列在下表4中列出。
表4：包括141个氨基酸的突变型BMP-7多肽的示例性文库，其中2个已有氨基酸由N联糖基化序列“NLT”替换
在位置1处的引入，替换2个氨基酸(ST)
M1NLTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDD S SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：15)
在位置2处的引入，替换2个氨基酸(TG)
M1SNLTSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：16)
在位置3处的引入，替换2个氨基酸(GS)
M1STNLTKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENS S SDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：17)
在位置4处的引入，替换2个氨基酸(SK)
M1STGNLTQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：18)
在位置5处的引入，替换2个氨基酸(KQ)
M1STGSNLTRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：19)
通过以上述方式在整个序列中“扫描”糖基化序列直至达到下述序列，可以产生另外的BMP-7变体：
在位置138处的引入，替换2个已有氨基酸(CH)：
M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGNLT(SEQ ID NO：20)
因此获得的所有BMP-7变体在本发明的范围内。
另一个例子涉及给亲本多肽(例如，BMP-7)添加N联糖基化序列(例如，NLT)，替换亲本多肽中通常存在的1个氨基酸(双重氨基酸插入)。根据这个实施方案的示例性序列在下表5中列出。
表5：包括NLT的BMP-7突变体的示例性文库；1个已有氨基酸的替换(142个氨基酸)
在位置1处的引入，替换1个氨基酸(S)
M1NLTTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：21)
在位置2处的引入，替换1个氨基酸(T)
M1SNLTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：22)
在位置3处的引入，替换1个氨基酸(G)
M1STNLTSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：23)
在位置4处的引入，替换1个氨基酸(S)
M1STGNLTKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：24)
在位置5处的引入，替换1个氨基酸(K)
M1STGSNLTQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：25)
通过以上述方式在整个序列中“扫描”糖基化序列直至达到下述序列，可以产生另外的BMP-7变体：
在位置139处的引入，替换1个已有氨基酸(H)：
M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENS S SDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCNLT(SEQ ID NO：26)
因此获得的所有BMP-7变体在本发明的范围内。
另外一个例子涉及在亲本多肽(例如，BMP-7)内的N联糖基化序列(例如，NLT)的制备，不替换亲本多肽中通常存在的氨基酸，并且添加糖基化序列的整个长度(例如，关于NLT的三重氨基酸插入)。根据这个实施方案的示例性序列在下表6中列出。
表6：包括NLT的BMP-7变体的示例性文库；3个氨基酸的添加(143个氨基酸)
在位置1处的引入，添加3个氨基酸
M1NLTSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：27)
在位置2处的引入，添加3个氨基酸
M1SNLTTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：28)
在位置3处的引入，添加3个氨基酸
M1STNLTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：29)
在位置4处的引入，添加3个氨基酸
M1STGNLTSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：30)
通过以上述方式在整个序列中“扫描”糖基化序列直至达到最终序列，可以产生另外的BMP-7突变体：
在位置140处的引入，添加3个氨基酸
M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCHNLT(SEQ ID NO：31)
因此获得的所有BMP-7变体在本发明的范围内。
使用本发明的任何N联糖基化序列，可以产生与表3-6中的这些例子类似的BMP-7变体。所有所得到的BMP-7变体在本发明的范围内。例如，代替NLT，可以使用序列DRNLT(SEQ ID NO：32)。在一个示例性实施方案中，将DRNLT引入亲本多肽内，替换BMP-7中通常存在的5个氨基酸。根据这个实施方案的示例性序列在下表7中列出：
表7：包括DRNLT的BMP-7变体的示例性文库；5个氨基酸的替换(140个氨基酸)
M1DRNLTQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：33)
M1SDRNLTRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：34)
M1STDRNLTSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：35)
M1STGDRNLTQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：36)
通过以上述方式在整个序列中“扫描”糖基化序列直至达到最终序列，可以产生另外的BMP-7突变体：
M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRDRNLT(SEQ ID NO：37)
因此获得的所有突变型BMP-7序列在本发明的范围内。
在另一个例子中，将N联糖基化序列DRNLT加入亲本多肽(例如，BMP-7)中在亲本序列的N或C末端处或接近于亲本序列的N或C末端，给亲本多肽添加1至5个氨基酸。根据这个实施方案的示例性序列在下表8中列出。
表8：包括DRNLT的BMP-7变体的示例性文库
(141-145个氨基酸)
氨基末端突变体：
在位置1处的引入，添加5个氨基酸
M1DRNLTSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：38)
在位置1处的引入，添加4个氨基酸，替换1个氨基酸(S)
M1DRNLTTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：39)
在位置1处的引入，添加3个氨基酸，替换2个氨基酸(ST)
M1DRNLTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYV SFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：40)
在位置1处的引入，添加2个氨基酸，替换3个氨基酸(STG)
M1DRNLTSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENS S SDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：41)
在位置1处的引入，添加1个氨基酸，替换4个氨基酸(STGS)
M1DRNLTKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENS S SDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：42)
羧基末端突变体
在位置140处的引入，添加5个氨基酸
M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENS S SDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCHDRNLT(SEQ ID NO：43)
在位置139处的引入，添加4个氨基酸，替换1个氨基酸(H)
M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENS S SDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCDRNLT(SEQ ID NO：44)
在位置138处的引入，添加3个氨基酸，替换2个氨基酸(CH)
M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGDRNLT(SEQ ID NO：45)
在位置137处的引入，添加2个氨基酸，替换3个氨基酸(GCH)
M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACDRNLT(SEQ ID NO：46)
在位置136处的引入，添加1个氨基酸，替换4个氨基酸(CGCH)
M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRADRNLT(SEQ ID NO：47)
另外一个例子涉及将N联糖基化序列DFNVS(SEQ ID NO：48)插入亲本多肽(例如，BMP-7)内，给亲本多肽添加1至5个氨基酸。根据这个实施方案的示例性序列在下表9中列出。
表9：包括DFNVS的BMP-7变体的示例性文库
1个氨基酸的插入
M1DFNVSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：49)
M1SDFNVSQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：50)
M1STDFNVSRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYV SFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：51)
通过以上述方式在整个序列中“扫描”糖基化序列直至达到最终序列，可以产生另外的BMP-7突变体：
M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRADFNVS(SEQ ID NO：52)
因此获得的所有BMP-7变体在本发明的范围内。
2个氨基酸的插入
M1DFNVSSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：53)
M1SDFNVSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：54)
M1STDFNVSQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENS S SDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：55)
通过以上述方式在整个序列中“扫描”糖基化序列直至达到最终序列，可以产生另外的BMP-7变体：
M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACDFNVS(SEQ ID NO：56)
因此获得的所有BMP-7变体在本发明的范围内。
3个氨基酸的插入
M1DFNVSGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：57)
M1SDFNVSSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENS S SDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：58)
M1STDFNVSKQRS QNRSKTPKNQEALRMANVAENS S SDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：59)
通过以上述方式在整个序列中“扫描”糖基化序列直至达到最终序列，可以产生另外的BMP-7变体：
M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENS S SDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGDFNVS(SEQ ID NO：60)
因此获得的所有BMP-7变体在本发明的范围内。
4个氨基酸的插入
M1DFNVSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：61)
M1SDFNVSGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：62)
M1STDFNVS SKQRS QNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：63)
通过以上述方式在整个序列中“扫描”糖基化序列直至达到最终序列，可以产生另外的BMP-7变体：
M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCDFNVS(SEQ ID NO：64)
因此获得的所有BMP-7变体在本发明的范围内。
5个氨基酸的插入
M1DFNVSSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：65)
M1SDFNVSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENS S SDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：66)
M1STDFNVSGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDS SNVILKKYRNMVVRACGCH(SEQ ID NO：67)
通过以上述方式在整个序列中“扫描”糖基化序列直至达到最终序列，可以产生另外的BMP-7变体：
M1STGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQDWIIAPEGYAAYYCEGECAFPLNSYMNATNHAIVQTLVHFINPETVPKPCCAPTQLNAISVLYFDDSSNVILKKYRNMVVRACGCHDFNVS(SEQ ID NO：68)
因此获得的所有BMP-7变体在本发明的范围内。
在一个例子中，通过已有氨基酸的置换和/或通过插入，将N联糖基化序列(例如，NLT或NVS)放置在所选择的多肽区域内的所有可能的氨基酸位置处。根据这个实施方案的示例性序列在下表10和11中列出。
表10：包括在A73和A82之间的NLT的BMP-7变体的示例性文库
已有氨基酸的置换
---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPKP103---(SE Q IDNO：69)(亲本)
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表11：包括在I95和P103之间的NLT的BMP-7变体的示例性文库
已有氨基酸的置换
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在已有氨基酸之间的插入(添加1个氨基酸)
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在已有氨基酸之间的插入(添加1个氨基酸)
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---A73FPLNSYMNA82TNHAIVQTLVHFI95NPETVPNLT104---(SEQID NO：101)
上述置换和插入可以使用本发明的任何N联糖基化序列例如NLT和SEQ ID NO：32和48来进行。因此获得的所有BMP-7变体在本发明的范围内。
在另一个示例性实施方案中，将一个或多个N联糖基化序列(例如上文阐述的那些)插入血液凝固因子内，例如因子VII、因子VIII或因子IX多肽。如在BMP-7背景中所述，N联糖基化序列可以插入用BMP-7例示的多种基序中的任何中。例如，N联糖基化序列可以插入野生型序列内而不替换野生型序列天然的任何一个或多个氨基酸。在一个示例性实施方案中，N联糖基化序列插入在多肽的N或C末端处或接近多肽的N或C末端。在另一个示例性实施方案中，在插入N联糖基化序列前，去除野生型多肽序列天然的一个或多个氨基酸残基。在另外一个示例性实施方案中，野生型多肽序列天然的一个或多个氨基酸残基是N联糖基化序列的组分(例如，天冬酰胺)，并且N联糖基化序列包括一个或多个野生型氨基酸。一个或多个野生型氨基酸可以在N联糖基化序列的任一末端处或N联糖基化序列的内部。
此外，任何预先存在的N联或O联糖基化序列可以替换为本发明的N联糖基化序列。此外，N联糖基化序列可以插入邻近一个或多个O联糖基化序列。在一个实施方案中，N联糖基化序列的存在阻止O联糖基化序列的糖基化。
在一个代表性例子中，亲本多肽是因子VIII。在这个实施方案中，N联糖基化序列可以插入根据上文阐述的任何基序的A、B或C结构域内。超过一个N联糖基化序列可以插入单个结构域或超过一个结构域内；再次，根据上文的任何基序。例如，N联糖基化序列可以插入A、B和C结构域、A和C结构域、A和B结构域或B和C结构域各自内。备选地，N联糖基化序列可以侧接A和B结构域或B和C结构域。关于因子VIII的示例性氨基酸序列在图2中提供。
在另一个示例性实施方案中，因子VIII多肽是B结构域缺失(BDD)的因子VIII多肽。在这个实施方案中，N联糖基化序列可以插入使因子VIII异二聚体的80Kd和90Kd亚单位连接的肽连接体内。备选地，N联糖基化序列可以侧接A结构域和连接体或C结构域和连接体。如上文在BMP-7背景中所述，N联糖基化序列可以插入而不替换已有氨基酸，或可以插入而替换亲本多肽的一个或多个氨基酸。关于B结构域缺失(BDD)的因子VIII的示例性序列在图3中提供。
其他B结构域缺失的因子VIII多肽也适合于与本发明一起使用，包括例如Sandberg等人，Seminars in Hematology 38(2)：4-12(2000)中公开的B结构域缺失的因子VIII多肽，其公开内容通过引用合并入本文。
如对于本领域技术人员显而易见的，包括本发明的超过一个突变型N联糖基化序列的多肽也在本发明的范围内。可以引入另外的突变，以允许调节多肽性质，例如生物活性、代谢活性(例如，减少的蛋白水解)、药代动力学等。
制备多种变体后，它们可以就其充当用于N联糖基化或糖基PEG化的底物的能力进行评估。成功的糖基化和/或糖基PEG化可以使用本领域已知的方法进行检测且定量，所述方法例如质谱法(例如，MALDI-TOF或Q-TOF)、凝胶电泳(例如，与光密度法相组合)或色谱分析(例如，HPLC)。生物测定法例如酶抑制测定法、受体结合测定法和/或基于细胞的测定法可以用于分析给定多肽或多肽缀合物的生物活性。评估策略在本文下文中更详细地描述(参见例如，“引导多肽的鉴定”)。选择和/或开发用于每种多肽的化学和生物评估的合适测定法系统在本领域技术人员的能力内。
多肽缀合物
在另一个方面，本发明提供了在多肽(例如，序列子多肽)和所选择的修饰基团(例如，聚合修饰基团)之间的共价缀合物，其中修饰基团经由糖基连接基团(例如，完整的糖基连接基团)与多肽缀合。糖基连接基团插入多肽和修饰基团之间，并且与多肽和修饰基团连接。在制备目前的多肽缀合物中有用的示例性方法在本文中阐述。其他有用的方法在美国专利号5,876,980；6,030,815；5,728,554；和5,922,577，以及WO 98/31826；WO2003/031464；WO2005/070138；WO2004/99231；WO2004/10327；WO2006/074279；和美国专利申请公开2003180835中阐述，所有所述专利为了所有目的通过引用合并入本文。
本发明的缀合物将一般对应于一般结构：
其中符号a、b、c、d和s代表非零的正整数；并且t是0或正整数。“修饰基团”可以是治疗试剂、生物活性试剂(例如，毒素)、可检测标记、聚合物(例如，水溶性聚合物)等。连接体可以是下文广泛多样的连接基团中的任何。备选地，连接体可以是单键。多肽的特性并无限制。
示例性多肽缀合物包括N联GlcNAc或GlcNH残基，其通过寡糖基转移酶的作用与N联糖基化序列结合。在一个实施方案中，GlcNAc或GlcNH其自身用修饰基团进行衍生，并且代表糖基连接基团。在另一个实施方案中，另外的糖基残基与GlcNAc部分结合。例如，另一个GlcNAc、Gal或Gal-Sia部分(其各自可以用修饰基团进行修饰)与GlcNAc部分结合。在代表性实施方案中，N联糖基残基是GlcNAc-X＊、GlcNH-X＊、GlcNAc-GlcNAc-X＊、GlcNAc-GlcNH-X＊、GlcNAc-Gal-X＊、GlcNAc-Gal-Sia-X＊、GlcNAc-GlcNAc-Gal-Sia-X＊，其中X＊是修饰基团(例如，水溶性聚合修饰基团)。
在一个实施方案中，本发明提供了在其置换模式中高度同质的多肽缀合物。使用本发明的方法，可以形成多肽缀合物，其中在本发明的缀合物群体中基本上所有经修饰的糖部分与结构上等同的氨基酸或糖基残基附着。因此，在一个示例性实施方案中，本发明提供了包括至少一个修饰基团(例如，水溶性聚合修饰基团)的多肽缀合物，所述修饰基团通过糖基连接基团与N联糖基化序列内的氨基酸残基(例如，天冬酰胺)共价结合。在一个例子中，具有与之附着的糖基连接基团的每个氨基酸残基具有相同结构。在另一个示例性实施方案中，修饰基团(例如，水溶性聚合修饰基团)群体的基本上每个成员经由糖基连接基团与多肽的糖基残基结合，并且糖基连接基团与之附着的多肽的每个糖基残基具有相同结构。
在一个方面，本发明提供了多肽和修饰基团(例如，聚合修饰基团)之间的共价缀合物，其中多肽包括本发明的外源N联糖基化序列。一般地，N联糖基化序列包括天冬酰胺(N)残基。聚合修饰基团经由糖基连接基团在N联糖基化序列的天冬酰胺残基处与多肽共价缀合，所述糖基连接基团插入多肽和聚合修饰基团之间，并且与多肽和聚合修饰基团共价连接。糖基连接基团可以是单糖或寡糖。示例性N联糖基化序列在本文中描述，并且可以具有根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的结构。示例性聚合修饰基团例如水溶性聚合修饰基团(例如，PEG或m-PEG)也在本文中描述。
在一个方面，本发明提供了包括具有N联糖基化序列(例如，外源N联糖基化序列)的序列子多肽的共价缀合物。在一个实施方案中，多肽缀合物包括根据式(III)的部分：
在式(III)中，w是选自0至20的整数。在一个实施方案中，w选自0至8。在另一个实施方案中，w选自0至4。在另外一个实施方案中，w选自0至1。在一个具体例子中，w是1。当w是0时，那么(X＊)w由H替换。X＊是修饰基团(例如，线性或分支聚合修饰基团)。在一个例子中，X＊包括使修饰基团与Z＊连接的连接体部分。在另一个例子中，X＊是-La-R6c或-La-R6b。AA-NH-是衍生自N联糖基化序列内的氨基酸的部分，所述氨基酸具有包括氨基的侧链(例如，天冬酰胺)。在一个实施方案中，整数q是0，并且氨基酸是N末端或C末端氨基酸。在另一个实施方案中，q是1，并且氨基酸是内部氨基酸。
在式(III)中，Z＊是选自单糖和寡糖的糖基部分。Z＊可以是糖基模拟部分。当w是1或更大时，那么Z＊是糖基连接基团。在一个实施方案中，Z＊是天然存在的N联聚糖，例如三甘露糖基核心部分[GlcNAc-GlcNAc-Man(Man)2]，其任选由岩藻糖残基置换。在一个实施方案中，Z＊是单触角聚糖。在另一个实施方案中，Z＊是二触角聚糖。在另外一个实施方案中，Z＊是三触角聚糖。在一个进一步的实施方案中，Z＊是四触角聚糖。Z＊聚糖的每个触角可以与独立地选择的修饰基团共价连接。例如，Z＊的每个末端糖部分可以与修饰基团共价连接。
在一个实施方案中，部分-Z＊-(X＊)w由下式表示，其包括单、二、三和四触角聚糖：
其中整数t、a’、b’、c’、d’、e’、f’、g’、h’、j’、k’、l’、m’、n’、o’、p’、q’和r’是独立地选自0和1的整数。在一个优选实施方案中，t是0。
任选与修饰基团结合的示例性N联聚糖在下文概述：
其中每个Q是独立地选自H、单个负电荷和阳离子(例如，Na+)的成员；并且每个Xa是独立地选自H、烷基、酰基(例如，乙酰基)和修饰基团(X＊)的成员。在一个示例性实施方案中，本发明的N联聚糖包括至少一个修饰基团(至少一个Xa是X＊)。另外的N联聚糖公开于2002年10月9日提交的WO03/31464和2004年4月9日提交的WO04/99231中，所述专利的公开内容为了所有目的通过引用合并入本文。
在一个示例性实施方案中，式(III)中的Z＊包括GlcNAc部分。在另一个示例性实施方案中，Z＊包括GlcNH部分。在另外一个实施方案中，Z＊包括GlcNAc-或GlcNH模拟部分。在一个进一步的实施方案中，Z＊包括bacillosamine(即、2，4-二乙酰胺基-2，4，6-三脱氧葡萄糖)部分或其衍生物。在另一个实施方案中，Z＊选自GlcNAc、GlcNH、Gal、Man、Glc、GalNAc、GalNH、Sia、Fuc、Xyl和这些部分的组合。在另外一个实施方案中，Z＊是GlcNAc、Man和Glc部分的组合。在一个进一步的实施方案中，Z＊是GlcNAc、Man、Gal和Sia部分的组合。在一个进一步的实施方案中，Z＊是bacillosamine、GalNAc和Glc部分的组合。在一个实施方案中，Z＊是GlcNAc部分。在另一个实施方案中，Z＊是GlcNH部分。在另一个实施方案中，Z＊是Man部分。在另外一个实施方案中，Z＊是Sia部分。在另一个实施方案中，Z＊是Glc部分。在另一个实施方案中，Z＊是Gal部分。在另一个实施方案中，Z＊是GalNAc部分。在另一个实施方案中，Z＊是GalNH部分。在另一个实施方案中，Z＊是Fuc部分。在另外一个实施方案中，Z＊是GlcNAc-GlcNAc、GlcNH-GlcNAc、GlcNAc-GlcNH或GlcNH-GlcNH部分。在一个实施方案中，Z＊是GlcNAc-Gal或GlcNH-Gal部分。在另一个实施方案中，Z＊是GlcNAc-GlcNAc-Gal、GlcNH-GlcNAc-Gal、GlcNAc-GlcNH-Gal或GlcNH-GlcNH-Gal部分。在另一个实施方案中，Z＊是GlcNAc-Gal-Sia部分。在另一个实施方案中，Z＊是GlcNAc-GlcNAc-Gal-Sia、GlcNH-GlcNAc-Gal-Sia 、GlcNAc-GlcNH-Gal-Sia 或GlcNH-GlcNH-Gal-Sia部分。在另一个实施方案中，Z＊是GlcNAc-GlcNAc-Man部分。
在一个实施方案中，本发明的多肽缀合物包括具有N联糖基化序列的多肽，所述N联糖基化序列具有天冬酰胺残基。在根据这个实施方案的一个例子中，多肽缀合物包括具有根据式(IV)的结构的部分：
在式(IV)中，w、X＊和Z＊如上文对于式(III)定义。
糖基连接基团
当插入多肽和修饰基团之间时，经修饰的糖的糖组分变成“糖基连接基团”。在一个示例性实施方案中，糖基连接基团衍生自经修饰的单糖或寡糖供体分子(例如，经修饰的多萜醇-焦磷酸盐糖)，其是合适的寡糖基转移酶的底物。在另一个示例性实施方案中，糖基连接基团包括糖基模拟部分。本发明的多肽缀合物可以包括其为单价或多价(例如，触角结构)的糖基连接基团。因此，本发明的缀合物包括其中修饰基团经由单价糖基连接基团与多肽附着的种类。在本发明内还包括的是其中超过一个修饰基团经由多触角糖基连接连接基团与多肽附着的缀合物。
在一个示例性实施方案中，式(III)或(IV)中的部分-Z＊-(X＊)w包括根据式(V)的部分：
在一个实施方案中，在式(V)中，E是O。在另一个实施方案中，E是S。在另外一个实施方案中，E是NR27或CHR28，其中R27和R28是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、和取代或未取代的杂环烷基的成员。在一个实施方案中，E1是O。在另一个实施方案中，E1是S。在另一个实施方案中，E1是NR27(例如，NH)。在另一个实施方案中，E1是与多肽的氨基酸残基的键。
在一个实施方案中，在式(V)中，R2是H。在另一个实施方案中，R2是-R1。在另外一个实施方案中，R2是-CH2R1。在一个进一步的实施方案中，R2是-C(X1)R1。在这些实施方案中，R1选自OR9、SR9、NR10R11、取代或未取代的烷基、和取代或未取代的杂烷基，其中R9是选自H、金属离子、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和酰基的成员。R10和R11是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和酰基的成员。在一个实施方案中，X1是O。在另一个实施方案中，X1是选自取代或未取代的烯基、S和NR8的成员，其中R8是选自H、OH、取代或未取代的烷基、和取代或未取代的杂烷基的成员。在一个具体例子中，R2是COOQ，其中Q是H、单个负电荷或盐抗衡离子(阳离子)。
在一个实施方案中，在式(V)中，Y是CH2。在另一个实施方案中，Y是CH(OH)CH2。在另外一个实施方案中，Y是CH(OH)CH(OH)CH2。在一个进一步的实施方案中，Y是CH。在一个实施方案中，Y是CH(OH)CH。在另一个实施方案中，Y是CH(OH)CH(OH)CH。在另外一个实施方案中，Y是CH(OH)。在一个进一步的实施方案中，Y是CH(OH)CH(OH)。在一个实施方案中，Y 是CH(OH)CH(OH)CH(OH)。Y2是选自H、OR6、R6、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基的成员，
其中R6和R7是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和-La-R6b的成员。在一个例子中，-La-R6b包括C(O)R6b、C(O)-Lb-R6b、C(O)NH-Lb-R6b或NHC(O)-Lb-R6b。R6b是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和修饰基团的成员，所述修饰基团例如本发明的线性或分支聚合修饰基团。
在式(V)中，R3、R3′和R4是独立地选自H、NHR3”、OR3″、SR3″、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基和-La-R6c的成员。在一个例子中，-La-R6c包括-O-Lb-R6c、-C(O)-Lb-R6c、-C(O)NH-Lb-R6c、-NH-Lb-R6c、＝N-Lb-R6c、-NHC(O)-Lb-R6c、-NHC(O)NH-Lb-R6c或-NHC(O)O-Lb-R6c，其中每个R3″是独立地选自H、取代或未取代的烷基、和取代或未取代的杂烷基的成员。每个R6c是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、NR13R14和修饰基团的成员，其中R13和R14是独立地选自H、取代或未取代的烷基、和取代或未取代的杂烷基的成员。
在上述实施方案中，每个La和每个Lb是独立地选自键和连接体部分的成员，所述连接体部分选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代和未取代的杂环烷基。
在一个实施方案中，式(V)的部分具有根据式(VI)的结构：
其中E1、R3′、R3″和R4如上定义。在一个实施方案中，在式(VI)中，E1是O。在另一个实施方案中，E1是NH。在另一个实施方案中，在式(VI)中，-OR3″是OH。在另外一个示例性实施方案中，R3′是NHAc或OH。
在一个实施方案中，式(VI)的部分与多肽的氨基酸残基直接结合。在根据这个实施方案的一个例子中，E1是与氨基酸残基的键，并且式(VI)的部分具有其为选自下述的成员的结构：
在另一个实施方案中，式(VI)的部分通过另一个糖残基与多肽结合。在一个示例性实施方案中，式(VI)的部分具有选自下述的结构：
在一个例子中，根据上述实施方案中的任何，R3′和R4是独立地选自NHAc和OH的成员。
在根据上述实施方案的一个例子中，式(V)或(VI)的部分是GlcNAc部分。在一个例子中，部分具有选自下述的结构：
在另一个实施方案中，式(V)的部分具有根据式(VII)的结构：
其中Y2、R1、E1、R3″和R4如上定义。在一个实施方案中，在式(VII)中，E1是O。在另一个实施方案中，E1是NH。在另一个实施方案中，E1是与多肽的氨基酸残基的键。在一个实施方案中，在式(VII)中，R1是OR9。在根据这个实施方案的一个例子中，R9是H、负电荷或盐抗衡离子(阳离子)。在另一个实施方案中，在式(VII)中，R3”是H。
在另一个实施方案中，式(VII)的部分具有其为选自下述的成员的结构：
其中是R9是H、单个负电荷或盐抗衡离子。在一个例子中，R4是选自OH和NHAc的成员。
在一个例子中，根据上述实施方案中的任何(例如，在式V、VI或式VII中)，-La-R6c包括其为选自下述的成员的部分：
其中r是选自1至20的整数，并且f和e是独立地选自1-5000的整数。R1和R2是独立地选自H和C1-C10取代或未取代的烷基的成员。在一个例子中，R1和R2是独立地选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基和异丁基的成员。在一个实施方案中，R1和R2各自是甲基。
在根据上述实施方案中的任何的另一个例子中，-La-R6c或-La-R6c是：
在根据上述实施方案的另一个例子中(例如，在式V、VI或式VII中)，-La-R6c或-La-R6c是
其中r是选自1至20的整数，并且f和e是独立地选自1-5000的整数。R1和R2是独立地选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基和异丁基的成员。在一个实施方案中，R1和R2各自是甲基。用“＊”指示的立体中心可以是外消旋的或限定的。在一个实施方案中，立体中心具有(S)构型。在另一个实施方案中，立体中心具有(R)构型。
在根据上述实施方案中的任何的另外一个例子中(例如，在式V、VI或式VII中)，-La-R6c或-La-R6c是
其中e、f、R1和R2如上定义。
在根据上述实施方案中的任何的一个进一步例子中(例如，在式V、VI或式VII中)，-La-R6c或-La-R6c是
其中e、f、R1和R2如上定义。
在另外一个实施方案中，R6b(例如，在式V中)或R6c(例如，在式V至VII中)中的至少一个是选自下述的成员：
其中g、j和k是独立地选自0至20的整数。每个e是独立地选自0至2500的整数。整数s选自1-5。R16和R17是独立地选择的聚合部分。G1和G2是使聚合部分R16和R17与C连接的独立地选择的连接片段。示例性连接片段不包括芳香族部分也不包括酯部分。备选地，这些连接片段可以包括这样的一个或多个部分，其设计为在生理学相关条件下降解，例如酯、二硫化物等。
示例性连接片段包括G1和G2是独立地选择的，并且包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O和OC(O)NH、CH2S、CH2O、CH2CH2O、CH2CH2S、(CH2)oO、(CH2)oS或(CH2)oY’-PEG，其中Y’是S、NH、NHC(O)、C(O)NH、NHC(O)O、OC(O)NH或O，并且o是1至50的整数。在一个示例性实施方案中，连接片段G1和G2是不同的连接片段。
G3是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基的成员。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、-NA12A13、-OA12和-SiA12A13的成员，其中A12和A13是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基的成员。
修饰基团
本发明的修饰基团可以是任何化学基团。示例性修饰基团在下文讨论。修饰基团可以就其改变给定多肽的性质(例如，生物或理化性质)的能力进行选择。可以通过使用修饰基团而改变的示例性多肽性质包括但不限于，药代动力学、药效学、代谢稳定性、生物分布、水溶性、亲油性、组织靶向能力和治疗活性谱。优选的修饰基团是改善本发明的多肽缀合物的药效学和药代动力学的那些，所述本发明的多肽缀合物已用此类修饰基团进行修饰。其他修饰基团可以用于修饰多肽，所述多肽在体外生物测定法系统包括诊断产物中发现应用。
例如，治疗性糖肽的体内半衰期可以用聚乙二醇(PEG)部分得到增强。多肽用PEG的化学修饰(PEG化)增加其分子大小，并且一般减少表面和官能团易接近性，其各自依赖于与多肽附着的PEG部分的数目和大小。通常，这种修饰导致血浆半衰期和蛋白水解稳定性的改善，以及免疫原性和肝摄取中的减少(Chaffee等人J.Clin.Invest.89：1643-1651(1992)；Pyatak等人Res.Commun.Chem.Pathol Pharmacol.29：113-127(1980))。例如，已报告白介素-2的PEG化增加其在体内的抗肿瘤效力(Katre等人Proc.Natl.Acad.Sci. USA.84：1487-1491(1987))，并且衍生自单克隆抗体A7的F(ab’)2的PEG化已改善其肿瘤定位(Kitamura等人Biochem.Biophys.Res.Commun.28：1387-1394(1990))。因此，在另一个实施方案中，相对于未经衍生的亲本多肽的体内半衰期，通过本发明的方法用PEG部分衍生的多肽的体内半衰期增加。
多肽体内半衰期中的增加最佳表示为相对于亲本多肽的增加百分比范围。增加百分比范围的下限是约40％、约60％、约80％、约100％、约150％或约200％。范围的上限是约60％、约80％、约100％、约150％、或超过约250％。
水溶性聚合修饰基团
在一个实施方案中，修饰基团是选自线性和分支的聚合修饰基团。在一个例子中，修饰基团包括一个或多个聚合部分，其中每个聚合部分独立地选择。
许多水溶性聚合物是本领域技术人员已知的，并且在实践本发明中有用。术语水溶性聚合物包括种类例如糖(例如，右旋糖酐、直链淀粉、透明质酸、聚(唾液酸)、类肝素、肝素等)；聚(氨基酸)，例如聚(天冬氨酸)和聚(谷氨酸)；核酸；合成聚合物(例如，聚(丙烯酸)、聚(醚)，例如聚(乙二醇)；肽、蛋白质等。本发明可以用任何水溶性聚合物进行实践，唯一限制是聚合物必须包括缀合物的其余部分可以在其上附着的点。
修饰基团的反应衍生物(例如，反应PEG类似物)使修饰基团与一个或多个多肽部分附着的使用在本发明的范围内。本发明不受反应类似物的特性限制。
在一个优选实施方案中，修饰基团是PEG或PEG类似物。聚(乙二醇)的许多活化衍生物是商购可得的，并且在文献中描述。选择或需要时合成合适的活化PEG衍生物在本领域技术人员的能力内，用所述合适的活化PEG衍生物制备在本发明中有用的底物。参见，Abuchowski等人Cancer Biochem.Biophys.，7：175-186(1984)；Abuchowski等人，J.Biol.Chem.，252：3582-3586(1977)；Jackson等人，Anal.Biochem.，165：114-127(1987)；Koide等人，Biochem Biophys.Res.Commun.，111：659-667(1983))、tresylate(Nilsson等人，Methods Enzymol.，104：56-69(1984)；Delgado等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，12：119-128(1990))；N-琥珀酰亚胺衍生的活性酯(Buckmann等人，Makromol.Chem.，182：1379-1384(1981)；Joppich等人，Makromol.Chem.，180：1381-1384(1979)；Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.，7：175-186(1984)；Katre等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，84：1487-1491(1987)；Kitamura等人，Cancer Res.，51：4310-4315(1991)；Boccu等人，Z. Naturforsch.，38C：94-99(1983)、碳酸酯(Zalipsky等人，POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMISTRY：BIOTECHNICALAND BIOMEDICAL APPLICATIONS，Harris，编辑，Plenum Press，NewYork，1992，第347-370页；Zalipsky等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，15：100-114(1992)；Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11：141-152(1985))、咪唑甲酸盐(Beauchamp等人，Anal.Biochem.，131：25-33(1983)；Berger等人，Blood，71：1641-1647(1988))、4-二硫代吡啶(Woghiren等人，Bioconjugate Chem.，4：314-318(1993))、异氰酸酯(Byun等人，ASAIO Journal，M649-M-653(1992))和环氧化物(授予Noishiki等人，(1989)的美国专利号4,806,595。其他连接基团包括氨基和活化PEG之间的氨基甲酸乙酯连接。参见，Veronese，等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，11：141-152(1985)。
用于活化聚合物的方法可以在WO 94/17039、美国专利号5,324,844、WO 94/18247、WO 94/04193、美国专利号5,219,564、美国专利号5,122,614、WO 90/13540、美国专利号5,281,698和WO 93/15189中找到，并且对于活化聚合物和肽之间的缀合，例如凝固因子因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、氧携带分子(美国专利号4,412,989)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese at al.(疑为et al.，等人)，App.Biochem.Biotech.11：141-45(1985))。
在本发明中有用的活化PEG分子和制备这些试剂的方法是本领域已知的，并且在例如WO04/083259中描述。
对于活化在制备本文所述化合物中使用的线性PEG合适的活化或离去基团包括但不限于下述种类：
示例性水溶性聚合物是其中聚合物样品中基本比例的聚合物分子具有大约相同的分子量的那些；此类聚合物是“均匀分散的”。
本发明通过提及聚(乙二醇)缀合物进一步举例说明。关于PEG官能化和缀合的几个综述和专题论文是可获得的。参见例如，Harris，Macronol. Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten，Methods inEnzymology 135：30-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14：866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems 9：249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Ch em.6：150-165(1995)；和Bhadra，等人，Pharmazie，57：5-29(2002)。使用反应分子用于制备反应性PEG分子且形成缀合物的途径是本领域已知的。例如，美国专利号5,672,662公开了聚合物酸的活性酯的水溶性和可分离的缀合物，所述聚合物酸选自线性或分支聚环氧烷、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯属醇)和聚(丙烯吗啉(acrylomorpholine))。
美国专利号6,376,604阐述了通过在有机溶剂中使聚合物的末端羟基与二(1-苯并三唑)碳酸酯反应，用于制备水溶性和非肽聚合物的水溶性1-苯并三唑碳酸酯的方法。活性酯用于形成与生物活性试剂例如多肽的缀合物。
WO 99/45964描述了包括生物活性试剂和活化的水溶性聚合物的缀合物，所述活化的水溶性聚合物包括具有通过稳定连接与聚合物主链连接的至少一个末端的聚合物主链，其中至少一个末端包括具有与分支部分连接的近端反应基团的分支部分，其中生物活性试剂与近端反应基团中的至少一个连接。其他分支聚(乙二醇)在WO 96/21469中描述，美国专利号5,932,462描述了与分支PEG分子形成的缀合物，所述分支PEG分子包括包含反应性官能团的分支末端。游离反应基团可用于与生物活性种类例如多肽反应，形成聚(乙二醇)和生物活性种类之间的缀合物。美国专利号5,446,090描述了双功能PEG连接体，及其在形成在每个PEG连接体末端处具有肽的缀合物中的用途。
包括可降解PEG连接的缀合物在WO 99/34833；和WO 99/14259，以及美国专利号6,348,558中描述。此类可降解连接可应用于本发明中。
上文所述的聚合物活化的领域公认方法在本发明的背景中用于形成本文所述的分支聚合物，以及用于这些分支聚合物与其他种类例如糖、糖核苷酸等的缀合。
示例性水溶性聚合物是聚(乙二醇)，例如PEG或甲氧基-PEG(m-PEG)。在本发明中使用的聚(乙二醇)不限制于任何具体形式或分子量范围。对于每个独立地选择的聚(乙二醇)部分，分子量优选为约500Da至约100kDa。在一个实施方案中，PEG部分的分子量为约2至约80kDa。在另一个实施方案中，PEG部分的分子量为约2至约60kDa，优选约5至约40kDa。在一个示例性实施方案中，PEG部分具有约1kDa、约2kDa、约5kDa、约10kDa、约15kDa、约20kDa、约25kDa、约30kDa、约35kDa、约40kDa、约45kDa、约50kDa、约55kDa、约60kDa、约65kDa、约70kDa、约75kDa或约80kDa的分子量。
在本发明中使用的示例性聚(乙二醇)分子包括但不限于具有下式的那些：
其中R8是H、OH、NH2、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的杂烷基，例如乙缩醛、OHC-、H2N-(CH2)q-、HS-(CH2)q或-(CH2)qC(Y)Z1。指数“e”代表1至2500的整数。指数b、d和q独立地代表0至20的整数。符号Z和Z1独立地代表OH、NH2、离去基团，例如咪唑、对硝基苯基、HOBT、四唑、卤化物、S-R9、活化酯的醇部分；-(CH2)pC(Y1)V或-(CH2)pU(CH2)sC(Y1)v。符号Y代表H(2)、＝O、＝S、＝N-R10。符号X、Y、Y1、A1和U独立地代表部分O、S、N-R11。符号V代表OH、NH2、卤素、S-R12、活化酯的醇组分、活化酰胺的胺组分、糖-核苷酸和蛋白质。指数p、q、s和v是独立地选自0至20的整数的成员。符号R9、R10、R11和R12独立地代表H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环烷基、和取代或未取代的杂芳基。
在形成本发明的缀合物中有用的聚(乙二醇)是线性的分支的。适合于在本发明中使用的分支聚(乙二醇)分子包括但不限于，由下式描述的那些：
其中R8和R8′是独立地选自上文对于R8定义的基团的成员。A1和A2是独立地选自上文对于A1定义的基团的成员。指数e、f、o和q如上定义。Z和Y如上定义。X1和X1′是独立地选自S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、OC(O)NH的成员。
在其他示例性实施方案中，分支PEG基于半胱氨酸、丝氨酸或二赖氨酸核心。在另一个示例性实施方案中，聚(乙二醇)分子选自下述结构：
在一个进一步的实施方案中，聚(乙二醇)是具有超过一个附着的PEG部分的分支PEG。分支PEG的例子在美国专利号5,932,462；美国专利号5,342,940；美国专利号5,643,575；美国专利号5,919,455；美国专利号6,113,906；美国专利号5,183,660；WO 02/09766；Kodera Y.，Bioconjugate Chemistry 5：283-288(1994)；和Yamasaki等人，Agric.Biol. Chem.，52：2125-2127，1998中描述。在一个优选实施方案中，分支PEG的每个聚(乙二醇)的分子量小于或等于40,000道尔顿。
代表性聚合修饰基团包括基于含侧链的氨基酸(例如丝氨酸、半胱氨酸、赖氨酸)和小肽例如lys-lys的结构。示例性结构包括：
技术人员应当理解在二赖氨酸结构的游离胺也可以通过与PEG部分的酰胺或氨基甲酸乙酯键进行聚乙二醇化。
在另外一个实施方案中，聚合修饰基团是基于三赖氨酸肽的分支PEG部分。三赖氨酸可以是单、二、三或四PEG化的。根据这个实施方案的示例性种类具有下式：
其中指数e、f和f’是独立地选自1至2500的整数；并且指数q、q’和q”是独立地选自1至20的整数。
如对于技术人员显而易见的，在本发明中使用的分支聚合物包括关于上文所述方案的变异。例如，上文显示的二赖氨酸-PEG缀合物可以包括3个聚合亚单位，第三个与α-胺键合，如上文结构中未经修饰显示的。类似地，用3个或4个聚合亚单位官能化的三赖氨酸的使用在本发明的范围内，所述聚合亚单位以所需方式用聚合修饰基团标记。
用于形成具有分支修饰基团(其包括一个或多个聚合部分(例如，PEG))的多肽缀合物的示例性前体具有下式：
在一个实施方案中，根据这个式的分支聚合物种类是基本上纯的水溶性聚合物。X3′是包括可电离(例如，OH、COOH、H2PO4、HSO3、NH2及其盐等)或其他反应性官能团例如上文的部分。C是碳。G3是非反应基团(例如，H、CH3、OH等)。在一个实施方案中，G3优选不是聚合部分。R16和R17独立地选自非反应基团(例如，H、未取代的烷基、未取代的杂烷基)和聚合臂(例如，PEG)。G1和G2是优选在生理条件下基本上非反应的连接片段。G1和G2是独立地选择的。示例性连接体不包括芳香族也不包括酯部分。备选地，这些连接可以包括这样的一个或多个部分，其设计为在生理学相关条件下降解，例如酯、二硫化物等。G1和G2使聚合臂R16和R17与C连接。在一个实施方案中，当X3′与连接体、糖或连接体-糖盒上的互补反应性的反应性官能团反应时，X3′转变成连接片段的组分。
示例性连接片段包括G1和G2独立地选择，并且包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O和OC(O)NH、CH2S、CH2O、CH2CH2O、CH2CH2S、(CH2)oO、(CH2)oS或(CH2)oY’-PEG，其中Y’是S、NH、NHC(O)、C(O)NH、NHC(O)O、OC(O)NH或O，并且o是1至50的整数。在一个示例性实施方案中，连接片段G1和G2是不同的连接片段。
在一个示例性实施方案中，上述前体或其活化的衍生物之一，通过X3′和糖部分上的互补反应性基团例如胺之间的反应，与糖、活化糖或糖核苷酸反应且从而与之结合。备选地，X3′根据下文方案2与关于连接体La的前体上的反应性官能团反应。
方案2：
在一个示例性实施方案中，修饰基团衍生自天然或非天然的氨基酸、氨基酸类似物或氨基酸模拟物、或由一个或多个此类种类形成的小肽。例如，在本发明的化合物中发现的特定分支聚合物具有下式：
在这个例子中，通过分支聚合修饰基团的前体上的反应性官能团例如X3′和糖部分上的反应性官能团或前体与连接体的反应，形成连接片段C(O)La。例如，当X3′是羧酸时，它可以是活化的并且与从氨基-糖(例如，Sia，GalNH2，GlcNH2，ManNH2等)悬垂的胺基直接结合，形成酰胺。另外的示例性反应性官能团和活化的前体在下文描述。符号具有与上文讨论的那些相同的特性。
在另一个示例性实施方案中，La是具有下述结构的连接部分：
其中Xa和Xb是独立地性选择的连接片段，并且L1选自键、取代或未取代的烷基、或者取代或未取代的杂烷基。
关于Xa和Xb的示例性种类包括S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、C(O)NH和NHC(O)O和OC(O)NH。
在另一个示例性实施方案中，G2是与R17键合的肽，所述R17为氨基酸、二肽(例如，Lys-Lys)或三肽(例如，Lys-Lys-Lys)，其中一个或多个α-胺部分和/或一个或多个侧链杂原子用聚合修饰基团进行修饰。
上文所述的本发明的实施方案通过提及这样的种类进行进一步例示，其中聚合物是水溶性聚合物，特别是聚(乙二醇)(“PEG”)，例如甲氧基-聚(乙二醇)。本领域技术人员应当理解在下文部分中的焦点为了举例说明起见，并且使用PEG作为示例性聚合物阐述的多种基序可同样地应用于其中利用除PEG外的聚合物的种类。
在其他示例性实施方案中，多肽缀合物包括选自下述的部分：
在上式各自中，指数e和f是独立地选自1至2500的整数。在一个进一步的示例性实施方案中，选择e和f，以提供其为约1kDa、2kDa、5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、55kDa、60kDa、65kDa、70kDa、75kDa和80kDa的PEG部分。符号Q代表取代或未取代的烷基(例如C1-C6烷基，例如甲基)、取代或未取代的杂烷基或H。
其他分支聚合物具有基于二赖氨酸(Lys-Lys)肽的结构，例如：
和基于三赖氨酸(Lys-Lys-Lys)肽的结构，例如：
在上图各自中，指数e、f、f’和f”代表独立地选自1至2500的整数。指数q、q’和q”代表独立地选自1至20的整数。
在另一个示例性实施方案中，本发明的缀合物包括其为选自下述的成员的式：
其中Q是选自H和取代或未取代的C1-C6烷基的成员。指数e和f是独立地选自1至2500的整数，并且指数q是选自0至20的整数。
在另一个示例性实施方案中，本发明的缀合物包括其为选自下述的成员的式：
其中Q是选自H和取代或未取代的C1-C6烷基的成员，优选Me。指数e、f和f’是独立地选自0至2500的整数，并且指数q和q’是独立地选自1至20的整数。
在另一个示例性实施方案中，本发明的缀合物包括根据下式的结构：
其中指数e和f独立地选自1至2500。指数j和k是独立地选自0至20的整数。A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10和A11是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的杂芳基、-NA12A13、-OA12和-SiA12A13的成员。A12和A13是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、和取代或未取代的杂芳基的成员。
在根据上式的一个实施方案中，分支聚合物具有根据下式的结构：
在一个示例性实施方案中，A1和A2是独立地选自OCH3和OH的成员。
在另一个示例性实施方案中，连接体La是选自氨基甘氨酸衍生物的成员。根据这个实施方案的示例性聚合修饰基团具有根据下式的结构：
在一个例子中，A1和A2是独立地选自OCH3和OH的成员。根据这个例子的示例性聚合修饰基团包括：
在上述实施方案各自中，其中修饰基团包括立体中心，例如包括氨基酸连接体或基于甘油的连接体的那些，立体中心可以是外消旋的或限定的。在一个实施方案中，其中此类立体中心是限定的，它具有(S)构型。在另一个实施方案中，立体中心具有(R)构型。
本领域技术人员应当理解分支聚合物的一个或多个m-PEG臂可以由具有不同末端的PEG部分替换，所述末端例如OH、COOH、NH2、C2-C10-烷基等。此外，上文结构通过将烷基接头插入侧链的α-碳原子和官能团之间(或去除碳原子)容易地进行修饰。因此，“同”衍生物和更高级的同系物以及低级同系物，在用于在本发明中使用的分支PEG的核心的范围内。
本文阐述的分支PEG种类通过诸如下文方案3中所述的那种方法容易地进行制备：
方案3：分支PEG种类的制备
其中Xa是O或S，并且r是1至5的整数。指数e和f是独立地选自1至2500的整数。
因此，根据方案3，使天然或非天然氨基酸与活化的m-PEG衍生物相接触，所述活化的m-PEG衍生物在这种情况下是甲苯磺酸盐，通过使侧链杂原子Xa烷基化形成1。将单官能化的m-PEG氨基酸提交给具有反应性m-PEG衍生物的N-酰化条件，从而装配分支的m-PEG 2。如本领域技术人员应当理解的，甲苯磺酸盐离去基团可以由任何合适的离去基团替换，所述合适的离去基团例如卤素、甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐等。类似地，用于酰化胺的反应碳酸酯可以替换为活性酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺等，或酸可以使用脱水剂例如二环己基碳化二亚胺、羰基二咪唑等进行原位活化。
在一个示例性实施方案中，修饰基团是PEG部分，然而，任何修饰基团例如水溶性聚合物、水不溶性聚合物、治疗性部分等可以通过合适的连接掺入糖基部分中。经修饰的糖通过酶促方法、化学方法或其组合形成，从而产生经修饰的糖。在一个示例性实施方案中，糖在任何位置处由活性胺置换，所述位置允许附着修饰基团，仍允许糖充当酶的底物，所述酶能够使经修饰的糖与G-CSF多肽偶联。在一个示例性实施方案中，当半乳糖胺是经修饰的糖时，胺部分在6-位置处与碳原子附着。
水不溶性聚合物
在另一个实施方案中，类似于上文讨论的那些，经修饰的糖包括水不溶性聚合物，而不是水溶性聚合物。本发明的缀合物还可以包括一种或多种水不溶性聚合物。本发明的这个实施方案通过使用缀合物作为媒介物进行举例说明，用所述媒介物以控制方式递送治疗性多肽。聚合药物递送系统是本领域已知的。参见例如，Dunn等人，编辑POLYMERICDRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposiu m Series第469卷，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。本领域技术人员应当理解基本上任何已知的药物递送系统都可应用于本发明的缀合物。
代表性水不溶性聚合物包括但不限于，polyphosphazines、聚(乙烯醇)、聚酰胺、聚碳酸酯、聚烷撑、聚丙烯酰胺、聚烷撑二醇、聚烷撑氧化物、聚烷撑对苯二酸盐、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸交酯、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯、聚(甲基甲基丙烯酸酯)、聚(乙基甲基丙烯酸酯)、聚(丁基甲基丙烯酸酯)、聚(异丁基甲基丙烯酸酯)、聚(己基甲基丙烯酸酯)、聚(异癸基甲基丙烯酸酯)、聚(月桂基甲基丙烯酸酯)、聚(苯基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(异丙基丙烯酸酯)、聚(异丁基丙烯酸酯)、聚(十八基丙烯酸酯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(乙烯氧化物)、聚(乙烯对苯二酸盐)、聚(乙烯乙酸酯)、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、普朗尼克和聚乙烯苯酚及其共聚物。
在本发明的缀合物中使用的合成修饰的天然聚合物包括但不限于，烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯和硝化纤维素。广泛类别的合成修饰的天然聚合物的特别优选成员包括但不限于，甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧甲基纤维素、三乙酸纤维素、纤维素硫酸钠盐、以及丙烯酸和甲基丙烯酸酯和海藻酸的聚合物。
本文讨论的这些和其他聚合物可以容易地得自商业来源例如SigmaChemical Co.(St.Louis，MO.)、Polysciences(Warrenton，PA.)、Aldrich(Milwaukee，WI.)、Fluka(Ronkonkoma，NY)和BioRad(Richmond，CA)，要不就使用标准技术由得自这些供应商的单体合成。
在本发明的缀合物中使用的代表性生物可降解聚合物包括但不限于，聚交酯、聚乙醇酸交酯及其共聚物、聚(乙烯对苯二酸盐)、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯共己内酯)、聚(丙交酯共乙交酯)、聚酐、聚原酸酯、其掺和物和共聚物。特别有用的是形成凝胶的组合物，例如包括胶原、普朗尼克等的那些。
在本发明中使用的聚合物包括“杂交”聚合物，其包括在其至少部分结构内具有生物吸收性分子的水不溶性材料。此类聚合物的例子是包括水不溶性共聚物的那种，其具有生物吸收性区域、亲水性区域和多个可交联官能团/聚合物链。
为了本发明的目的，“水不溶性材料”包括在水或含水环境中基本上不可溶的材料。因此，尽管共聚物的特定区域或区段可以是亲水的或甚至水溶性的，但聚合物分子就整体而言在水中无任何基本测量溶解。
为了本发明的目的，术语“生物吸收性分子”包括能够由机体通过正常排泄途径代谢或分解且再吸收和/或消除的区域。此类代谢产物或分解产物优选对机体基本上无毒。
生物吸收性区域可以是疏水或亲水的，只要共聚物组合物就整体而言不变成水溶性的。因此，基于聚合物就整体而言保持水不溶性的优先来选择生物吸收性区域。因此，选择相对性质，即由生物吸收性区域包含的官能团的种类，和生物吸收性区域的相对比例以及亲水区，以确保有用的生物吸收性组合物保持水不溶性的。
示例性可吸收性聚合物包括例如合成产生的聚(α-羟基-羧酸)/聚(氧烷撑)的可吸收性嵌段共聚物(参见，Cohn等人，美国专利号4,826,945)。这些共聚物不是交联的并且是水溶性的，从而使得机体可以排泄经降解的嵌段共聚物组合物。参见，Younes等人，J Biomed.Mater.Res.21：1301-1316(1987)；和Cohn等人，JBiomed.Mater.Res.22：993-1009(1988)。
目前优选的生物吸收性聚合物包括选自下述的一种或多种组分：聚(酯)、聚(羟酸)、聚(内酯)、聚(酰胺)、聚(酯-酰胺)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(原酸酯)、聚(碳酸酯)、聚(偶磷氮)、聚(磷酸酯)、聚(硫酯)、多糖及其混合物。更加优选地，生物吸收性聚合物包括聚(羟基)酸组分。在聚(羟基)酸中，聚乳酸、聚乙醇酸、聚己酸、聚丁酸、聚戊酸及其共聚物和混合物是优选的。
除形成在体内吸收的(“生物吸收的”)片段外，用于在本发明的方法中使用的优选聚合涂层也可以形成可排泄和/或可代谢的片段。
更高级别的共聚物也可以在本发明中使用。例如，1984年3月20日颁发的Casey等人，美国专利号4,438,253，公开了由聚(乙醇酸)和羟基末端聚(烷撑二醇)的转酯作用产生的三嵌段共聚物。此类组合物公开用作可吸收性单丝缝线。通过将芳香族原碳酸酯例如四-对甲苯基原碳酸酯掺入共聚物结构内，控制此类组合物的弹性。
还可以利用基于乳酸和/或乙醇酸的其他聚合物。例如，1993年4月13日颁发的Spinu，美国专利号5,202,413，公开了具有聚交酯和/或聚乙醇酸交酯的顺次有序嵌段的生物可降解多嵌段共聚物，其通过丙交酯和/或乙交酯在寡聚二醇或二胺残基上的开环聚合，随后用双功能化合物例如二异氰酸酯、二酰基氯或二氯甲硅烷的链延伸而产生。
在本发明中有用的涂层的生物吸收性区域可以设计为可水解和/或酶促切割的。为了本发明的目的，“可水解切割的”指共聚物特别是生物吸收性区域对于在水或含水环境中的水解的敏感性。类似地，如本文所使用的，“可酶促切割的”指共聚物特别是生物吸收性区域对于通过内源或外源酶切割的敏感性。
当置于体内时，亲水区可以加工成可排泄和/或可代谢的片段。因此，亲水区可以包括例如聚醚、聚烷撑氧化物、多元醇、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚(烷基噁唑啉)、多糖、碳水化合物、肽、蛋白质及其共聚物和混合物。此外，亲水区还可以是例如聚(烷撑)氧化物。此类聚(烷撑)氧化物可以包括例如聚(乙烯)氧化物、聚(丙烯)氧化物及其混合物和共聚物。
其为水凝胶组分的聚合物也在本发明中有用。水凝胶是能够吸收相对大量水的聚合材料。形成水凝胶的化合物的例子包括但不限于，聚丙烯酸、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、角叉菜胶和其他多糖、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、以及其衍生物等。可以产生稳定的、生物可降解的和生物吸收性的水凝胶。此外，水凝胶组合物可以包括显示出这些性质中的一种或多种的亚单位。
其完整性可以通过交联得到控制的生物相容的水凝胶组合物是已知的，并且目前对于在本发明的方法中的使用是优选的。例如，1995年4月25日颁发的Hubbell等人，美国专利号5,410,016和1996年6月25日颁发的5,529,914，公开了水溶性系统，其是具有夹在2个水解不稳定的延长之间的水溶性中心嵌段区段的交联嵌段共聚物。此类共聚物用光致聚合的丙烯酸酯功能性进一步末端加帽。当交联时，这些系统变成水凝胶。此类共聚物的水溶性中心嵌段可以包括聚(乙二醇)；而水解不稳定的延长可以是聚(α-羟酸)，例如聚乙醇酸或聚乳酸。参见，Sawhney等人，Macromolecules 26：581-587(1993)。
在另一个实施方案中，凝胶是热可逆凝胶。包括组分例如普朗尼克、胶原、明胶、透明质酸、多糖、聚氨基甲酸乙酯水凝胶、聚氨基甲酸乙酯-尿素水凝胶及其组合的热可逆凝胶是目前优选的。
在另外一个示例性实施方案中，本发明的缀合物包括脂质体的组分。脂质体可以根据本领域技术人员已知的方法进行制备，例如，如1985年6月11日颁发的Eppstein等人，美国专利号4,522,811中描述的。例如，脂质体制剂可以通过在无机溶剂中溶解一种或多种合适的脂质(例如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、arachadoyl磷脂酰胆碱和胆固醇)进行制备，所述无机溶剂随后蒸发，在容器的表面上留下干燥脂质的薄膜。随后将活性化合物或其药学上可接受的盐的水溶液引入容器内。容器随后通过手工涡旋，以从容器的侧面释放脂质材料并且分散脂质聚集物，从而形成脂质体悬浮液。
提供上述微粒和制备微粒的方法作为例子，并且它们不意欲限定在本发明中使用的微粒的范围。对于本领域技术人员显而易见的是，通过不同方法制造的微粒的阵列在本发明中有用。
上文在直链和分支的水溶性聚合物的背景中讨论的结构形式就水不溶性聚合物而言一般也可应用。因此，例如，半胱氨酸、丝氨酸、二赖氨酸和三赖氨酸分支核心可以用2个水不溶性聚合物部分进行官能化。用于产生这些种类的方法一般紧密类似于用于产生水溶性聚合物的那些。
其他修饰基团
本发明还提供了类似于上文描述的那些的缀合物，其中多肽经由糖基连接基团与治疗性部分、诊断性部分、靶向部分、毒素部分等连接。上述部分各自可以是小分子、天然聚合物(例如，多肽)或合成聚合物。
在再进一步的实施方案中，本发明提供了由于作为缀合物的组分的靶向试剂的存在，选择性定位于特定组织中的缀合物。在一个示例性实施方案中，靶向试剂是蛋白质。示例性蛋白质包括转铁蛋白(脑、血池)、HS-糖蛋白(骨、脑、血池)、抗体(脑、具有抗体特异性抗原的组织、血池)、凝固因子V-XII(受损组织、凝块、癌症、血池)、血清蛋白质，例如α-酸性糖蛋白、胎球蛋白、甲胎蛋白(脑、血池)、β2-糖蛋白(肝、动脉粥样硬化斑块、脑、血池)、G-CSF、GM-CSF、M-CSF和EPO(免疫刺激、癌症、血池、红血细胞超生产、神经保护)、白蛋白(增加的半衰期)、IL-2和IFN-α。
在示例性靶向缀合物中，干扰素α2β(IFN-α2β)经由双功能连接体与转铁蛋白缀合，所述双功能连接体包括在PEG部分的每个末端处的糖基连接基团(方案1)。例如，PEG连接体的一个末端用与转铁蛋白附着的完整的唾液酸连接体进行官能化，并且另一个末端用与IFN-α2β附着的完整的C联Man连接体进行官能化。
生物分子
在另一个实施方案中，经修饰的糖具有生物分子。在再进一步的实施方案中，生物分子是功能蛋白质、酶、抗原、抗体、肽、核酸(例如，单个或多个核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸以及单链和更高级链的核酸)、凝集素、受体或其组合。
优选的生物分子是基本上无荧光的，或发出这样的最低限度量的荧光，使得它们不适合于在测定法中用作荧光标记。此外，一般优选使用非糖的生物分子。这种优先的例外是在其他方面天然存在的糖的使用，所述糖通过共价附着另一个实体(例如，PEG、生物分子、治疗部分、诊断部分等)进行修饰。在一个示例性实施方案中，其为生物分子的糖部分与连接体臂缀合，并且糖-连接体臂盒随后经由本发明的方法与多肽缀合。
在实践本发明中有用的生物分子可以衍生自任何来源。生物分子可以从天然来源中分离，或它们可以通过合成方法产生。多肽可以是天然多肽或突变多肽。突变可以通过化学诱变、定点诱变或本领域技术人员已知的其他诱导突变的方法来实现。在实践本发明中有用的多肽包括例如酶、抗原、抗体和受体。抗体可以是多克隆或单克隆的；完整的或片段。多肽任选是定向进化程序的产物。
天然衍生的和合成的多肽和核酸与本发明结合使用；这些分子可以通过任何可用的反应基团与糖残基组分或交联剂附着。例如，多肽可以通过反应性的胺、羧基、巯基或羟基附着。反应基团可以位于多肽末端处或多肽链内部的位点处。核酸可以通过在碱上的反应基团(例如，环外胺)或在糖部分上可用的羟基(例如，3’-或5’-羟基)附着。肽和核酸链可以在一个或多个位点处进一步衍生，以允许在链上附着合适的反应基团。参见，Chrisey等人Nucleic Acids Res.24：3031-3039(1996)。
在一个进一步的实施方案中，选择生物分子以将通过本发明的方法修饰的多肽导向特定组织，从而相对于递送给组织的未经衍生的多肽的量，增强多肽对那个组织的递送。在再进一步的实施方案中，在所选时间段内递送给特定组织的经衍生的多肽的量通过衍生增强至少约20％、更优选至少约40％、并且更加优选至少约100％。目前，用于靶向应用的优选生物分子包括抗体、激素和细胞表面受体的配体。
在再进一步的示例性实施方案中，提供了具有生物素的缀合物。因此，例如，选择性生物素化的多肽通过附着具有一个或多个修饰基团的抗生物素蛋白或链霉亲和素部分进行加工。
治疗部分
在另一个实施方案中，经修饰的糖包括治疗性部分。本领域技术人员应当理解，在治疗性部分和生物分子的范畴之间存在重叠；许多生物分子具有治疗性质或潜力。
治疗性部分可以是已公认用于临床使用的试剂，或它们可以是其使用是实验性的，或其活性或作用机制处于研究下的药物。治疗性部分可以在给定疾病状态中具有已证明的作用，或可以仅假定在给定疾病状态中显示所需作用。在另一个实施方案中，治疗性部分是就其与选择的组织相互作用的能力进行筛选的化合物。在实践本发明中有用的治疗性部分包括来自具有各种药理学活性的广泛范围的药物类别的药物。优选的治疗性部分是基本上无荧光的，或发出这样的最低限度量的荧光，使得它们不适合于在测定法中用作荧光标记。此外，一般优选使用非糖的治疗部分。这种优先的例外是这样的糖的使用，所述糖通过共价附着另一个实体(例如，PEG、生物分子、治疗部分、诊断部分等)进行修饰。在另一个示例性实施方案中，治疗性糖部分与连接体臂缀合，并且糖-连接体臂盒随后经由本发明的方法与多肽缀合。
使治疗性和诊断性试剂与各种其他种类缀合的方法是本领域技术人员众所周知的。参见例如，Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Dunn等人，编辑POLYMERICDRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series第469卷，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。
在一个示例性实施方案中，治疗性部分经由在所选择的条件下被切割的连接与经修饰的糖附着。示例性条件包括但不限于，所选择的pH(例如，胃、肠、内吞液泡)、活性酶(例如，酯酶、还原酶、氧化酶)的存在、光、热等。许多可切割的基团是本领域已知的。参见例如，Jung等人，Biochem.Biophys.Acta，761：152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol. Chem.，265：14518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.，124：913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.，155：141-147(1986)；Park等人，J.Biol. Chem.，261：205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.，143：1859-1867(1989)。
有用的治疗性部分的类别包括例如非类固醇抗炎药(NSAIDS)。NSAIDS可以例如选自下述范畴：(例如，丙酸衍生物、乙酸衍生物、芬那酸衍生物、联苯羧酸衍生物和昔康)；类固醇抗炎药包括氢化可的松等；抗组胺药(例如，氯苯那敏、曲普利啶)；镇咳药(例如，右美沙芬、可待因、卡拉美芬和咳必清)；止痒药(例如，甲地嗪和三甲泼拉嗪)；抗胆碱能药(例如，东莨菪碱、阿托品、后马托品、左旋多巴)；镇吐药和止恶心药(例如，赛克力嗪、美克洛嗪、氯丙嗪、布克力嗪)；减食欲药(例如，苄非他明、苯丁胺、对氯苯丁胺、芬氟拉明)；中枢兴奋药(例如，苯丙胺、甲基苯丙胺、右旋安非他命和哌甲酯)；抗心律失常药(例如，心得安、普鲁卡因胺、丙吡胺、奎尼丁、恩卡尼)；β-肾上腺素能阻断剂药物(例如，美托洛尔、醋丁洛尔、倍他洛尔、拉贝洛尔和噻吗洛尔)；强心药(例如，米力农、氨力农和多巴酚丁胺)；降压药物(例如，依那普利、可乐定、肼屈嗪、米诺地尔、胍那决尔、胍乙啶)；利尿药(例如，阿米洛利和氢氯噻嗪)；血管扩张药(例如，地尔硫卓、胺碘酮、异克舒林、布酚宁、妥拉唑啉和维拉帕米)；血管收缩药(例如，双氢麦角胺、麦角胺和methylsergide)；抗溃疡药(例如，雷尼替丁和西咪替丁)；麻醉药(例如，利多卡因、布比卡因、氯普鲁卡因、二丁卡因)；抗抑郁药(例如，丙咪嗪、地昔帕明、阿米替林(amitryptiline)、去甲替林(nortryptiline)；安定药和镇静药(例如，氯氮卓、贝那替秦(benacytyzine)、苯喹胺、氟西泮、羟嗪、洛沙平和丙嗪)；抗精神病药(例如，氯普噻吨、氯非那嗪、氯哌啶醇、吗茚酮、硫利达嗪和三氟拉嗪)；抗微生物药(抗菌、抗真菌、抗原生动物和抗病毒药)。
对于掺入当前组合物内优选的抗微生物药包括例如，β-内酰胺药物、喹诺酮药物、环丙沙星、诺氟沙星、四环素、红霉素、阿米卡星、三氟生、多西环素、卷曲霉素、氯己定、金霉素、土霉素、克林霉素、乙胺丁醇、己脒定异硫代硫酸盐(isothionate)、甲硝唑、喷他脒、庆大霉素、卡那霉素、林可霉素(lineomycin)、甲烯土霉素、乌洛托品、米诺环素、新霉素、netilmycin(疑为netilmicin，萘替米星)、巴龙霉素、链霉素、妥布霉素、咪康唑和金刚烷胺的药学上可接受的盐。
在实践本发明中使用的其他药物部分包括抗肿瘤药物(例如，抗雄激素(例如，亮丙瑞林或氟他胺)、杀细胞试剂(例如，阿霉素、多柔比星、泰素、环磷酰胺、白消安、顺铂、β-2-干扰素)、抗雌激素(例如，它莫西芬)、抗代谢药(例如，氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、巯嘌呤、硫鸟嘌呤)。在这个类别内还包括的是用于诊断和治疗的基于放射性同位素的试剂，和经缀合的毒素，例如蓖麻蛋白、格尔德霉素、多卡米星、美坦辛、CC-1065和相关结构及其类似物。
治疗性部分还可以是激素(例如，甲羟孕酮、雌二醇、亮丙瑞林、甲地孕酮、奥曲肽或生长抑素)；肌肉松弛药(例如，桂美君、环苯扎林、黄酮哌酯、奥芬那君、罂粟碱、美贝维林、异达维林、利托君、地芬诺酯、丹曲林和阿珠莫林)；抗痉挛药；骨有效药(例如，二磷酸盐和膦烷基膦酸酯药物化合物)；内分泌调节药(例如，避孕药(例如，炔诺醇、炔雌醇、炔诺酮、美雌醇、去氧孕烯、甲羟孕酮)、糖尿病调节剂(例如，格列本脲或氯磺丙脲)、合成代谢药物例如睾内酯或司坦唑醇、雄激素(例如，甲睾酮、睾酮或氟甲睾酮)、抗利尿药(例如，去氨加压素)和降钙素)。
还在本发明中使用的是雌激素(例如，己烯雌酚)，糖皮质激素(例如，曲安西龙、倍他米松等)，和孕激素例如炔诺酮、炔诺醇、炔诺酮、左炔诺孕酮；甲状腺试剂(例如，碘塞罗宁或左甲状腺素)或抗甲状腺试剂(例如，甲巯咪唑)；抗高催乳素血症药(例如，卡麦角林)；激素抑制剂(例如，达那唑或戈舍瑞林)、催产药(例如，甲基麦角新碱或催产素)和前列腺素，例如米索前列醇(mioprostol)、前列地尔或地诺前列酮，也可以采用。
其他有用的修饰基团包括免疫调节药(例如，抗组胺药、肥大细胞稳定剂例如洛度沙胺和/或色甘酸钠、类固醇(例如，曲安西龙、倍氯米松、可的松、地塞米松、泼尼松龙、甲泼尼龙、倍氯米松或氯倍他索)、组胺H2拮抗剂(例如，法莫替丁、西咪替丁、雷尼替丁)、免疫抑制剂(例如，硫唑嘌呤、环孢素)等。具有抗炎活性的组例如舒林酸、依托度酸、酮洛芬和酮咯酸也有用。与本发明结合使用的其他药物对于本领域技术人员将是显而易见的。
糖基供体种类
在一个实施方案中，本发明的多肽缀合物通过在酶的存在下使多肽与糖基供体种类相接触进行制备，糖基供体种类是所述酶的底物。在一个例子中，糖基供体种类具有根据下式(X)的结构：
在式(X)中，p是选自0和1的整数；并且w是选自0至20的整数。在一个例子中，w选自1-8。在另一个例子中，w选自1-6。在另一个例子中，w选自1-4。在另外一个例子中，w是0，-La-R6c替换为H。F是脂质部分。示例性脂质部分在本文下文中描述。在一个例子中，脂质部分是多萜醇或十一异戊烯部分。
在式(X)中，Z＊代表本发明的糖基部分。糖基部分在本文例如多肽缀合物的背景中(例如对于式III)定义，且同样地应用于本发明的糖基供体种类。在一个代表性实施方案中，糖基部分选自单糖和寡糖。在另一个代表性实施方案中，Z＊选自单触角、二触角、三触角和四触角糖。在另一个实施方案中，Z＊包括C-2-N-乙酰氨基，如在GlcNAc、GalNAc或bacillosamine中。
在式(X)中，每个La是独立地选自单键、官能团、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、和取代或未取代的杂环烷基的连接体部分。每个R6c是独立地选择的本发明的修饰基团。A1是选自P(磷)和C(碳)的成员。Y3是选自氧(O)和硫(S)的成员。Y4是选自O、S、SR1、OR1、OQ、CR1R2和NR3R4的成员。E2、E3和E4是独立地选自CR1R2、O、S和NR3的成员。在一个例子中，E2是O。在另一个例子中，E3是O。在另外一个例子中，E4是O。在一个具体例子中，E2、E3和E4各自是O。每个W是独立地选自SR1、OR1、OQ、NR3R4、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、和取代或未取代的杂环烷基的成员。在式(X)中，每个Q是独立地选自H、负电荷和盐抗衡离子(阳离子)的成员，并且每个R1、每个R2、每个R3和每个R4是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、和取代或未取代的杂环烷基的成员。在一个例子中，酶是寡糖基转移酶，并且糖基供体种类是脂质-焦磷酸盐连接的糖基部分。
糖基供体的脂质部分
在一个实施方案中，式(X)的脂质部分包括在直链或支链中排列的1至约200个碳原子，优选约5至约100个碳原子。这条链中的碳-碳键独立地选自饱和和不饱和的。双键可以具有顺式或反式构型。在一个实施方案中，碳链包括至少一个芳香族或非芳香族环结构。在一个例子中，脂质部分包括至少5，优选至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个碳原子。在另一个实施方案中，碳链由至少一个官能团间断。示例性官能团包括醚、硫醚、胺、甲酰胺、磺胺、肼、羰基、氨基甲酸酯、尿素、硫脲、酯和碳酸酯。
在一个实施方案中，脂质部分是取代或未取代的烷基。在另一个实施方案中，脂质部分包括至少一个异戊二烯基或还原的异戊二烯基部分。在另外一个实施方案中，脂质部分选自聚-异戊二烯基、还原的聚-异戊二烯基、和部分还原的聚-异戊二烯基。示例性脂质部分包括下述结构之一：
其中b、c、d和d’是独立地选自0至100的整数。在一个实施方案中，脂质部分包括总共约2至约40个异戊二烯基和/或还原的异戊二烯基单位。在另一个实施方案中，脂质部分包括约5至约22个异戊二烯基和/或还原的异戊二烯基单位。
在根据这个实施方案的一个例子中，脂质部分是十一异戊烯，C55类异戊二烯。在另一个例子中，脂质部分是还原或部分还原的十一异戊烯。示例性脂质部分包括：
在另一个实施方案中，脂质部分衍生自脂肪酸醇，例如天然存在的那些。在另外一个实施方案中，脂质部分衍生自多萜醇或聚戊烯醇。在形成本发明的多肽缀合物中使用真核生物寡糖基转移酶时，多萜醇衍生的部分是特别有用的。在一个例子中，脂质部分具有一般结构：
其中b和d是独立地选自0至100的整数。在一个例子中，d选自1至约50、优选1至约40、更优选1至约30并且更加优选1至约20或1至约10。在另一个例子中，d选自7至20，优选选自7-19、7-18、7-17、7-16、7-15、7-14、7-13、7-12、7-11、7-10、7-9或7-8。在另一个例子中，d选自13-20、优选选自14-19、并且更优选选自14-17。在另一个例子中，b选自0至6。在另外一个例子中，b选自0至2。在一个进一步例子中，多萜醇部分具有约15至约22个类异戊二烯单位。用星号标记的立体中心具有(S)或(R)构型。
示例性多萜醇和聚异戊烯醇部分在例如T.Chojnacki等人，Cell.Biol. Mol. Lett.2001，6(2)，192；T.Chojnacki和G.Dallner，Biochem.J.1988，251，1-9；E.Swiezewska等人，Acta Biochim.Polon.1994，221-260；和G.Van Duij等人，Chem.Scripta1987，27，95-100中描述，其公开内容为了所有目的整体合并入本文。在一个具体例子中，多萜醇部分具有下述结构：
糖基供体的修饰基团
在式(X)中，R6c代表本发明的修饰基团。修饰基团在本文例如多肽缀合物的背景中描述，并且同样地应用于本发明的化合物(例如，糖基供体种类)。在一个代表性实施方案中，式(X)的糖基供体种类包括具有结构的修饰基团R6c，所述结构是选自下述的成员：
其中g、j、k、e、f、s、R16、R17、G1、G2、G3、A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11和A12如上定义。
示例性糖基供体种类
在一个示例性实施方案中，糖基供体种类包括磷酸盐或焦磷酸盐部分，并且具有下述结构：
其中w、p、La、R6c、F、Q和Z＊在本文上文对于式(X)定义。根据这个实施方案的示例性化合物包括下式的那些：
其中b和d独立地选自0至100。在一个实施方案中，b是3。在另一个实施方案中，d是7。在另外一个实施方案中，d是7，并且b是3。
在一个示例性实施方案中，式(X)中的糖基部分Z＊是选自GlcNAc-GlcNAc、GlcNH-GlcNAc、GlcNAc-GlcNH或GlcNH-GlcNH部分的成员。在一个实施方案中，Z＊是GlcNAc-Gal或GlcNH-Gal部分。在另一个实施方案中，Z＊是GlcNAc-GlcNAc-Gal、GlcNH-GlcNAc-Gal、GlcNAc-GlcNH-Gal或GlcNH-GlcNH-Gal部分。在另一个实施方案中，Z＊是GlcNAc-Gal-Sia部分。在另一个实施方案中，Z＊是GlcNAc-GlcNAc-Gal-Sia 、GlcNH-GlcNAc-Gal-Sia 、GlcNAc-GlcNH-Gal-Sia或GlcNH-GlcNH-Gal-Sia部分。示例性糖基供体种类包括：
其中b、d、Q、La和R6c如本文上文定义。Q1是H、单个负电荷或阳离子(例如，Na+或K+)。A和B是独立地选自OR(例如，OH)和NHCOR(例如，NHAc)的成员。上文显示的焦磷酸盐可以任选是磷酸盐。
示例性糖基供体种类包括：
糖基供体种类的合成
本发明的糖基供体种类可以使用领域公认的方法的组合进行合成。例如，十一异戊烯-焦磷酸盐连接的bacillosamine的合成已由E.Weerapana等人，J.Am.Chem.Soc.2005，127：13766-13767报告，其公开内容通过引用整体合并入本文。可以采用这个合成操作，以合成各种聚异戊烯糖。用于合成脂质-焦磷酸盐连接的GlcNAc部分的示例性合成途径在下文方案3中显示。
方案3a：脂质-磷酸盐和脂质-焦磷酸盐糖的示例性合成
在方案3a中，F是脂质部分，例如十一异戊烯；P＊是适合于保护氨基的保护基团；并且整数q选自1-40。
在方案3a中，化合物II可以由已知的苯甲基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖苷I进行制备，通过例如用苯甲酰氯保护3-和6-羟基，5-羟基转变成离去基团(例如，三氟甲磺酸盐)和后续亲核取代(例如，使用叠氮化钠)。随后可以通过还原叠氮基和用合适的保护基团例如Fmoc保护所得到的氨基来合成化合物III。Bn保护基团的选择性去除和用碱(例如，LiHMDS)和受保护的磷酸盐供体例如受保护的磷酸酐(例如，[(BnO)2P(O)]2O)处理产物。磷酸基的后续脱保护得到化合物IV，所述化合物IV可以使用脂质磷酸盐(十一异戊烯磷酸盐)和合适的偶联试剂例如羰基二咪唑，随后氨基的脱保护而转变成V。通过与活化的修饰基团前体例如本文描述的那些反应，所得到的伯氨基可以用于使焦磷酸盐糖与修饰基团偶联。在一个例子中，修饰基团包括聚(乙二醇)部分。活化的PEG试剂是商购可得的。备选地，氨基可以转变成NHAc基团。
备选地，在方案3a中，化合物VI可以由已知的苯甲基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖苷I进行制备，通过例如用苯甲酰氯保护3-和6-羟基，和例如通过Mitsunobu化学作用倒转在C-5处的立体中心。如上所述的后续磷酸化和脂质部分的偶联得到化合物VIII。使用一种或多种糖基转移酶和分别的糖供体例如核苷酸糖，将化合物进一步转变成IX。在一个例子中，糖供体是经修饰的核苷酸糖，其包括本发明的修饰基团(例如，经修饰的唾液酸部分)。经修饰的糖供体与糖基转移酶相组合使用，经修饰的糖供体是所述糖基转移酶(例如唾液酸转移酶)的底物。在方案3中的反应是示例性的并且不意欲限制本发明的范围。本领域技术人员应当理解，代替化合物I，可以使用任何其他糖部分作为原材料，以便通过相似的合成途径制备各种糖磷酸盐。
用于合成脂质-磷酸盐或脂质-焦磷酸盐糖的另一种方法在方案3b中举例说明。在这种方法中，在酶的存在下使脂质磷酸盐X与包含第一糖部分的糖核苷酸例如UDP-糖(例如，UDP-GlcNAc、UDP-GlcNH、UDP-GalNAc、UDP-GalNH、UDP-bacillosamine、UDP-Glc等)反应，所述酶可以将核苷酸糖的第一糖部分转移到脂质磷酸盐上，导致化合物XI，所述化合物XI可以包括磷酸基或焦磷酸基。在一个实施方案中，酶是磷-多萜醇-GlcNAc-1-磷酸盐转移酶(GPT)。示例性磷-多萜醇-GlcNAc-1-磷酸盐转移酶在本文下文中描述。使用一种或多种糖基转移酶和合适的糖核苷酸，随后可以将另外的糖部分加入第一糖部分中，以得到化合物XII。示例性糖基转移酶也在本文下文中描述。
方案3b：
在方案3b中，每个Q是独立地选自H、单个负电荷和阳离子(例如，K+或Na+)的成员。整数p选自0和1；并且整数q选自1至40。
在一个实施方案中，方案3b中的第一糖部分是GlcNAc，并且第一糖核苷酸是UDP-GlcNAc。在一个例子中，第一GlcNAc部分与经修饰的GlcNAc-或GlcNH-部分连接。在另一个例子中，将另一个GlcNAc部分加入第一GlcNAc部分中。所得到的GlcNAc-GlcNAc部分随后可以与经修饰的Gal部分连接。备选地，GlcNAc-GlcNAc部分首先与Gal部分连接，并且将经修饰的Sia部分加入所得到的GlcNAc-GlcNAc-Gal部分中。根据这些实施方案的示例性合成途径在下文方案3c中举例说明。
方案3c：经修饰的脂质-焦磷酸盐糖的示例性合成
在另外一个实施方案中，方案3c中的化合物XIII的第一GlcNAc部分与经修饰的Gal部分连接。在一个进一步的实施方案中，化合物VIII的第一GlcNAc部分首先与Gal部分连接。Gal部分随后与经修饰的Sia或神经氨酸部分连接。这些实施方案在下文方案3d中举例说明：
方案3d：
在另一个实施方案中，在合适的多萜醇磷酸N-乙酰葡糖胺-1-磷酸盐转移酶的存在下，使磷脂X与经修饰的糖核苷酸(例如，经修饰的UDP-GlcNAc)反应，以得到经修饰的脂质-磷酸盐或脂质焦磷酸盐糖。根据这个实施方案的示例性合成方法在下文方案3e中举例说明。
方案3e：
在一个进一步的实施方案中，脂质-磷酸盐或脂质-焦磷酸盐糖根据下文方案3f中概述的合成途径进行合成。在这个例子中，单糖或多糖(例如，包括Gal部分的二糖)首先与经修饰的糖基部分(例如，经修饰的Sia)连接。在一个例子中，使用糖基转移酶例如唾液酸转移酶，和合适的经修饰的糖核苷酸(例如，经修饰的CMP-Sia)，使经修饰的糖基部分与原材料连接。任何糖苷OH基团随后可以进行保护，例如作为其相对应的甲醚，并且所得到的受保护的经修饰的糖随后可以与磷脂或焦磷酸脂(pyrophospholipid)连接。
方案3f：
其中R20是选自OH、NH2、NHAc、NHCO芳基和NHCO烷基的成员。
在方案3c至3f中，F是本文描述的脂质部分；每个Q是独立地选自H、单个负电荷和阳离子(例如，K+或Na+)的成员。整数w选自1-8，优选选自1-4(例如，对于Glc或Gal部分)或1-5(例如，对于Sia部分)；整数n选自0至40；并且每个整数m是独立地选自0和1的成员。当m是0时，那么(X＊)m替换为H。在一个例子中，每个X＊是独立地选自本文描述的线性和分支聚合修饰基团的成员。在另一个例子中，X＊包括至少一个聚合部分，例如PEG部分(例如，mPEG)。在另外一个例子中，X＊包括使聚合修饰基团与分子的其余部分连接的连接体部分。在一个进一步的例子中，每个X＊是本文对于式(V)描述的Lb-R6c。E5、E6、E7和E8是独立地选自CR1R2(例如，CH2)和官能团的成员，所述官能团例如O、S、NR3(例如，NH)、C(O)、C(O)NR3(例如，CONH)、NHC(O)、NHC(O)NH、NHC(O)O等；并且D是选自H2(在这种情况下双键替换为2个单键)、O、S、NR3(例如，NH)的成员，其中每个R1、每个R2、每个R3和每个R4是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、和取代或未取代的杂环烷基的成员。
各种糖基转移酶和合适的经修饰的或未经修饰的糖核苷酸可以用于加工磷酸盐或焦磷酸盐糖(例如，方案3中的化合物VIII)的第一糖部分。例如，第二GlcNAc部分可以加到第一GlcNAc部分上。第二GlcNAc部分可以任选用本发明的修饰基团进行修饰(对于例子比较方案3c)。在另一个例子中，经修饰的唾液酸部分可以酶促转移至磷酸盐或焦磷酸盐糖的GlcNAc、GlcNAc-GlcNAc-或GlcNAc-GlcNAc-Gal部分(对于例子比较方案3c)。备选地，使用合适的本文描述的糖基转移酶，可以将任何其他的糖基部分(例如，Gal、GalNAc等)加入第一糖部分中。
使用经修饰的糖核苷酸或经修饰的活化糖与合适的糖基转移酶相组合，可以将经修饰的糖残基酶促加入已有的糖残基中，经修饰的糖种类是所述酶的底物。因此，经修饰的糖优选选自经修饰的糖核苷酸、活化的经修饰的糖和其为简单糖类(既不是核苷酸也不是活化的)的经修饰的糖。一般地，该结构将是单糖，但本发明并不限于经修饰的单糖的使用。寡糖、多糖和糖基模拟部分也是有用的。
在另一个实施方案中，使用经纯化的酶(例如，来自细菌或酵母N-糖基化途径)，由脂质-磷酸盐前体(例如，十一异戊烯-磷酸盐)合成糖基供体种类。使用重组酶的此类反应已由KJ Glover等人(PNAS2005，102(40)：14255-14259)描述，其公开内容通过引用整体合并入本文。例如，PglC可以用于将来自UDP-bacillosamine的经修饰的或未经修饰的bacillosamine部分加到十一异戊烯-磷酸盐上，以得到十一异戊烯-焦磷酸盐连接的bacillosamine，其可以使用PglA和UDPGalNAc进一步转变成十一异戊烯-焦磷酸盐连接的bacillosamine-GalNAc，其中GalNAc部分可以任选是经修饰的。另外的糖部分可以使用其他酶例如PglHJ或PglI加入。这些反应中的2个或更多个可以在单个反应容器中执行。用于2个或更多个步骤的试剂(即，酶和核苷酸糖)可以顺次或同时加入。来自酵母途径的示例性酶包括Alg 1-14(例如，Alg1、Alg2、Alg 7和Alg13/14)，所述酶可以用于制备本发明的糖基供体种类。
修饰基团通过酶促方法、化学方法或其组合与糖部分附着，从而产生经修饰的糖。糖在任何位置处进行置换，所述位置允许附着修饰基团，所述修饰基团仍允许糖充当酶的底物，所述酶能够使经修饰的糖与接受结构偶联。在一个示例性实施方案中，当唾液酸是糖时，唾液酸在丙酮酰侧链处或在5-位胺处由修饰基团置换，所述5-位胺在唾液酸中通常是乙酰化的。
经修饰的糖核苷酸
在本发明的特定实施方案中，经修饰的糖核苷酸用于将经修饰的糖部分加入糖基供体种类的前体中。在本发明以其经修饰的形式中使用的示例性糖核苷酸包括核苷酸单、二或三磷酸盐或其类似物。在一个优选实施方案中，经修饰的糖核苷酸选自UDP-糖苷、CMP-糖苷和GDP-糖苷。更加优选地，经修饰的糖核苷酸选自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡糖胺、UDP-bacillosamine、UDP-6-hydroxybacillosamine、GDP-甘露糖、GDP-岩藻糖、CMP-唾液酸和CMP-NeuAc。糖核苷酸的N-乙酰胺衍生物也在本发明的方法中使用。
在一个例子中，核苷酸糖种类用水溶性聚合物进行修饰。示例性经修饰的糖核苷酸具有通过在糖上的胺部分进行修饰的糖基团。经修饰的糖核苷酸例如糖核苷酸的糖基-胺衍生物也在本发明的方法中使用。例如，糖基胺部分(不含修饰基团)可以与多肽(或其种类)酶促缀合，并且游离糖基胺部分随后可以与所需修饰基团缀合。备选地，经修饰的糖核苷酸可以充当酶的底物，所述酶将经修饰的糖转移至多肽上的糖基受体。示例性经修饰的糖核苷酸包括经修饰的唾液酸核苷酸例如：
其中e、f和Q在本文上文中定义，并且g是选自1-20的整数。
在一个示例性实施方案中，经修饰的糖基于6-氨基-N-乙酰基-糖基部分。如下文方案4中对于N-乙酰半乳糖胺所示，经修饰的糖核苷酸可以使用标准方法容易地制备。
方案4：示例性经修饰的糖核苷酸的制备
在上文方案4中，指数n代表0至2500的整数，优选10至1500，并且更加优选10至1200。符号“A”代表活化基团，例如卤素、活化酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯)的组分、碳酸酯(例如对硝基苯基碳酸酯)的组分等。本领域技术人员应当理解，其他PEG-酰胺核苷酸糖通过这种方法和类似方法容易地制备。
在其他示例性实施方案中，酰胺部分由基团例如氨基甲酸乙酯或尿素替换。
在再进一步的实施方案中，R1是分支PEG，例如上文阐述的那些种类之一。根据这个实施方案的举例说明性化合物包括：
其中X4是键或O，并且J是S或O。
此外，如上所述，本发明提供了用水溶性聚合物修饰的核苷酸糖，所述水溶性聚合物是直链或分支的。例如，具有下文显示的式的化合物在本发明的范围内：
其中X4是O或键，并且J是S或O。
类似地，本发明提供了使用那些经修饰的糖种类的核苷酸糖形成的多肽缀合物，其中在6-位置处的碳是经修饰的：
其中X4是键或O，J是S或O，并且y是0或1。
还提供的是具有下式的多肽和糖肽缀合物：
其中J是S或O。
活化的糖
在其他实施方案中，经修饰的糖是活化的糖。在本发明中有用的活化的、经修饰的糖一般是糖苷，其已进行合成改变，以包括离去基团。在一个例子中，活化的糖在酶促反应中用于将活化的糖转移到多肽或糖肽的受体上。在另一个例子中，通过化学方法将活化的糖加入多肽或糖肽中。“离去基团”(或活化基团)指这样的部分，其在酶调节的亲核取代反应中被容易地置换，或备选地在利用亲核反应配偶体(例如，携带巯基的糖基部分)的化学反应中被替换。选择合适的离去基团用于每个类型的反应在技术人员的能力内。许多活化的糖是本领域已知的。参见例如，Vocadlo等人，In CARBOHYDRATE CHEMISTRY AND BIOLOGY，第2卷，Ernst等人编辑，Wiley-VCH Verlag：Weinheim，Germany，2000；Kodama等人，Tetrahedron Lett.34：6419(1993)；Lougheed，等人，J.Biol. Chem.274：37717(1999))。
离去基团的例子包括卤素(例如，氟、氯、溴)、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯等。用于在酶介导的反应中使用的优选的离去基团是不会显著地立体妨碍糖苷酶促转移至受体的离去基团。因此，活化的糖苷衍生物的优选实施方案包括糖基氟化物和糖基甲磺酸盐，其中糖基氟化物是特别优选的。在糖基氟化物中，α-半乳糖基氟化物、α-甘露糖基氟化物、α-葡糖基氟化物、α-岩藻糖基复合物、α-木糖基氟化物、α-唾液酸氟化物、α-N-乙酰葡糖胺氟化物、α-N-乙酰半乳糖胺氟化物、β-半乳糖基氟化物、β-甘露糖基氟化物、β-葡糖基氟化物、β-岩藻糖基复合物、β-木糖基氟化物、β-唾液酸氟化物、β-N-乙酰葡糖胺氟化物和β-N-乙酰半乳糖胺氟化物是最优选的。对于非酶促的亲核取代，这些和其他离去基团可以是有用的。例如，活化的供体糖苷可以是二硝基苯基(DNP)或溴-糖苷。
通过举例说明，通过首先乙酰化并且随后用HF/吡啶处理糖部分，可以由游离糖制备糖基氟化物。这产生受保护的(乙酰化的)糖基氟化物的热力学最稳定的异头物(即，α-糖基氟化物)。如果需要较不稳定的异头物(即，β-糖基氟化物)，那么可以通过用HBr/HOAc或HCI转换全乙酰化的(peracetylated)糖产生异头物溴化物或氯化物进行制备。使这种中间产物与氟化盐例如氟化银反应，以产生糖基氟化物。乙酰化的糖基氟化物可以通过在甲醇(例如NaOMe/MeOH)中与弱(催化的)碱反应进行脱保护。此外，许多糖基氟化物是商购可得的。
其他活化的糖基衍生物可以使用本领域技术人员已知的常规方法进行制备。例如，通过用甲磺酰氯处理完全苯甲基化的半缩醛形式的糖，随后为催化氢化以去除苯甲基，可以制备糖基甲磺酸盐。
在一个进一步的示例性实施方案中，经修饰的糖是具有触角结构的寡糖。在另一个实施方案中，触角的一个或多个末端具有修饰基团。当超过一个修饰基团与具有触角结构的寡糖附着时，寡糖用于“扩增”修饰基团；与多肽缀合的每个寡糖单位使修饰基团的多个拷贝与多肽附着。如上图中所示的本发明的一般缀合物的一般结构包括起因于利用触角结构制备本发明的缀合物的多价种类。许多触角糖结构是本领域已知的，并且当前方法无限制地用它们进行实践。
经修饰的糖的制备
一般而言，通过使用反应性官能团形成糖部分(包括脂质-焦磷酸盐糖的那些)和修饰基团之间的共价键，所述反应性官能团一般通过连接过程转化到新有机官能团或非反应种类内。为了形成键，修饰基团和糖部分携带互补的反应性官能团。一个或多个反应性官能团可以定位在糖部分上的任何位置处。
在实践本发明中有用的反应基团和反应类别一般是生物缀合化学领域中众所周知的那些。对于反应性糖部分可用的目前有利的反应类别是在相对温和的条件下进行的那些。这些包括但不限于亲核取代(例如，胺和醇与酰卤、活性酯的反应)、亲电子取代(例如烯胺反应)和对于碳-碳和碳-杂原子重键的加成(例如，迈克尔(Michael)反应、狄-阿二氏(Diels-Alder)加成)。这些和其他有用的反应在例如March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，第3版，John Wiley&Sons，NewYork，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等人，MODIFICATION OF PROTEINS；Advancesin Chemistry Series，第198卷，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982中讨论。
反应性官能团
从糖核或修饰基团悬垂的有用的反应性官能团包括但不限于：
(a)羧基及其多种衍生物，包括但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酸性卤化物、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基和芳香族酯；
(b)羟基，其可以转变成例如酯、醚、醛等。
(c)卤烷基，其中卤化物可以随后用亲核基团取代，所述亲核基团例如胺、羧酸阴离子、硫醇阴离子、负碳离子或醇盐离子，从而导致新基团在卤素原子的官能团处的共价附着；
(d)二烯亲合体基团，其能够参与狄-阿二氏反应例如马来酰亚胺基团；
(e)醛或酮基团，从而使得后续衍生经由形成羰基衍生物例如亚胺、腙、缩氨基脲或肟成为可能，或经由诸如Grignard加成或烷基锂加成的机制成为可能；
(f)用于与胺的后续反应的磺酰卤基团，以形成磺胺；
(g)硫醇基，其可以例如转变成二硫化物或与酰卤反应；
(h)胺或巯基，其可以例如进行酰化、烷基化或氧化；
(i)烯烃，其可以经历例如环加成、酰化、迈克尔加成等；和
(j)环氧化物，其可以与例如胺和羟基化合物反应。
反应性官能团可以这样进行选择，使得它们不参与或干扰装配反应性糖核或修饰基团所需的反应。备选地，反应性官能团可以通过保护基团的存在使免于参与反应。本领域技术人员了解如何保护具体的官能团，从而使得它不干扰所选择的反应条件组。对于有用的保护基团的例子，参见例如，Greene等人，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANICSYNTHESIS，John Wiley&Sons，New York，1991。
交联基团
用于在本发明的方法中使用的经修饰的糖的制备包括修饰基团与糖残基的附着和形成稳定的加合物，所述加合物是糖基转移酶的底物。糖和修饰基团可以通过零或更高级别的交联剂进行偶联。可以用于使修饰基团与碳水化合物部分附着的示例性双功能化合物包括但不限于，双功能聚(乙二醇)、聚酰胺、聚醚、聚酯等。用于使碳水化合物与其他分子交联的一般方法是文献中已知的。参见例如，Lee等人，Biochemistry28：1856(1989)；Bhatia等人，Anal.Biochem.178：408(1989)；Janda等人，J.Am.Chem.Soc.112：8886(1990)和Bednarski等人，WO 92/18135。在随后的讨论中，在新生的经修饰的糖的糖部分上反应性基团处理为良性的。讨论的焦点是为了举例说明起见。本领域技术人员应当理解讨论同样与修饰基团上的反应基团有关。
多种试剂用于修饰具有分子内化学交联的经修饰的糖的组分(关于交联试剂和交联操作的综述，参见：Wold，F.，Meth.Enzymol.25：623-651，1972；Weetall，H.H.和Cooney，D.A.，In：ENZYMES AS DRUGS.(Holcenberg和Roberts，编辑)第395-442页，Wiley，New York，1981；Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91：580-609，1983；Mattson等人，Mol.Biol.Rep.17：167-183，1993，所有这些参考文献通过引用合并入本文)。优选的交联试剂衍生自多种零长度、同双功能和异双功能交联试剂。零长度的交联试剂包括2个固有化学基团的直接缀合而不引入外来材料。催化二硫键形成的试剂属于这个范畴。另一个例子是诱导羧基和伯氨基缩合以形成酰胺键的试剂，例如碳化二亚胺、氯甲酸乙酯、Woodward′s试剂K(2-乙基-5-苯基异噁唑-3′-磺酸盐)和羰基二咪唑。除这些化学试剂外，酶转谷氨酰胺酶(谷氨酰-肽γ-谷氨酰转肽酶；EC2.3.2.13)也可以用作零长度交联试剂。这种酶催化在蛋白质结合的谷氨酰胺酰残基的甲酰胺基团处的酰基转移反应，通常用伯氨基作为底物。优选的同和异双功能试剂分别包含2个等同或2个不同的位点，其可以对于氨基、巯基、胍基、吲哚或非特异性基团反应。
除使用位点特异性反应部分外，本发明考虑了非特异性反应基团的使用，以使糖与修饰基团连接。
示例性非特异性交联剂包括在黑暗中完全惰性的光激活基团，其在吸收合适能量的光子后转变成反应种类。在一个实施方案中，光激活基团选自在叠氮化物加热或光解后产生的氮烯的前体。缺电子的氮烯是极端反应性的，并且可以与多种化学键反应，包括N-H、O-H、C-H和C＝C。尽管可以采用3种类型的叠氮化物(芳基、烷基和芳基衍生物)，但酰基叠氮化物是目前。芳基叠氮化物在光解后的反应性对于N-H和O-H优于C-H键。缺电子的芳基氮烯快速环扩展以形成脱氢吖庚因(dehydroazepines)，其趋于与亲核体反应，而不是形成C-H插入产物。芳基叠氮化物的反应性可以通过环中的吸电子取代物例如硝基或羟基的存在得到增加。此类取代物将芳基叠氮化物的最大吸收推至较长波长。未取代的芳基叠氮化物具有在260-280nm范围中的最大吸收，而羟基和硝基芳基叠氮化物吸收超过305nm的显著光。因此，羟基和硝基芳基叠氮化物是最优选的，因为它们允许采用比未取代的芳基叠氮化物更不有害的光解条件用于亲和组分。
在另外一个进一步的实施方案中，提供了具有这样的基团的连接体基团，所述基团可以进行切割，以释放来自糖残基的修饰基团。许多可切割的基团是本领域已知的。参见例如，Jung等人，Biochem.Biophys.Acta 761：152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem.265：14518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.124：913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.155：141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.261：205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.143：1859-1867(1989)。此外，广泛范围的可切割的、双功能(同和异双功能的)连接体基团从供应商例如Pierce商购可得。
示例性可切割部分可以使用光、热或试剂例如硫醇、羟胺、碱、高碘酸盐等进行切割。此外，特定的优选基团在体内响应内吞而被切割(例如，顺式-乌头；参见Shen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.102：1048(1991))。优选的可切割基团包括可切割部分，其是选自二硫化物、酯、酰亚胺、碳酸酯、硝基苯甲基、苯甲酰甲基和苯偶姻基团的成员。
在下文讨论中，阐述了在实践本发明中有用的经修饰的糖的许多特别例子。在示例性实施方案中，唾液酸衍生物用作修饰基团与之附着的糖核。关于唾液酸衍生物的讨论焦点仅为了举例说明起见，并且不应解释为限制本发明的范围。本领域技术人员应当理解，以类似于使用唾液酸作为例子阐述的方式可以活化且衍生多种其他糖部分。例如，众多方法可用于修饰半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和岩藻糖，以列举少数糖底物，其通过领域公认的方法容易地进行修饰。参见例如，Elhalabi等人，Curr.Med.Chem.6：93(1999)和Schafer等人，J.Org.Chem.65：24(2000)。
在一个示例性实施方案中，通过本发明的方法修饰的多肽是糖肽，其在原核细胞(例如，大肠杆菌)、真核细胞包括酵母和哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)中，或在转基因动物中产生，并且因此包含不完全唾液酸化的N联和/或O联寡糖链。缺乏唾液酸且包含末端半乳糖残基的糖肽的寡糖链可以是糖基PEG化的、糖基PPG化的或以其他方式用经修饰的唾液酸修饰的。
在方案5中，氨基糖苷1用受保护的氨基酸(例如，甘氨酸)衍生物的活性酯进行处理，将糖胺残基转变成相对应的受保护的氨基酸酰胺加合物。加合物用醛缩酶进行处理，以形成α-羟基羧酸盐2。化合物2通过CMP-SA合成酶的作用转变成相对应的CMP衍生物，随后为CMP衍生物的催化氢化以产生化合物3。通过使化合物3与活化的(m-)PEG或(m-)PPG衍生物(例如，PEG-C(O)NHS、PPG-C(O)NHS)反应，经由形成甘氨酸加合物引入的胺用作PEG或PPG附着的部位，分别产生4或5。
方案5
下表11阐述了用PEG或PPG部分衍生的糖单磷酸盐的代表性例子。表2的特定化合物通过方案4的方法进行制备。其他衍生物通过领域公认的方法进行制备。参见例如，Keppler等人，Glycobiology 11：11R(2001)；和Charter等人，Glycobiology 10：1049(2000))。其他胺反应性PEG和PPG类似物是商购可得的，或它们可以通过本领域技术人员容易获得的方法进行制备。
表11：用PEG或PPG衍生的糖单磷酸盐的例子
在实践本发明中使用的经修饰的糖磷酸盐可以在其他位置以及上文所述的那些中进行置换。唾液酸的目前优选的置换在式(VIII)中阐述：
其中X是连接基团，其优选选自-O-、-N(H)-、-S、CH2-和-N(R)2，其中每个R是独立地选自R1-R5的成员。符号Y、Z、A和B各自代表选自上文对于X的特性阐述的基团。X、Y、Z、A和B各自独立地选择，并且因此它们可以是相同或不同的。符号R1、R2、R3、R4和R5代表H、水溶性聚合物、治疗性部分、生物分子或其他部分。备选地，这些符号代表与水溶性聚合物、治疗性部分、生物分子或其他部分结合的连接体。
与本文公开的缀合物附着的示例性部分包括但不限于，PEG衍生物，(例如，烷基-PEG、酰基-PEG、酰基-烷基-PEG、烷基-酰基-PEG、氨甲酰基-PEG、芳基-PEG)、PPG衍生物(例如，烷基-PPG、酰基-PPG、酰基-烷基-PPG、烷基-酰基-PPG、氨甲酰基-PPG、芳基-PPG)、治疗性部分、诊断性部分、甘露糖-6-磷酸盐、肝素、类肝素、SLex、甘露糖、甘露糖-6-磷酸盐、Sialyl Lewis X、FGF、VFGF、蛋白质、软骨素、角质素、皮肤素、白蛋白、整联蛋白、触角寡糖、肽等。使多种修饰基团与糖部分缀合的方法是本领域技术人员容易获得的(POLY(ETHYLENEGLYCOL CHEMISTRY：BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS，J.Milton Harris，编辑，Plenum Pub.Corp.，1992；POLY(ETHYLENEGLYCOL)CHEMICAL AND BIOLOGICAL APPLICATIONS，J.Milton Harris，编辑，ACS Symposium Series No.680，American Chemical Society，1997；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，SanDiego，1996；和Dunn等人，编辑POLYMERIC DRUGS AND DRUGDELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series第469卷，AmericanChemical Society，Washington，D.C.1991)。
示例性策略涉及使用异双功能交联剂SPDP(n-琥珀酰亚胺酰-3-(2-吡啶二硫代)丙酸盐将受保护的巯基掺入糖上，并且随后使巯基脱保护用于与修饰基团上的另一个巯基形成二硫键。
如果SPDP有害地影响经修饰的糖充当糖基转移酶底物的能力，那么许多其他交联剂之一例如2-亚氨基硫烷盐或N-琥珀酰亚胺基S-乙酰硫代乙酸酯(SATA)用于形成二硫键。2-亚氨基硫烷盐与伯胺反应，立即将未受保护的巯基掺入含胺分子上。SATA也与伯胺反应，但掺入受保护的巯基，其随后使用羟胺脱乙酰化以产生游离巯基。在每种情况下，所掺入的巯基自由地与其他巯基或受保护的巯基反应，如SPDP，形成所需二硫键。
上述策略对于在本发明中使用的连接体是示例性的，并且不是限制性的。可以在用于使修饰基团与多肽交联的不同策略中使用的其他交联剂是可用的。例如，TPCH(S-(2-硫代吡啶)-L-半胱氨酸酰肼和TPMPH((S-(2-硫代吡啶)硫氢基-丙酰肼)与碳水化合物部分反应，所述碳水化合物部分先前已通过弱高碘酸盐处理进行氧化，从而形成在交联剂的酰肼部分和高碘酸盐产生的醛之间的腙键。TPCH和TPMPH将受2-吡啶硫酮(pyridylthione)保护的巯基引入糖上，其可以用DTT脱保护并且随后用于缀合，例如在组分之间形成二硫键。
如果发现二硫键合不适合于产生稳定的经修饰的糖，那么可以使用其他交联剂，其在组分之间掺入更稳定的键。异双功能交联剂GMBS(N-γ-马来酰亚胺丁酰氧)琥珀酰亚胺)和SMCC(琥珀酰亚胺酰4-(N-马来酰亚胺-甲基)环己烷)与伯胺反应，因此将马来酰亚胺基团引入组分上。马来酰亚胺基团随后可以与其他组分上的巯基反应，所述巯基可以通过先前提及的交联剂引入，因此在组分之间形成稳定的硫醚键。如果在组分之间的立体阻碍干扰任一组分的活性或经修饰的糖充当糖基转移酶底物的能力，那么可以使用这样的交联剂，其在组分之间引入长间隔臂，并且包括某些先前提及的交联剂的衍生物(即，SPDP)。因此，存在大量合适的有用的交联剂；所述交联剂各自依赖于它对最佳多肽缀合物和经修饰的糖产生的作用进行选择。
多种试剂用于修饰具有分子内化学交联的经修饰的糖的组分(关于交联试剂和交联操作的综述，参见：Wold，F.，Meth.Enzymol.25：623-651，1972；Weetall，H.H.和Cooney，D.A.，In：ENZYMES AS DRUGS.(Holcenberg和Roberts，编辑)第395-442页，Wiley，New York，1981；Ji，T.H.，Meth.Enzymol. 91：580-609，1983；Mattson等人，Mol. Biol. Rep.17：167-183，1993，所有这些参考文献通过引用合并入本文)。优选的交联试剂衍生自多种零长度、同双功能和异双功能交联试剂。零长度的交联试剂包括2个固有化学基团的直接缀合而不引入外来材料。催化二硫键形成的试剂属于这个范畴。另一个例子是诱导羧基和伯氨基缩合以形成酰胺键的试剂，例如碳化二亚胺、氯甲酸乙酯、Woodward′s试剂K(2-乙基-5-苯基异噁唑-3′-磺酸盐)和羰基二咪唑。除这些化学试剂外，酶转谷氨酰胺酶(谷氨酰-肽γ-谷氨酰转肽酶；EC2.3.2.13)也可以用作零长度交联试剂。这种酶催化在蛋白质结合的谷氨酰胺酰残基的甲酰胺基团处的酰基转移反应，通常用伯氨基作为底物。优选的同和异双功能试剂分别包含2个等同或2个不同的位点，其可以对于氨基、巯基、胍基、吲哚或非特异性基团反应。
在交联试剂中优选的特异位点
1.氨基反应性基团
在一个实施方案中，交联剂上的位点是氨基反应性基团。有用的氨基反应性基团的非限制性例子包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、酰亚胺酯、异氰酸酯、酰卤、芳基叠氮化物、对硝基苯基酯、醛和磺酰氯。
NHS酯优先与经修饰的糖组分的伯(包括芳香族)氨基反应。已知组氨酸的咪唑基与伯胺竞争反应，但反应产物是不稳定的且容易水解。反应涉及NHS酯上的酸性羧基上的胺的亲核攻击，以形成酰胺，释放N-羟基琥珀酰亚胺。因此，原始氨基的正电荷丧失。
酰亚胺酯是用于与经修饰的糖组分的氨基反应的最特异的酰化试剂，在7至10的pH下，酰亚胺酯仅与伯胺反应。伯胺亲核攻击亚氨酸酯以产生中间产物，所述中间产物在高pH下分解为脒或在低pH下分解为新亚氨酸酯。新亚氨酸酯可以与另一个伯胺反应，因此使2个氨基交联，假定的单功能亚氨酸酯双功能反应的情况。与伯胺反应的主产物是脒，所述脒是比原始胺更强的碱。原始氨基的正电荷因此被保留。
异氰酸酯(和异硫氰酸酯)与经修饰的糖组分的伯胺反应，以形成稳定的键。它们与巯基、咪唑和酪氨酰基的反应得到相对不稳定的产物。
酰叠氮化物也用作氨基特异性试剂，其中亲和组分的亲核胺在微碱性的条件例如pH 8.5下攻击酸性羧基。
芳基卤例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯优先与经修饰的糖组分的氨基和酪氨酸酚基反应，也与巯基和咪唑基反应。
单和二羧酸的对硝基苯基酯也是有用的氨基反应性基团。尽管试剂特异性不是非常高，但α-和ε-氨基看起来最快速地反应。
醛例如戊二醛与经修饰的糖的伯胺反应。尽管在氨基与醛的醛反应后形成不稳定的希夫碱，但戊二醛能够修饰具有稳定交联的经修饰的糖。在pH 6-8下，一般的交联条件的pH，环状聚合物经历脱水，以形成α-β不饱和的醛聚合物。然而，当与另一个双键缀合时，希夫碱是稳定的。2个双键的共振相互作用阻止希夫连接的水解。此外，在高局部浓度下的胺可以攻击烯双键，以形成稳定的迈克尔加成产物。
芳香族磺酰氯与经修饰的糖组分的多种位点反应，但与氨基的反应是最重要的，导致稳定的磺胺连接。
2.巯基反应性基团
在另一个实施方案中，位点是巯基反应性基团。有用的巯基反应性基团的非限制性例子包括马来酰亚胺、烷基卤、吡啶基二硫化物和硫代苯邻二甲酰亚胺(thiophthalimides)。
马来酰亚胺优先与经修饰的糖组分的巯基反应，以形成稳定的硫醚键。它们还以慢得多的速率与组氨酸的伯氨基和咪唑基反应。然而，在pH 7下，马来酰亚胺基团可以视为巯基特异性基团，因为在这个pH下，简单硫醇的反应速率是相对应的胺的反应速率的1000倍。
烷基卤与巯基、硫化物、咪唑和氨基反应。然而，在中性至微碱性pH下，烷基卤主要与巯基反应，以形成稳定的硫醚键。在较高的pH下，与氨基的反应是有利的。
吡啶基二硫化物经由二硫化物交换与游离巯基反应，以得到混合的二硫化物。因此，吡啶基二硫化物是最特异的巯基反应性基团。
硫代苯邻二甲酰亚胺与游离的巯基反应，以形成二硫化物。
3.羧基反应性残基
在另一个实施方案中，在水和有机溶剂中都可溶的碳化二亚胺用作羧基反应性试剂。这些化合物与游离的羧基反应，形成假尿素，所述假尿素随后可以与可用的胺偶联，得到酰胺连接，如何用碳化二亚胺修饰羧基的教导(Yamada等人，Biochemistry 20：4836-4842，1981)。
在交联试剂中优选的非特异位点
除使用位点特异性的反应性部分外，本发明还考虑了使糖与修饰基团连接的非特异性反应性基团的使用。
示例性非特异性交联剂包括在黑暗中完全惰性的光激活基团，其在吸收合适能量的光子后转变成反应性种类。在一个实施方案中，光激活基团选自在对叠氮化物加热或光解后产生的氮烯的前体。缺电子的氮烯是极端反应性的，并且可以与多种化学键反应，包括N-H、O-H、C-H和C＝C。尽管可以采用3种类型的叠氮化物(芳基、烷基和芳基衍生物)，但酰基叠氮化物是目前。芳基叠氮化物在光解后的反应性对于N-H和O-H优于C-H键。缺电子的芳基氮烯快速环扩展以形成脱氢氮杂，其趋于与亲核体反应，而不是形成C-H插入产物。芳基叠氮化物的反应性可以通过环中的吸电子取代物例如硝基或羟基的存在得到增加。此类取代物将芳基叠氮化物的最大吸收推至较长波长。未取代的芳基叠氮化物具有在260-280nm范围中的最大吸收，而羟基和硝基芳基叠氮化物吸收超过305nm的显著光。因此，羟基和硝基芳基叠氮化物是最优选的，因为它们允许采用比未取代的芳基叠氮化物更不有害的光解条件用于亲和组分。
在另一个优选实施方案中，光激活基团选自氟化的芳基叠氮化物。氟化的芳基叠氮化物的光解产物是芳基氮烯，所有这些以高效率经历这个基团的特征性反应，包括C-H键插入(Keana等人，J.Org.Chem.55：3640-3647，1990)。
在另一个实施方案中，光激活基团选自二苯甲酮残基。二苯甲酮试剂一般得到比芳基叠氮化物试剂更高的交联得率。
在另一个实施方案中，光激活基团选自重氮化合物，其在光解后形成缺电子的碳烯。这些碳烯经历多种反应，包括插入C-H键内，加至双键(包括芳香族系统)、氢吸引和对于亲核中心的配位以得到碳离子。
在另外一个实施方案中，光激活基团选自重氮基丙酮酸盐。例如，对硝基苯基重氮基丙酮酸盐的对硝基苯基酯与脂肪族胺反应，以得到重氮基丙酮酸酰胺，其经历紫外线关节以形成醛。光解的重氮基丙酮酸盐经修饰的亲和组分将如同甲醛或戊二醛反应，形成交联。
同双功能试剂
1.与伯胺反应的同双功能交联剂
胺反应性交联剂的合成、性质和应用在文献中在商业上描述(关于交联操作和试剂的综述，参见上文)。许多试剂是可用的(例如，PierceChemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR.)。
同双功能NHS酯的优选的非限制性例子包括二琥珀酰亚胺基戊二酸盐(DSG)、二琥珀酰亚胺基辛二酸盐(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸盐(BS)、二琥珀酰亚胺基酒石酸盐(DST)、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸盐(磺基-DST)、双-2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙砜(BSOCOES)、双-2-(磺基琥珀酰亚胺氧基-羰基氧基)乙砜(磺基-BSOCOES)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸盐)(EGS)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸盐)(磺基-EGS)、二巯基二(琥珀酰亚胺基-丙酸盐(DSP)、和二巯基二(磺基琥珀酰亚胺基丙酸盐(磺基-DSP)。优选的同双功能酰亚胺酯的非限制性例子包括马来酰亚氨酸二甲酯(dimethyl malonimidate)(DMM)、琥珀酰亚氨酸二甲酯(dimethylsuccinimidate)(DMSC)、二甲基己二酸(DMA)、庚二亚氨酸二甲酯(dimethyl pimelimidate)(DMP)、二甲基辛二酸盐(DMS)、3，3′-氧基二丙亚氨酸二甲酯(dimethyl-3，3′-oxydipropionimidate)(DODP)、3，3′-(亚甲基二氧基)二丙亚氨酸二甲酯(DMDP)、3′-(二亚甲基二氧基)二丙亚氨酸二甲酯(DDDP)、3，3′-(四亚甲基二氧基)二丙亚氨酸二甲酯(DTDP)、和3，3′-二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)。
同双功能异硫氰酸酯的优选的非限制性例子包括：对亚苯基二异硫氰酸酯(DITC)、和4，4′-二异硫代氰基-2，2′-二磺酸均二苯乙烯(DIDS)。
同双功能异氰酸酯的优选的非限制性例子包括二异氰酸二甲苯酯、2，4-二异氰酸甲苯酯、2-异氰酸酯-4-异硫氰酸甲苯酯、3-甲氧基二苯基甲烷-4，4′-二异氰酸酯、2，2′-二羧基-4，4′-偶氮苯基二异硫氰酸酯、和己二异氰酸酯。
同双功能芳基卤的优选的非限制性例子包括1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)、和4，4′-二氟-3，3′-二硝基苯基-砜。
同双功能脂肪族醛试剂的优选的非限制性例子包括乙二醛、丙二醛和戊二醛。
同双功能酰化试剂的优选的非限制性例子包括二羧酸的硝基苯基酯。
同双功能芳香族磺酰氯的优选的非限制性例子包括苯酚-2，4-二磺酰氯、和α-萘酚-2，4-二磺酰氯。
另外的氨基反应性同双功能试剂的优选的非限制性例子包括赤藓醇二碳酸酯，其与胺反应以产生二氨基甲酸酯。
2.与游离的巯基反应的同双功能交联剂
此类试剂的合成、性质和应用在文献中描述(关于交联操作和试剂的综述，参见上文)。许多试剂是商购可得的(例如，Pierce ChemicalCompany，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR.)。
同双功能马来酰亚胺的优选的非限制性例子包括双马来酰亚胺己烷(BMH)、N，N′-(1，3-亚苯基)双马来酰亚胺、N，N′-(1，2-亚苯基)双马来酰亚胺、偶氮苯基二马来酰亚胺、和双(N-马来酰亚胺甲基)醚。
同双功能吡啶基二硫化物的优选的非限制性例子包括1，4-二-3′-(2′-吡啶基二硫代)丙酰胺丁烷(DPDPB)。
同双功能烷基卤的优选的非限制性例子包括2，2′-二羧基-4，4′-二碘乙酰胺偶氮苯、α，α′-二碘-对二甲苯磺酸、α，α′-二溴-对二甲苯磺酸、N，N′-双(b-溴乙基)苯甲胺、N，N′-双(溴乙酰)苯肼、和1，2-二(溴乙酰)氨基-3-苯基丙烷。
3.同双功能光激活交联剂
此类试剂的合成、性质和应用在文献中描述(关于交联操作和试剂的综述，参见上文)。某些试剂是商购可得的(例如，Pierce ChemicalCompany，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR.)。
同双功能光激活交联剂的优选的非限制性例子包括双-β-(4-叠氮水杨氨基)乙基二硫化物(BASED)、二-N-(2-硝基-4-叠氮苯基)-胱胺-S，S-二氧化物(DNCO)、和4，4′-二硫代双苯基叠氮化物。
异双功能试剂
1.具有吡啶基二硫化物部分的氨基反应性异双功能试剂
此类试剂的合成、性质和应用在文献中描述(关于交联操作和试剂的综述，参见上文)。许多试剂是商购可得的(例如，Pierce ChemicalCompany，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR.)。
具有吡啶基二硫化物部分和氨基反应性NHS酯的异双功能试剂的优选的非限制性例子包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基6-3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺己酸酯(LC-SPDP)、磺基琥珀酰亚胺基6-3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺己酸酯(磺基LCSPDP)、4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(SMPT)、和磺基琥珀酰亚胺基6-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯酰胺己酸酯(磺基-LC-SMPT)。
2.具有马来酰亚胺部分的氨基反应性异双功能试剂
此类试剂的合成、性质和应用在文献中描述。具有马来酰亚胺部分和氨基反应性NHS酯的异双功能试剂的优选的非限制性例子包括琥珀酰亚胺基马来酰亚胺基乙酸酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基3-马来酰亚胺基丙酸酯(BMPS)、N-γ-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、N-γ-马来酰亚胺丁酰氧基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBS)、琥珀酰亚胺基6-马来酰亚胺基己酸酯(EMCS)、琥珀酰亚胺基3-马来酰亚胺基苯甲酸酯(SMB)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBS)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)、琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB)、和磺基琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺苯基)丁酸酯(磺基-SMPB)。
3.具有烷基卤部分的氨基反应性异双功能试剂
此类试剂的合成、性质和应用在文献中描述。具有烷基卤部分和氨基反应性NHS酯的异双功能试剂的优选的非限制性例子包括N-琥珀酰亚胺基-(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(SIAB)、磺基琥珀酰亚胺基-(4-碘乙酰)氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、琥珀酰亚胺基-6-(碘乙酰)氨基己酸酯(SIAX)、琥珀酰亚胺基-6-(6-((碘乙酰)-氨基)己酰氨基)己酸酯(SIAXX)、琥珀酰亚胺基-6-(((4-(碘乙酰)-氨基)-甲基)-环己烷-1-羰基)氨基己酸酯(SIACX)、和琥珀酰亚胺基-4((碘乙酰)-氨基)甲基环己烷-1-羧酸酯(SIAC)。
具有氨基反应性NHS酯和烷基卤部分的异双功能试剂的例子是N-羟基琥珀酰亚胺基2，3-二溴丙酸酯(SDBP)。SDBP通过使其氨基缀合而将分子内交联引入至亲和组分。二溴丙酰基部分对于伯胺基团的反应性受反应温度控制(McKenzie等人，Protein Chem.7：581-592(1988))。
具有烷基卤部分和氨基反应性对硝基苯基酯部分的异双功能试剂的优选的非限制性例子包括对硝基苯基碘乙酸酯(NPIA)。
其他交联试剂的本领域技术人员已知的。参见例如，Pomato等人，美国专利号5,965,106。选择合适的交联试剂用于特定应用在本领域技术人员的能力内。
可切割的连接体基团
在另外一个进一步的实施方案中，提供了具有这样的基团的连接体基团，所述基团可以进行切割，以释放来自糖残基的修饰基团。许多可切割的基团是本领域已知的。参见例如，Jung等人，Biochem.Biophys.Acta 761：152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol. Chem.265：14518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.124：913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.155：141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.261：205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.143：1859-1867(1989)。此外，广泛范围的可切割的、双功能(同和异双功能的)连接体基团从供应商例如Pierce商购可得。
示例性可切割部分可以使用光、热或试剂例如硫醇、羟胺、碱、高碘酸盐等进行切割。此外，特定的优选基团在体内响应内吞而被切割(例如，顺式-乌头；参见Shen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.102：1048(1991))。优选的可切割基团包括可切割部分，其是选自二硫化物、酯、酰亚胺、碳酸酯、硝基苯甲基、苯甲酰甲基和苯偶姻基团的成员。
根据本发明的反应性PEG试剂的具体实施方案包括：
以及这些种类的碳酸酯和活性酯，例如：
核酸
在另一个方面，本发明提供了编码本发明的多肽的经分离的核酸。多肽在其氨基酸序列内包括一个或多个本发明的外源N联糖基化序列。在一个实施方案中，本发明的核酸是表达载体的部分。在另一个相关实施方案中，本发明提供了包括本发明的核酸的细胞。示例性细胞包括宿主细胞，例如大肠杆菌的各种菌株、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞例如CHO细胞。
药物组合物
本发明的多肽缀合物具有广泛范围的药学应用。例如，糖缀合的促红细胞生成素(EPO)可以用于治疗一般性贫血、再生障碍性贫血、化学诱导的损伤(例如，对骨髓的损伤)、慢性肾衰竭、肾炎和地中海贫血。经修饰的EPO可以进一步用于治疗神经性障碍，例如脑/脊柱损伤、多发性硬化症和阿尔茨海默氏病。
第二个例子是干扰素-α(IFN-α)，其可以用于治疗AIDS和乙型或丙型肝炎，由多种病毒引起的病毒感染，所述病毒例如人乳头状瘤病毒(HBV)、冠状病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)和水痘带状疱疹病毒(VZV)，癌症例如多毛细胞白血病、AIDS相关的卡波济肉瘤、恶性黑色素瘤、滤泡状非霍奇金淋巴瘤、Philladephia染色体(Ph)阳性、慢性期髓性白血病(CML)、肾癌、骨髓瘤、慢性髓性白血病、头与颈癌、骨癌、以及宫颈发育不良和中枢神经系统(CNS)病症例如多发性硬化症。此外，根据本发明的方法修饰的IFN-α用于治疗各种其他疾病和病状，例如Sjogren’s综合征(自身免疫疾病)、白塞氏(Behcet′s)病(自身免疫炎性疾病)、纤维肌痛(肌肉骨骼疼痛/疲劳病症)、口疮性溃疡(口疮)、慢性疲劳综合征和肺纤维化。
另一个例子是干扰素-β，其用于治疗CNS病症，例如多发性硬化症(复发/缓解型或慢性进展型)，AIDS和乙型或丙型肝炎，由多种病毒引起的病毒感染，所述病毒例如人乳头状瘤病毒(HBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)和水痘带状疱疹病毒(VZV)，耳感染，肌肉骨骼感染，以及癌症包括乳腺癌、脑癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、头与颈癌、基底细胞癌、宫颈发育不良、黑色素瘤、皮肤癌和肝癌。根据本发明的方法修饰的IFN-β也用于治疗其他疾病和病状，例如移植排斥(例如，骨髓移植)、亨廷顿舞蹈病、大肠炎、脑炎症、肺纤维化、黄斑变性、肝硬化和角膜结膜炎。
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是进一步的例子。根据本发明的方法修饰的G-CSF可以在用于治疗癌症的化学治疗中用作助剂(adjunct)，并且用于预防或减轻与特定医学操作相关的病状或并发症，例如化学诱导的骨髓损伤；白血球减少症(一般性的)；化学诱导的热性嗜中性白血球减少症；与骨髓移植相关的嗜中性白血球减少症；和严重的慢性嗜中性白血球减少症。经修饰的G-CSF还可以用于移植；外周血细胞动员；在将接受骨髓根除或骨髓抑制化学治疗的患者中的外周血祖细胞动员用于收集；和嗜中性白血球减少症持续时间中的减少、发热、抗生素使用、关于急性髓样白血病(AML)的诱导/巩固治疗后的住院治疗。可以用经修饰的G-CSF治疗的其他病状或病症包括哮喘和变应性鼻炎。
作为一个另外的例子，根据本发明的方法修饰的人生长激素(hGH)可以用于治疗生长相关病状，例如侏儒症、儿童和成人中的身材矮小症、恶病质/肌肉消耗、一般性肌肉萎缩、和性染色体异常(例如，特纳(Turner′s)综合征)。可以使用经修饰的hGH治疗的其他病状包括：短肠综合征、脂营养不良、骨质疏松症、尿毒症、烧伤、女性不孕症、骨再生、一般性糖尿病、II型糖尿病、骨关节炎、慢性阻塞性肺病(COPD)和失眠。此外，经修饰的hGH还可以用于促进各种过程，例如一般的组织再生、骨再生和伤口愈合，或作为疫苗助剂。
因此，在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包括本发明的至少一种多肽或多肽缀合物和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括稀释剂、媒介物、助剂及其组合。在一个示例性实施方案中，药物组合物包括在水溶性聚合物(例如，非天然存在的水溶性聚合物)和本发明的糖基化或非糖基化多肽之间的共价缀合物和药学上可接受的稀释剂。
本发明的药物组合物适合于在各种药物递送系统中使用。用于在本发明中使用的合适制剂在Remington′s Pharmaceutical Sciences，MacePublishing Company，Philadelphia，PA，第17版(1985)中发现。关于用于药物递送的方法的简要综述，参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)。
药物组合物可以配制用于任何合适的施用方式，包括例如局部、经口、鼻、静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌内施用。对于肠胃外施用，例如皮下注射，载体优选包括水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲剂。对于经口施用，可以采用任何上述载体或固体载体，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。生物可降解的基质例如微球体(例如，聚乳酸盐聚乙醇酸盐)也可以用作载体用于本发明的药物组合物。合适的生物可降解的微球体例如在美国专利号4,897,268和5,075,109中公开。
通常，药物组合物皮下或肠胃外例如静脉内施用。因此，本发明提供了用于肠胃外施用的组合物，其包括在可接受的载体中溶解或悬浮的化合物，所述可接受的载体优选水载体，例如水、缓冲水、盐水、PBS等。组合物还可以包含洗涤剂例如Tween 20和Tween 80；稳定剂例如甘露醇、山梨糖醇、蔗糖和海藻糖；和防腐剂例如EDTA和间甲酚。需要时，组合物可以包含药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，例如pH调整和缓冲剂、张力调整剂、湿润剂、洗涤剂等。
这些组合物可以通过常规灭菌技术进行灭菌，或可以进行无菌过滤。所得到的水溶液可以经包装用于使用或冻干，冻干制剂在施用前与无菌水载体相组合。制剂的pH一般为3至11，更优选5至9，并且最优选7至8。
在某些实施方案中，本发明的糖肽可以掺入由标准囊泡成型脂质形成的脂质体内。多种方法可用于制备脂质体，如例如Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)，美国专利号4,235,871、4,501,728和4,837,028中描述的。脂质体使用多种靶向试剂(例如，本发明的唾液酸酰半乳糖苷)的靶向是本领域众所周知的(参见例如，美国专利号4,957,773和4,603,044)。
可以使用用于使靶向试剂与脂质体偶联的标准方法。这些方法一般涉及将脂质组分例如磷脂酰乙醇胺(其可以活化用于附着靶向试剂)或经衍生的亲脂化合物例如本发明的脂质衍生的糖肽掺入脂质体内。
靶向机制一般要求靶向试剂以这样的方式放置在脂质体的表面上，使得靶部分可用于与靶例如细胞表面受体相互作用。在使用本领域技术人员已知的方法形成脂质体前(例如，碳水化合物上存在的羟基分别用长链烷基卤或用脂肪酸的烷基化或酰化)，本发明的碳水化合物可以与脂质分子附着。备选地，脂质体可以以这样的方式形成，使得在形成膜时接头部分首先掺入膜内。接头部分必须具有亲脂部分，其牢固地嵌入且锚定在膜中。还必须具有反应性部分，其在脂质体的水表面上化学可用。反应性部分这样进行选择，使得它以化学方法适合于与随后添加的靶向试剂或碳水化合物形成稳定的化学键。在某些情况下，可以使靶试剂与接头分子直接附着，但在大多数情况下，使用第三种分子充当化学桥是更合适的，从而使在膜中的接头分子与从囊泡表面三维延伸出的靶试剂或碳水化合物连接。
通过本发明的方法制备的化合物还可以用作诊断性试剂。例如，经标记的化合物可以用于定位怀疑具有炎症的患者中的炎症或肿瘤转移区域。对于这个用途，化合物可以用可检测同位素例如125I、14C或氘进行标记。在另一个例子中，化合物用发光部分例如镧系元素复合物进行标记。
本发明的示例性缀合物
在一个实施方案中，本发明的缀合物包括选自下述的部分：
其中AA衍生自包括氨基的氨基酸残基。这个氨基酸残基是多肽的部分。在一个例子中，AA衍生自天冬酰胺残基。Q、La和R6c如本文上文定义。Q1是H、单个负电荷或阳离子(例如，Na+或K+)。A和B是独立地选自OR(例如，OH)和NHCOR(例如，NHAc)的成员。
在根据上述实施方案中的任何的一个例子中，缀合物包括选自下述的部分：
V.方法
多肽的产生
产生多肽(例如，通过重组技术)的方法是本领域已知的。示例性方法在本文中描述。示例性方法包括：(i)产生包括编码多肽的核酸序列的表达载体，所述多肽具有外源N联糖基化序列。该方法可以进一步包括：(ii)用表达载体转染宿主细胞。该方法可以进一步包括：(iii)在宿主细胞中表达多肽。该方法可以进一步包括：(iv)分离多肽。该方法可以进一步包括：(v)例如使用内源或重组寡糖基转移酶，使多肽在N联糖基化序列处酶促糖基化。示例性糖基转移酶例如细菌PglB在本文中描述。
多肽缀合物的形成
在另一个方面，本发明提供了形成修饰基团和多肽之间的共价缀合物的方法。本发明的多肽缀合物在糖基化或非糖基化的多肽和各种种类例如水溶性聚合物、治疗性部分、生物分子、诊断性部分、靶向部分等之间形成。聚合物、治疗性部分或生物分子经由糖基连接基团与多肽缀合，所述糖基连接基团插入多肽和修饰基团(例如，水溶性聚合物)之间，并且与多肽和修饰基团共价连接。
多肽的无细胞的体外糖基化
在一个实施方案中，多肽的糖基化和/或糖基PEG化在体外执行。例如，多肽在宿主细胞中进行合成或表达并且任选进行纯化。随后对多肽实施涉及本发明的糖基供体种类(例如，十一异戊烯-焦磷酸盐连接的糖基部分)以及合适的寡糖基转移酶的糖基化或糖基PEG化。
在一个实施方案中，在糖基供体种类是其底物的寡糖基转移酶的存在下，通过使多肽与糖基供体种类相接触，使多肽与修饰基团共价连接，其中糖基供体种类的至少一个糖基供体部分与修饰基团共价连接。因此，在一个示例性实施方案中，本发明提供了形成多肽和修饰基团(例如，聚合修饰基团)之间的共价缀合物的无细胞的体外方法。在这种方法中，多肽包括本发明的N联糖基化序列，所述本发明的N联糖基化序列包括天冬酰胺残基。修饰基团经由糖基连接基团在天冬酰胺残基处与多肽共价连接，所述糖基连接基团插入多肽和修饰基团之间，并且与多肽和修饰基团共价连接。该方法包括：在寡糖基转移酶的存在下，在足以使寡糖基转移酶将糖基部分从糖基供体种类转移到N联糖基化序列的天冬酰胺残基上的条件下，使多肽和本发明的糖基供体种类相接触。该方法可以进一步包括：例如通过重组技术或化学合成产生多肽。用于产生多肽的方法在本文中描述。该方法可以进一步包括：分离共价缀合物。在一个实施方案中，多肽与其为治疗多肽的亲本多肽相对应。示例性亲本多肽在本文中描述。
在宿主细胞内的糖基化
包括本发明的N联糖基化序列的多肽的糖基化也可以在宿主细胞内发生，多肽在所述宿主细胞中表达。在一个实施方案中，使宿主细胞与本发明的合适的糖基供体种类相接触，并且内在化本发明的合适的糖基供体种类。例如，将糖基供体种类加入用于培养宿主细胞的细胞培养基中。在宿主细胞内的寡糖基转移酶使用经内在化的糖基供体种类作为底物，并且将糖基部分转移到所表达的多肽上。在一个实施方案中，通过使宿主细胞与糖基供体种类相接触，这种细胞内糖基化用于使修饰基团与多肽共价连接，所述糖基供体种类包括用修饰基团衍生的糖基部分。因此，本发明提供了形成多肽和修饰基团(例如，聚合修饰基团)之间的共价缀合物的方法，其中多肽包括N联糖基化序列，所述N联糖基化序列包括天冬酰胺残基。修饰基团经由糖基连接基团在天冬酰胺残基处与多肽共价连接，所述糖基连接基团插入多肽和修饰基团之间，并且与多肽和修饰基团共价连接。该方法包括：(i)在寡糖基转移酶的存在下，在足以使寡糖基转移酶将与修饰基团共价连接的糖基部分从糖基供体种类转移到N联糖基化序列的天冬酰胺残基上的条件下，使多肽和本发明的糖基供体种类相接触，其中接触在多肽在其中表达的宿主细胞内发生。该方法可以进一步包括(ii)使宿主细胞与本发明的糖基供体种类相接触。该方法可以进一步包括(iii)在足以使宿主细胞内在化糖基供体种类的条件下温育宿主细胞。该方法可以进一步包括(iii)例如通过重组技术或化学合成产生多肽。用于产生多肽的方法在本文中描述。该方法可以进一步包括(iv)分离共价缀合物。在一个实施方案中，多肽与其为治疗多肽的亲本多肽相对应。示例性亲本多肽在本文中描述。
在一个例子中，宿主细胞包括内源寡糖基转移酶，其能够使用经内在化的糖基供体种类作为底物，并且可以将糖基供体种类的糖基部分细胞内转移到多肽上。
在另一个示例性实施方案中，寡糖基转移酶是重组酶，并且连同多肽一起在宿主细胞中共表达。随后通过共表达寡糖基转移酶完成细胞内糖基化，所述寡糖基转移酶可以使用所表达的多肽作为底物。使用经内在化的糖基供体种类作为糖基底物，所述酶能够在糖基化序列处细胞内地糖基化多肽。
宿主细胞可以是适合于表达多肽的任何细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是细菌细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
测定多肽是否有效糖基化的方法是可用的。例如，通过质谱法分析细胞裂解物(在一个或多个样品制备步骤后)，以测量糖基化和非糖基化多肽之间的比。在另一个例子中，通过凝胶电泳来分析细胞裂解物，所述凝胶电泳使糖基化与非糖基化多肽分离。
在另一个示例性实施方案中，多肽在其中表达的微生物具有细胞内氧化环境。微生物可以进行遗传修饰，以具有细胞内氧化环境。细胞内糖基化并不限于单个糖基残基的转移。通过所需酶的共表达和分别的糖基供体的存在可以顺次添加几个糖基残基。这种方法还可以用于在商业规模上生产多肽。示例性技术在2006年9月6日提交的美国临时专利申请号60/842,926中描述，所述美国临时专利申请通过引用整体合并入本文。宿主细胞可以是原核微生物，例如大肠杆菌或假单胞菌属菌株)。在一个示例性实施方案中，宿主细胞是trxB gor supp突变型大肠杆菌细胞。
作为寡糖基转移酶的底物的序列子多肽的鉴定
用于鉴定序列子多肽(当使用酶和糖基供体种类实施糖基化反应时，其可以以满意的得率进行糖基化)的一个策略是制备序列子多肽的文库，其中每个序列子多肽包括至少一个本发明的外源N联糖基化序列，并且就其充当寡糖基转移酶的有效底物的能力测试每个序列子多肽。通过在亲本多肽的氨基酸序列内的不同位置处包括所选择的本发明的N联糖基化序列，可以产生序列子多肽的文库。
序列子多肽的文库
在一个方面，本发明提供了产生序列子多肽的一个或多个文库的方法，其中序列子多肽与亲本多肽(例如，野生型多肽)相对应。在一个实施方案中，亲本多肽具有包括m个氨基酸的氨基酸序列。产生序列子多肽的文库的示例性方法包括步骤：(i)通过在亲本多肽内的第一氨基酸位置(AA)n处引入本发明的N联糖基化序列，产生第一序列子多肽(例如，重组、化学或通过其他方法)，其中n是选自1至m的成员；(ii)通过在另外的氨基酸位置处引入N联糖基化序列，产生至少一个另外的序列子多肽。在一个实施方案中，另外的氨基酸位置处是(AA)n+x’例如(AA)n+1。在另一个实施方案中，另外的氨基酸位置处是(AA)n-x’例如(AA)n-1。在这些实施方案中，x是选自1至(m-n)的成员。在一个实施方案中，另外的序列子多肽包括与第一序列子多肽相同的N联糖基化序列。在另一个实施方案中，另外的序列子多肽包括与第一序列子多肽不同的N联糖基化序列。在一个示例性实施方案中，通过本文上文描述的“序列子扫描”产生序列子多肽的文库。在本发明的文库中有用的示例性亲本多肽和N联糖基化序列也在本文中描述。
引导多肽的鉴定
可能希望在文库的成员中选择这样的多肽，当实施酶促糖基化和/或糖基PEG化反应时，所述多肽是有效糖基化和/或糖基PEG化的。发现其是有效糖基化和/或糖基PEG化的序列子多肽被称为“引导多肽”。在一个示例性实施方案中，酶促糖基化或糖基PEG化反应的得率用于选择一种或多种引导多肽。在另一个示例性实施方案中，关于引导多肽的酶促糖基化或糖基PEG化的得率为约10％至约100％，优选约30％至约100％，更优选约50％至约100％，并且最优选约70％至约100％。当多肽包括超过一个N联糖基化序列时，那么对于每个N联糖基化序列分开测定得率。例如通过对经糖基化的引导多肽实施另一个酶促糖基化或糖基PEG化反应，任选进一步评估可以有效糖基化的引导多肽。
因此，本发明提供了用于鉴定引导多肽的方法。示例性方法包括步骤：(i)产生本发明的序列子多肽的文库；(ii)对文库的至少一个成员实施酶促糖基化反应(或任选地酶促糖基PEG化反应)。在一个实施方案中，在这个反应过程中，糖基部分从糖基供体分子转移到至少一个N联糖基化序列上，其中糖基部分任选由修饰基团进行衍生。该方法可以进一步包括：(iii)测量关于文库的至少一个成员的关于酶促糖基化或糖基PEG化反应的得率。测量可以使用本领域已知的任何方法和本文下文描述的方法来完成。该方法可以在步骤(ii)前进一步包括：(iv)纯化文库的至少一个成员。
步骤(ii)经转移的糖基部分可以是任何糖基部分，包括单糖和寡糖以及糖基模拟基团，其任选由修饰基团例如水溶性聚合修饰基团进行衍生。在一个示例性实施方案中，在起始糖基化反应中加入序列子多肽中的糖基部分是GlcNAc部分、GalNAc部分、GlcNAc-GlcNAc部分或6-羟基-bacilloseamine部分。后续糖基化反应可以任选地用于将至少一个另外的糖基残基(例如经修饰的Sia部分)加入所得到的糖基化的多肽中。修饰基团可以是本发明的任何修饰基团，包括水溶性聚合物例如mPEG。在一个实施方案中，步骤(ii)的酶促糖基化反应在多肽在其中表达的宿主细胞中发生。该方法可以进一步包括(v)：对步骤(ii)的产物实施PEG化反应。在一个实施方案中，步骤(ii)和步骤(v)在相同反应容器中执行。在一个实施方案中，PEG化反应是酶促糖基PEG化反应。在另一个实施方案中，PEG化反应是化学PEG化反应。该方法可以进一步包括：(vi)测量关于PEG化反应的得率。用于测量PEG化反应的得率的方法在下文描述。该方法可以进一步包括：(vii)产生包括编码序列子多肽的核酸序列的表达载体。该方法可以进一步包括：(viii)：用表达载体转染宿主细胞。
在一个示例性实施方案中，对序列子多肽的文库的每个成员实施酶促糖基化反应。例如，对每个序列子多肽分开实施糖基化反应，并且测定关于一种或多种所选择的反应条件的糖基化反应的得率。
在一个示例性实施方案中，在进一步加工例如糖基化和/或糖基PEG化前，纯化文库的一个或多个序列子多肽。
在另一个例子中，序列子多肽的组可以相组合，并且可以对所得到的序列子多肽混合物实施糖基化或糖基PEG化反应。在一个示例性实施方案中，对包含文库的所有成员的混合物实施糖基化反应。在一个例子中，根据这个实施方案，糖基供体试剂可以以少于化学计量(就存在的糖基化位点而言)加入糖基化反应混合物中，产生其中序列子多肽竞争作为酶的底物的环境。例如通过质谱分析连同或不连同糖基化混合物的先前分离或纯化，随后可以鉴定其为酶的底物的这些序列子多肽。这个相同方法可以用于各自包含本发明的不同O联糖基化序列的一组序列子多肽。
使用本领域已知的任何合适的方法，可以测定关于酶促糖基化反应、酶促糖基PEG化反应或化学糖基PEG化反应的得率。在一个示例性实施方案中，用于区分糖基化或糖基PEG化的多肽和未反应(例如，非糖基化或糖基PEG化的)多肽的方法使用涉及质谱法的技术(例如，LC-MS、MALDI-TOF)进行测定。在另一个示例性实施方案中，使用涉及凝胶电泳的技术测定得率。在另外一个示例性实施方案中，使用涉及核磁共振(NMR)的技术测定得率。在一个进一步的示例性实施方案中，使用涉及色谱法的技术例如HPLC或GC测定得率。在一个实施方案中，多孔平板(例如，96孔平板)用于平行执行多个糖基化反应。平板可以任选在每个孔的底部配备分离或过滤介质(例如，凝胶过滤膜)。在通过质谱法或其他方法分析前，旋转可以用于预处理每种样品。
目的序列子多肽(例如，所选择的引导多肽)可以在工业规模上表达(例如，导致超过250mg、优选超过500mg蛋白质的分离)。
引导多肽的进一步评估
在一个实施方案中，其中起始筛选操作涉及使用未经修饰的糖基部分(例如，GlcNAc部分的转移)的酶促糖基化，所选择的引导多肽可以就其成为用于进一步修饰(例如通过另一个酶促反应或化学修饰)的有效底物的能力进行进一步评估。在一个示例性实施方案中，后续“筛选”涉及对糖基化的引导多肽实施另一个糖基化和/或PEG化反应。
PEG化反应可以例如是化学PEG化反应或酶促糖基PEG化反应。为了鉴定被有效糖基PEG化的引导多肽，对至少一个引导多肽(任选先前糖基化的)实施PEG化反应，并且测定关于这个反应的得率。在一个例子中，测定关于每个引导多肽的PEG化反应得率。在一个示例性实施方案中，关于PEG化反应的得率为约10％至约100％，优选约30％至约100％，更优选约50％至约100％，并且最优选约70％至约100％。PEG化得率可以使用本领域已知的任何分析方法进行测定，所述分析方法适合于多肽分析，例如质谱法(例如，MALDI-TOF、Q-TOF)、凝胶电泳(例如，与用于定量的方法例如光密度法相组合)、NMR技术以及色谱法，例如使用用于分离所分析多肽的PEG化和非PEG化种类的合适柱材料的HPLC。如上文对于糖基化所述，多孔平板(例如，96孔平板)用于平行执行多个PEG化反应。平板可以任选在每个孔的底部配备分离或过滤介质(例如，凝胶过滤膜)。在通过质谱法或其他方法分析前，旋转可以用于预处理每种样品。
在另一个示例性实施方案中，序列子多肽的糖基化和糖基PEG化在如下所述的“单罐(one pot)反应”中发生。在一个例子中，使序列子多肽与第一种酶(例如，GalNAc-T2)和合适的供体分子(例如，UDP-GalNAc)相接触。在加入第二种酶(例如，Core-1-GalT1)和第二种糖基供体(例如，UDP-Gal)前，使混合物温育合适的时间量。任何数目的另外糖基化/糖基PEG化反应可以以这种方式执行。备选地，超过一种酶和超过一种糖基供体可以与突变型多肽相接触，以在一个反应步骤中加入超过一个糖基残基。例如，在合适的缓冲系统中使突变型多肽与3种不同的酶(例如，GalNAc-T2、Core-1-GalT1和ST3Gal1)和3种不同的糖基供体种类(例如，UDP-GalNAc、UDP-Gal和CMP-SA-PEG)相接触，以产生糖基PEG化突变型多肽，例如多肽-GalNAc-Gal-SA-PEG(参见，实施例4.6)。总体得率可以使用上文描述的方法进行测定。
去除糖基部分
本发明还提供了将一个或多个所选择的糖基残基加入多肽(或从中去除)的方法，这之后使经修饰的糖与多肽的至少一个所选择的糖基残基缀合。例如，当希望使经修饰的糖与所选择的糖基残基缀合时，所述糖基残基既不存在于多肽上也不以所需量存在，当前实施方案是有用的。因此，在使经修饰的糖与多肽偶联前，通过酶促或化学偶联使所选择的糖基残基与多肽缀合。在另一个实施方案中，通过从糖肽中去除碳水化合物残基，在经修饰的糖缀合前改变糖肽的糖基化模式。参见例如，WO 98/31826。
化学或酶促完成糖肽上存在的任何碳水化合物部分的添加或去除。化学去糖基化优选通过使多肽暴露于三氟甲磺酸或等价化合物来实现。这种处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)外的大多数或所有糖的切割，同时使多肽保持完整。化学去糖基化由Hakimuddin等人，Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987)和Edge等人，Anal.Biochem.118：131(1981)描述。多肽变体上的碳水化合物部分的酶促切割通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，如由Thotakura等人，Meth.Enzymol.138：350(1987)描述的。
通过任何领域公认的方法执行糖基部分的化学添加。糖部分的酶促添加优选使用本文所述方法的修饰来实现，置换关于本发明中使用的经修饰的糖的天然糖基单位。添加糖部分的其他方法公开于美国专利号5,876,980；6,030,815；5,728,554和5,922,577中。在本发明中使用的示例性方法在1987年9月11日公开的WO 87/05330中以及在Aplin和Wriston，CRC CRIT.REV.BIOCHEM.，第259-306页(1981)中描述。
包括2个或更多个多肽的多肽缀合物
还提供的是包括通过连接臂连接在一起的2个或更多个多肽的缀合物，即多功能缀合物；至少一个多肽是N-糖基化的或包括外源N联糖基化序列。本发明的多功能缀合物可以包括相同多肽的2个或更多个拷贝或具有不同结构和/或性质的各种多肽的集合。在根据这个实施方案的示例性缀合物中，2个多肽之间的连接体通过N联糖基残基(例如N联糖基完整的糖基连接基团)与至少一个多肽附着。
在一个实施方案中，本发明提供了通过连接基团用于使2个或更多个多肽连接的方法。连接基团具有任何有用的结构，并且可以选自直链和支链结构。优选地，与多肽附着的连接体的每个末端包括经修饰的糖(即，新生的完整的糖基连接基团)。在一个实施方案中，通过使用糖基供体种类来完成2个多肽的连接，所述糖基供体种类用多肽进行修饰。
经修饰的糖与多肽的酶促缀合
使用合适的酶介导缀合，使经修饰的糖与糖基化的多肽缀合。优选地，这样选择一种或多种经修饰的供体糖、一种或多种酶和一种或多种受体多肽的浓度，使得糖基化进行直至耗尽受体时。在唾液酸转移酶的背景中阐述的下文讨论的考虑一般可应用于其他糖基转移酶反应。
使用糖基转移酶合成所需寡糖结构的许多方法是已知的，并且一般可应用于本发明。示例性方法例如在WO 96/32491和Ito等人，Pure Appl.Chem.65：753(1993)以及美国专利号5,352,670；5,374,541和5,545,553中描述。
本发明使用单一糖基转移酶或糖基转移酶的组合进行实践。例如，可以使用唾液酸转移酶和半乳糖基转移酶的组合。在使用超过一种酶的实施方案中，酶和底物优选在起始反应混合物中相组合，或在第一酶促反应完成或接近反应后，将关于第二酶促反应的酶和试剂加入反应介质中。通过在单个容器中顺次进行2个酶促反应，总体得率改善超过其中分离中间产物种类的操作。此外，额外溶剂和副产物的清除和处置得到减少。
本发明的缀合物的O联糖基部分一般由GalNAc部分起始，所述GalNAc部分与多肽附着。GalNAc转移酶家族的任何成员(例如，本文在表13中描述的那些)都可以用于使GalNAc部分与多肽结合(参见例如，Hassan H，Bennett EP，Mandel U，Hollingsworth MA和Clausen H(2000)；and Control of Mucin-Type O-Glycosylation：O-Glycan Occupancy is Directed by Substrate Specificities ofPolypeptide GalNAc-Transferases；编辑Ernst，Hart和Sinay；Wiley-VCH chapter″Carbohydrates in Chemistry and Biology-aComprehension Handbook″，273-292)。GalNAc部分其自身可以是糖基连接基团并且由修饰基团衍生。备选地，使用一种或多种酶和一种或多种合适的糖基供体底物构建糖基残基。经修饰的糖随后可以加入延长的糖基部分中。
所述酶通常通过合成步骤催化反应，所述合成步骤类似于内切葡聚糖酶(endoglycanase)水解步骤的逆反应。在这些实施方案中，糖基供体分子(例如，所需寡糖或单糖结构)包含离去基团，并且反应伴随给蛋白质上的GlcNAc残基添加供体分子而进行。例如，离去基团可以是卤素，例如氟化物。在其他实施方案中，离去基团是Asn或Asn-肽部分。在再进一步的实施方案中，糖基供体分子上的GlcNAc残基是经修饰的。例如，GlcNAc残基可以包括1，2噁唑啉部分。
在另一个实施方案中，用于产生本发明的缀合物的每种酶以催化量存在。特定酶的催化量根据那种酶的底物浓度以及反应条件而改变，所述反应条件例如温度、时间和pH值。用于测定在预先选择的底物浓度和反应条件下关于给定酶的催化量的方法是本领域技术人员众所周知的。
执行上述过程的温度可以从紧在冷冻之上到大多数敏感酶变性的温度。优选的温度范围是约0℃至约55℃，并且更优选约20℃至约32℃。在另一个示例性实施方案中，当前方法的一种或多种组分在升高的温度下使用嗜热酶进行。
使反应混合物维持足以使受体糖基化的时间段，从而形成所需缀合物。某些缀合物通常可以在数小时后检测出，其中可回收量通常在24小时或更短时间内获得。本领域技术人员应当理解，反应速率依赖于许多可变因素(例如，酶浓度、供体浓度、受体浓度、温度、溶剂体积)，其对于所选择的系统进行最佳化。
本发明还提供了经修饰的多肽的工业规模生产。如本文所使用的，工业规模通常产生至少约250mg、优选至少约500mg、并且更优选至少约1克最终的、经纯化的缀合物，优选在单个反应循环后，即缀合物不是来自等同的、连续迭代的合成循环的反应产物的组合。
在下文讨论中，本发明通过经修饰的唾液酸部分与糖基化多肽的缀合进行例示。示例性经修饰的唾液酸用(m-)PEG进行标记。关于使用PEG修饰的唾液酸和糖基化多肽的下述讨论的焦点是为了举例说明起见，并且不意欲暗示本发明限制于这2种配偶体的缀合。技术人员应当理解，讨论一般可应用于除唾液酸外的经修饰的糖基部分的添加。此外，讨论同样可应用于用除PEG外的试剂修饰糖基单位，所述试剂包括其他水溶性聚合物、治疗部分和生物分子。
酶促方法可以用于在多肽或糖肽上选择性引入修饰基团(例如，mPEG或mPPG)。在一个实施方案中，该方法利用经修饰的糖，其包括与合适的糖基转移酶或糖合成酶(glycosynthase)相组合的修饰基团。通过选择将制备所需碳水化合物连接的糖基转移酶且利用经修饰的糖作为供体底物，可以将修饰基团直接引入多肽主链上，糖肽的现有糖残基上或已加入多肽中的糖残基上。在另一个实施方案中，该方法利用携带被掩蔽的反应性官能团的经修饰的糖，在经修饰的糖转移到多肽或糖肽上之后，所述被掩蔽的反应性官能团可以用于附着修饰基团。
在一个例子中，糖基转移酶是唾液酸转移酶，用于给糖肽附加经修饰的唾液酸残基。关于唾液酸残基的糖苷受体可以例如在多肽表达的过程中加入O联糖基化序列中，或可以在多肽表达后，使用一种或多种合适的糖苷酶、一种或多种糖基转移酶或其组合化学或酶促加入。合适的受体部分包括例如，半乳糖基受体例如GalNAc、Galβ1，4GlcNAc、Galβ1，4GalNAc、Galβ1，3GalNAc、乳糖-N-四糖、Galβ1，3GlcNAc、Galβ1，3Ara、Galβ1，6GlcNAc、Galβ1，4Glc(乳糖)，和本领域技术人员已知的其他受体(参见例如，Paulson等人，J.Biol. Chem.253：5617-5624(1978))。
在一个示例性实施方案中，通过GalNAc转移酶的作用，将GalNAc残基加入O联糖基化序列中。Hassan H，Bennett EP，Mandel U，Hollingsworth MA和Clausen H(2000)，Control of Mucin-TypeO-Glycosylation：O-Glycan Occupancy is Directed by SubstrateSpecificities of Polypeptide GalNAc-Transferases(编辑Ernst，Hart和Sinay)，Wiley-VCH chapter″Carbohydrates in Chemistry and Biology-a Comprehension Handbook″，第273-292页。该方法包括使待修饰的多肽与反应混合物一起温育，所述反应混合物包含合适量的糖基转移酶和合适的半乳糖基供体。允许反应基本上进行至完成，或备选地，当加入预先选择量的半乳糖残基时，终止反应。装配所选择的糖受体的其他方法对于本领域技术人员是显而易见的。
在下文讨论中，本发明的方法通过使用具有与之附着的水溶性聚合物的经修饰的糖进行例示。讨论的焦点为了举例说明起见。本领域技术人员应当理解，讨论同样与其中经修饰的糖具有治疗性部分、生物分子等的那些实施方案相关。
在另一个示例性实施方案中，水溶性聚合物经由经修饰的半乳糖基(Gal)残基加入GalNAc残基中。备选地，未经修饰的Gal可以加入末端GalNAc残基中。
在再进一步的例子中，使用经修饰的唾液酸部分和合适的唾液酸转移酶，将水溶性聚合物(例如，PEG)加到末端Gal残基上。这个实施方案在下文方案9中举例说明。
方案9：给糖蛋白添加经修饰的唾液酸部分
在再进一步的方法中，被掩蔽的反应功能性存在于唾液酸上。被掩蔽的反应基团优选通过用于使经修饰的唾液酸与多肽附着的条件而不受影响。在经修饰的唾液酸与多肽的共价附着后，去除掩蔽，并且通过经修饰的糖残基上的未被掩蔽的反应基团与反应性修饰基团的反应，使多肽与修饰基团例如水溶性聚合物(例如，PEG或PPG)缀合。这个策略在下文方案10中举例说明。
方案10：使用携带反应性官能团的唾液酸部分修饰糖肽
任何经修饰的糖都可以与合适的糖基转移酶相组合使用，依赖于糖肽的寡糖侧链的末端糖(表12)。
表12：示例性经修饰的糖
在一个备选实施方案中，使用糖基转移酶将经修饰的糖直接加入肽主链中，已知所述糖基转移酶将糖残基转移给多肽主链上的O联糖基化序列。这个示例性实施方案在下文方案11中阐述。在实践本发明中有用的示例性糖基转移酶包括但不限于GalNAc转移酶(GalNAc T1至GalNAc T20)、GlcNAc转移酶、岩藻糖基转移酶、葡糖基转移酶、木糖基转移酶、甘露糖基转移酶等。这种方法的使用允许经修饰的糖直接加到缺乏任何碳水化合物的多肽上，或备选地加到现有的糖肽上。
方案11：示例性经修饰的糖转移到多肽上而无先前糖基化
在上文阐述的示例性实施方案各自中，在经修饰的糖与多肽缀合后，可以利用一个或多个另外的化学或酶促修饰步骤。在一个示例性实施方案中，酶(例如，岩藻糖基转移酶)用于将糖基单位(例如，岩藻糖)附加到与多肽附着的末端经修饰的糖上。在另一个例子中，酶促反应利用经修饰的糖无法与之缀合的“帽”(例如，sialylate)位点。备选地，利用化学反应改变经缀合的经修饰的糖的结构。例如，使经缀合的经修饰的糖与试剂反应，所述试剂使其与多肽组分的连接稳定或不稳定，经修饰的糖与所述多肽组分附着。在另一个例子中，经修饰的糖的组分在其与多肽缀合后脱保护。本领域技术人员应当理解，存在在经修饰的糖与多肽缀合后的阶段时在本发明的方法中使用的许多酶促和化学操作。经修饰的糖-肽缀合物的进一步加工在本发明的范围内。
在另一个示例性实施方案中，使糖肽与靶向试剂缀合，所述靶向试剂例如转铁蛋白(递送多肽经过血脑屏障，并且至胞内体)、肉毒碱(将多肽递送给肌细胞；参见例如，LeBorgne等人，Biochem.Pharmacol.59：1357-63(2000)，和膦酸酯例如二膦酸酯(将多肽靶向骨和其他含钙组织；参见例如，Modern Drug Discovery，2002年8月，第10页)。对于靶向有用的其他试剂对于本领域技术人员是显而易见的。例如，葡萄糖、谷氨酰胺和IGF也用于靶向肌肉。
通过本文讨论或本领域另外已知的任何方法，使靶向部分和治疗性多肽缀合。本领域技术人员应当理解，除上文阐述的那些外的多肽也可以如本文所述进行衍生。示例性多肽在与2001年10月10日提交的共同未决的、共同拥有的美国临时专利申请号60/328,523中附加的附录中阐述。
在一个示例性实施方案中，靶向试剂和治疗性多肽经由连接体部分进行偶联。在这个实施方案中，根据本发明的方法，治疗性多肽或靶向试剂中的至少一种经由完整的糖基连接基团与连接体部分偶联。在一个示例性实施方案中，连接体部分包括聚(醚)例如聚(乙二醇)。在另一个示例性实施方案中，连接体部分包括至少一个这样的键，所述键在体内降解，从靶向试剂中释放治疗性多肽，随后将缀合物递送给机体的靶向组织或区域。
在另外一个示例性实施方案中，无需使治疗性多肽与靶向部分缀合，经由改变治疗性部分上的糖型来改变治疗性部分的体内分布。例如，通过用唾液酸(或其衍生物)给糖基基团的末端半乳糖部分加帽，治疗性多肽可以转向远离经由网状内皮系统的摄取。
酶
寡糖基转移酶
在本发明的方法中使用的寡糖基转移酶可以是真核生物或原核生物酶。在一个实施方案中，寡糖基转移酶对于多肽在其中表达的特定宿主细胞是内源的。例如，当多肽在细菌宿主细胞中表达时，内源酶可以是PglB或与PglB具有显著序列同一性的其他酶。在一个例子中，内源酶与PglB或PglB的相对应部分具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％、至少约98％或超过98％序列同一性。在一个例子中，酶比PglB小，但具有与PglB序列的至少部分相对应的氨基酸序列。在另一个例子中，多肽在真核生物宿主细胞例如酵母细胞中表达。在这个例子中，内源寡糖基转移酶可以包括Stt3p酶或显示出与Stt3p的显著序列同一性的另一种酶。
寡糖基转移酶可以是单一酶或蛋白质复合物的部分，任选是膜结合的。例如，包括具有寡糖基转移酶活性的膜结合的酶的膜制剂可以用作用于糖基化反应的试剂。在一个具体例子中，细菌酶PglB在宿主细胞(例如，细菌细胞)中过表达，并且此类宿主细胞的膜制剂用于无细胞的体外糖基化反应。
在一个实施方案中，寡糖基转移酶是重组酶。在根据这个实施方案的一个例子中，重组寡糖基转移酶在多肽在其中表达的宿主细胞中共表达。因此，在一个例子中，宿主细胞包括载体(其包括编码寡糖基转移酶(例如，PglB)的核酸序列)和另一种载体(其包括编码底物多肽的核酸序列)。备选地，寡糖基转移酶和多肽的核酸序列都是相同转染载体的部分。
在另一个实施方案中，寡糖基转移酶是缺乏功能性膜锚定结构域的可溶蛋白质。例如，酶可以是其中N末端疏水部分的至少部分被去除的PglB。此类截短可以涉及任何数目的氨基酸残基，只要剩余序列代表具有至少某些寡糖基转移酶活性的酶。在一个例子中，可溶性酶在宿主细胞中进行表达，并且随后进行分离。经分离的酶可以在体外糖基化方案中使用。
寡糖基转移酶可以衍生自任何物种。寡糖基转移酶的代表性例子包括真核生物(例如，酵母、哺乳动物)蛋白质例如Stt3p，细菌(例如，大肠杆菌、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni))蛋白质例如PglB，昆虫蛋白质等。在一个例子中，本发明使用重组PglB，或与PglB酶具有高序列同一性的酶。本发明的示例性寡糖基转移酶包括根据SEQ IDNO：102的氨基酸序列。示例性寡糖基转移酶具有这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：102的氨基酸序列或其STT3亚单位(氨基酸残基9-626)具有至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约96％、至少约98％或超过98％序列同一性。
PglB(空肠弯曲杆菌，登记CAL35243)
(SEQ ID NO：102)
MLKKEYLKNPYLVLFAMIVLAYVFSVFCRFYWVWWASEFNEYFFNNQLMIISNDGYAFAEGARDMIAGFHQPNDLSYYGSSLSTLTYWLYKITPFSFESIILYMSTFLSSLVVIPIILLANEYKRPLMGFVAALLASVANSYYNRTMSGYYDTDMLVIVLPMFILFFMVRMILKKDFFSLIALPLFIGIYLWWYPSSYTLNVALIGLFLIYTLIFHRKEKIFYIAVILSSLTLSNIAWFYQSAIIVILFALFALEQKRLNFMIIGILGSATLIFLILSGGVDPILYQLKFYIFRSDESANLTQGFMYFNVNQTIQEVENVDFSEFMRRISGSEIVFLFSLFGFVWLLRKHKSMIMALPILVLGFLALKGGLRFTIYSVPVMALGFGFLLSEFKAILVKKYSQLTSNVCIVFATILTLAPVFIHIYNYKAPTVFSQNEASLLNQLKNIANREDYVVTWWDYGYPVRYYSDVKTLVDGGKHLGKDNFFPSFSLSKDEQAAANMARLSVEYTEKSFYAPQNDILKSDILQAMMKDYNQSNVDLFLASLSKPDFKIDTPKTRDIYLYMPARMSLIFSTVASFSFINLDTGVLDKPFTFSTAYPLDVKNGEIYLSNGVVLSDDFRSFKIGDNVVSVNSIVEINSIKQGEYKITPIDDKAQFYIFYLKDSAIPYAQFILMDKTMFNSAYVQMFFLGNYDKNLFDLVINSRDAKVFKLKI
PglB(淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)，登记YP_207258)(SEQ ID NO：103)
MSKAVKRLFDIIASASGLIVLSPVFLVLIYLIRKNLGSPVFFIRERPGKDGKPFKMVKFRSMRDALDSDGIPLPDSERLTDFGKKLRATSLDELPELWNVLKGEMSLVGPRPLLMQYLPLYNKFQNRRHEMKPGITGWAQVNGRNALSWDEKFSCDVWYTDNFSFWLDMKILFLTVKKVLIKEGISAQGEATMPPFAGNRKLAVIGAGGHGKVVAELAAALGTYGEIVFLDDRTQGSVNGFPVIGTTLLLENSLSPEQFDITVAVGNNRIRRQITENAAALGFKLPVLIHPDATVSPSAIIGQGSVVMAKAVVQAGSVLKDGVIVNTAATVDHDCLLDAFVHISPGAHLSGNTRIGEESRIGTGACSRQQTTVGSGVTAGAGAVIVCDIPDGMTVAGNPAKPLTGKNPKTGTA
寡糖基转移酶(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，登记EDN64373)
(SEQ ID NO：104)
MKWCSTYIIIWLAIIFHKFQKSTATASHNIDDILQLKGDTGVITVTADNYPLLSRGVPGYFNILYITMRGTNSNGMSCQLCHDFEKTYQAVADVIRSQAPQSLNLFFTVDVNEVPQLVKDLKLQNVPHLVVYPPAESNKQSQFEWKTSPFYQYSLVPENAENTLQFGDFLAKILNISITVPQAFNVQEFVYYFVACMVVFIFIKKVILPKVTNKWKLFSMILSLGILLPSITGYKFVEMNAIPFIARDAKNRIMYFSGGSGWQFGIEIFSVSLMYIVMSALSVLLIYVPKISCVSEKMRGLLSSFLACVLFYFFSYFISCYLIKNPGYPIVF
寡糖基转移酶(智人(Homo sapiens)，登记BAA23670)
(SEQ ID NO：105)
MGYFRCAGAGSFGRRRKMEPSTAARAWALFWLLLPLLGAVCASGPRTLVLLDNLNVRETHSLFFRSLKDRGFELTFKTADDPSLSLIKYGEFLYDNLIIFSPSVEDFGGNINVETISAFIDGGGSVLVAASSDIGDPLRELGSECGIEFDEEKTAVIDHHNYDISDLGQHTLIVADTENLLKAPTIVGKSSLNPILFRGVGMVADPDNPLVLDILTGSSTSYSFFPDKPITQYPHAVGKNTLLIAGLQARNNARVIFSGSLDFFSDSFFNSAVQKAAPGSQRYSQTGNYELAVALSRWVFKEEGVLRVGPVSHHRVGETAPPNAYTVTDLVEYSIVIQQLSNAKWVPFDGDDIQLEFVRIDPFVRTFLKKKGGKYSVQFKLPDVYGVFQFKVDYNRLGYTHLYSSTQVSVRPLQHTQYERFIPSAYPYYASAFPMMLGLFIFSIVFLHMKEKEKSD
寡糖基转移酶(小家鼠(Mus musculus)，登记BAA23671)
(SEQ ID NO：106)
MKMDPRLAVRAWPLCGLLLAVLGCVCASGPRTLVLLDNLNVRDTHSLFFRSLKDRGFELTFKTADDPSLSLIKYGEFLYDNLIIFSPSVEDFGGNINVETISAFIDGGGSVLVAASSDIGDPLRELGSECGIEFDEEKTAVIDHHNYDVSDLGQHTLIVADTENLLKAPTIVGKSSLNPILFRGVGMVADPDNPLVLDILTGSSTSYSFFPDKPITQYPHAVGRNTLLIAGLQARNNARVIFSGSLDFFSDAFFNSAVQKATPGAQRYSQTGNYELAVALSRWVFKEEGVLRVGPVSHHRVGEMAPPNAYTVTDLVEYSIVIEQLSNGKWVPFDGDDIQLEFVRIDPFVRTFLKRKGGKYSVQFKLPDVYGVFQFKVDYNRLGYTHLYSSTQVSVRPLQHTQYERFIPSAYPYYASAFSMMAGLFIFSIVFLHMKEKEKSD
寡糖基转移酶(白色念珠菌(candida albicans)，登记XP_714366或XP_440145)
(SEQ ID NO：107)
MAKSASNKKSIPTTSSSSTTTSAASSSVVLKEVKSTLTTTINNYFDTISAQPRLKLIDLFLIFLVLLGILQFIYVLIIGNFPFNSFLGGFISCVGQFVLLVSLRLQINDSTTTTTNKESDDQLELDEDKIENGTTGGGNGRLFKEITPERSFGDFIFASLILHFIVIHFIN
磷-多萜醇-GlcNAc-1-磷酸盐转移酶
UDP-N-乙酰葡糖胺-多萜基-磷酸盐-N-乙酰葡糖胺-磷酸转移酶同种型b(智人，登记NP_976061)
(SEQ ID NO：108)
MIFLGFADDVLNLRWRHKLLLPTAASLPLLMVYFTNFGNTTIVVPKPFRPILGLHLDLGILYYVYMGLLAVFCTNAINILAGINGLEAGQSLVISASIIVFNLVELEGDCRDDHVFSLYFMIPFFFTTLGLLYHNWYPSRVFVGDTFCYFAGMTFAVVGILGHFSKTMLLFFMPQVFNFLYSLPQLLHIIPCPRHRIPRLNIKTGKLEMSYSKFKTKSLSFLGTFILKVAESLQLVTVHQSETEDGEFTECNNMTLINLLLKVLGPIHERNLTLLLLLLQILGSAITFSIRYQLVRLFYDV
UDP-N-乙酰葡糖胺-多萜基-磷酸盐-N-乙酰葡糖胺-磷酸转移酶同种型a(智人，登记NP_001373)
(SEQ ID NO：109)
MWAFSELPMPLLINLIVSLLGFVATVTLIPAFRGHFIAARLCGQDLNKTSRQQIPESQGVISGAVFLIILFCFIPFPFLNCFVKEQCKAFPHHEFVALIGALLAICCMIFLGFADDVLNLRWRHKLLLPTAASLPLLMVYFTNFGNTTIVVPKPFRPILGLHLDLGILYYVYMGLLAVFCTNAINILAGINGLEAGQSLVISASIIVFNLVELEGDCRDDHVFSLYFMIPFFFTTLGLLYHNWYPSRVFVGDTFCYFAGMTFAVVGILGHFSKTMLLFFMPQVFNFLYSLPQLLHIIPCPRHRIPRLNIKTGKLEMSYSKFKTKSLSFLGTFILKVAE SLQLVTVHQSETEDGEFTECNNMTLINLLLKVLGPIHERNLTLLLLLLQILGSAITFSIRYQLVRLFYDV
UDP-N-乙酰葡糖胺-多萜基-磷酸盐-N-乙酰葡糖胺-磷酸转移酶(GPT、G1PT、GlcNAc-1-P-转移酶)(小家鼠，登记P42867)
(SEQ ID NO：110)
MWAFPELPLPLPLLVNLIGSLLGFVATVTLIPAFRSHFIAARLCGQDLNKLSQQQIPESQGVISGAVFLIILFCFIPFPFLNCFVEEQCKAFPHHEFVALIGALLAICCMIFLGFADDVLNLRWRHKLLLPTAASLPLLMVYFTNFGNTTIVVPKPFRWILGLHLDLGILYYVYMGLLAVFCTNAINILAGINGLEAGQSLVISASIIVFNLVELEGDYRDDHIFSLYFMIPFFFTTLGLLYHNWYPSRVFVGDTFCYFAGMTFAVVGILGHFSKTMLLFFMPQVFNFLYSLPQLFHIIPCPRHRMPRLNAKTGKLEMSYSKFKTKNLSFLGTFILKVAENLRLVTVHQGESEDGAFTECNNMTLINLLLKVFGPIHERNLTLLLLLLQVLSSAATFSIRYQLVRLFYDV
UDP-N-乙酰葡糖胺-多萜基-磷酸盐-N-乙酰葡糖胺-磷酸转移酶(GPT、G1PT、GlcNAc-1-P-转移酶)(酿酒酵母，登记P07286)
(SEQ ID NO：111)
MLRLFSLALITCLIYYSKNQGPSALVAAVGFGIAGYLATDMLIPRVGKSFIKIGLFGKDLSKPGRPVLPETIGAIPAAVYLFVMFIYIPFIFYKYMVITTSGGGHRDVSVVEDNGMNSNIFPHDKLSEYLSAILCLESTVLLGIADDLFDLRWRHKFFLPAIAAIPLLMVYYVDFGVTHVLIPGFMERWLKKTSVDLGLWYYVYMASMAIFCPNSINILAGVNGLEVGQCIVLAILALLNDLLYFSMGPLATRDSHRFSAVLIIPFLGVSLALWKWNRWPATVFVGDTYCYFAGMVFAVVGILGHFSKTMLLLFIPQIVNFIYSCPQLFKLVPCPRHRLPKFNEKDGLMYPSRANLKEEPPKSIFKPILKLLYCLHLIDLEFDENNEIISTSNMTLINLTLVWFGPMREDKLCNTILKLQFCIGILALLGRHAIGAIIFGHDNLWTVR
用于合成糖基供体分子的其他酶
PglC(空肠弯曲杆菌，登记AAD51385)
(SEQ ID NO：112)
MYEKVFKRIFDFILALVLLVLFSPVILITALLLKITQGSVIFTQNRPGLDEKIFKIYKFKTMSDERDEKGELLSDELRLKAFGKIVRSLSLDELLQLFNVLKGDMSFVGPRPLLVEYLSLYNEEQKLRHKVRPGITGWAQVNGRNAISWQKKFELDVYYVKNISFLLDLKIMFLTALKVLKRSGVSKEGHVTTEKFNGKN
PglC(淋病奈瑟球菌，登记YP_207257)
(SEQ ID NO：113)
MLNTALSPWPSFTREEADAVSKVLLSNKVNYWTGSECREFEKEFAAFAGTRYAVALSNGTLALDAALKAIGIGAGDDVIVTSRTFLASASCIVNAGANPVFADVDLNSQNISAETVKAVLTPNTKAVIVVHLAGMPAEMDGIMALAKEHDLWVIEDCAQAHGATYKGKSVGSIGHVGAWSFCQDKIITTGGEGGMVTTNDKTLWEKMWAYKDHGKSYDAVYHREHAPGFRWLHESFGTNWRMMEMQAVIGRIQLKHLPEWTARRQENAAKLAESLRKFKSIRLIEVAGYIGHAQYKFYAFVKPEHLKDDWTRDRIVSELNARNVPCYQGGCSEVYLEKAFDNTPWRPKERLKNAVELGGTALTFLVHPTLTDDEIAFCKKHIEAVLTEAAR
糖基转移酶(史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)，登记YP_001273863)
(SEQ ID NO：114)
MKTAVLIPCYNEELTIKKVILDFKKALPKADIYVYDNNSTDNSYEIAKDTGAIVKREYRQGKGNVVRSMFRDIDADCYILVDGDDTYPAEASKEIEELILSKKADMVIGDRLSSTYFEENKRRFHNSGNKLVRKLINTIFNSDISDIMTGMRGFSYEFVKSFPISSKEFEIETEMTIFALNHNFLIKELPIEYRDRMDGSESKLNTFSDGYKVISLLFGLFRDIRPLFFFSLVTLVLLIIAGLYFFPILIDFYRTGFVEKVPTLITVGVVAIVAVIIFFTGVVLHVIRKQHDENFEHHLNLIAQNKKR
糖基转移酶
在一个实施方案中，糖基转移酶用于合成本发明的糖基供体种类。在另一个实施方案中，糖基转移酶可以用于制备本发明的多肽缀合物的方法中。糖基转移酶以逐步方式催化活化的糖(供体-NDP-糖)加入蛋白质、糖肽、脂质或糖脂中，或加入成长中的寡糖的非还原末端中。例如，在第一个步骤中，多肽可以是使用本发明的糖基供体种类(例如，脂质-焦磷酸盐连接的糖基部分)和合适的寡糖基转移酶而被糖基化。这种糖基化反应可以任选在多肽在其中表达的宿主细胞中发生。在第二个步骤中，对糖基化的多肽实施糖基化或糖基PEG化反应，其涉及经修饰的或未经修饰的糖核苷酸和合适的糖基转移酶。
大量糖基转移酶是本领域已知的。此类酶的例子包括Leloir途径糖基转移酶，例如半乳糖基转移酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶、N-乙酰半乳糖胺基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、甘露糖基转移酶、木糖基转移酶、葡糖醛酸基转移酶等。
对于涉及糖基转移酶反应的酶促糖合成，可以从任何来源中克隆或分离糖基转移酶。许多经克隆的糖基转移酶是已知的，如它们的多核苷酸序列一样。糖基转移酶氨基酸序列和编码糖基转移酶的核苷酸序列(从其中可以推导氨基酸序列)在各种可公开获得的数据库中发现，包括GenBank、Swiss-Prot、EMBL及其他。
可以在本发明的方法中采用的糖基转移酶包括但不限于，半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、葡糖基转移酶、N-乙酰半乳糖胺基转移酶、N-乙酰葡糖胺基转移酶、葡糖醛酸内酯转移酶、唾液酸转移酶、甘露糖基转移酶、葡糖醛酸转移酶、半乳糖醛酸转移酶和寡糖基转移酶。合适的糖基转移酶包括得自真核生物以及得自原核生物的那些。
编码糖基转移酶的DNA可以这样获得：通过化学合成，通过筛选来自合适的细胞或细胞系培养的mRNA的逆转录物，通过筛选来自合适细胞的基因组文库，或通过这些操作的组合。mRNA或基因组DNA的筛选可以用寡核苷酸探针执行，所述寡核苷酸探针由糖基转移酶基因序列产生。探针可以依照已知操作用可检测基团进行标记，所述可检测基团例如荧光基团、放射性原子或化学发光基团，并且在常规杂交测定法中使用。在备选方案中，糖基转移酶基因序列可以通过使用聚合酶链反应(PCR)操作获得，其中PCR寡核苷酸引物由糖基转移酶基因序列产生(参见例如，给予Mullis等人的美国专利号4,683,195和给予Mullis的美国专利号4,683,202)。
糖基转移酶可以在用载体转化的宿主细胞中合成，所述载体包含编码糖基转移酶的DNA。载体用于扩增编码糖基转移酶的DNA和/或表达编码糖基转移酶的DNA。表达载体是可复制的DNA构建体，其中编码糖基转移酶的DNA序列与合适的控制序列可操作地连接，所述控制序列能够影响糖基转移酶在合适的宿主中的表达。关于此类控制序列的需要将依赖于所选择的宿主和所选择的转化方法而改变。一般地，控制序列包括转录启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、以及控制转录和翻译终止的序列。扩增载体不需要表达控制结构域。所需要全部的是通常由复制起点赋予的在宿主中复制的能力，和促进转化体的识别的选择基因。
在一个示例性实施方案中，本发明利用原核生物酶。此类糖基转移酶包括涉及脂寡糖(LOS)合成的酶，其由许多革兰氏阴性菌产生(Preston等人，Critical Reviews in Microbiology 23(3)：139-180(1996))。此类酶包括但不限于，物种例如大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的rfa操纵子的蛋白质，其包括β1，6半乳糖基转移酶和β1，3半乳糖基转移酶(参见例如，EMBL登记号M80599和M86935(大肠杆菌)；EMBL登记号S56361(鼠伤寒沙门氏菌))、葡糖基转移酶(Swiss-Prot登记号P25740(大肠杆菌)、β1，2-葡糖基转移酶(rfaJ)(Swiss-Prot登记号P27129(大肠杆菌)和Swiss-Prot登记号P19817(鼠伤寒沙门氏菌)、和β1，2-N-乙酰葡糖胺基转移酶(rfaK)(EMBL登记号U00039(大肠杆菌)。关于其氨基酸序列是已知的其他糖基转移酶包括由操纵子例如rfaB和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的rh1操纵子编码的那些，所述rfaB已在生物体例如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)、(Mycobacterium leprosum)中进行表征。
还适合于在本发明中使用的是这样的糖基转移酶，其涉及产生包含下述的结构：乳糖-N-新四糖、D-半乳糖基-β-1，4-N-乙酰-D-葡糖胺基-β-1，3-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖、和Pk血型三糖序列、D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖，所述糖基转移酶已在粘膜病原体淋病奈瑟球菌和脑膜炎奈瑟球菌(N. meningitidis)的LOS中得到鉴定(Scholten等人，J.Med.Microbiol.41：236-243(1994))。来自脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌的基因(其编码涉及这些结构的生物合成的糖基转移酶)已从脑膜炎奈瑟球菌免疫表型(immunotypes)L3和L1(Jennings等人，Mol. Microbiol. 18：729-740(1995))以及淋病奈瑟球菌突变型F62(Gotshlich，J.Exp.Med.180：2181-2190(1994))中得到鉴定。在脑膜炎奈瑟球菌中，由3种基因lgtA、lgtB和lg E组成的基因座编码在乳糖-N-新四糖链中添加最后3个糖所需的糖基转移酶(Wakarchuk等人，J.Biol. Chem.271：19166-73(1996))。近来，lgtB和lgtA基因产物的酶促活性得到证实，提供了关于提出的其糖基转移酶功能的第一个直接证据(Wakarchuk等人，J.Biol. Chem.271(45)：28271-276(1996))。在淋病奈瑟球菌中，存在2个另外的基因，给乳糖-N-新四糖结构的末端半乳糖的3位置添加β-D-GalNAc的lgtD，和给截短的LOS的乳糖元件添加末端α-D-Gal的lgtC，从而产生Pk血型抗原结构(Gotshlich(1994)，同上)。在脑膜炎奈瑟球菌中，分开的免疫表型L1也表达Pk血型抗原，并且已显示携带lgtC基因(Jennings等人，(1995)，同上)。奈瑟球菌属糖基转移酶和相关基因也在USPN5,545,553(Gotschlich)中描述。关于来自幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)的α1，2-岩藻糖基转移酶和α1，3-岩藻糖基转移酶的基因已也得到表征(Martin等人，J.Biol. Chem.272：21349-21356(1997))。在本发明中还有用的是空肠弯曲杆菌的糖基转移酶(参见例如，http：//afmb.cnrs-mrs.fr/～pedro/CAZY/gtf_42.html)。
(a)GalNAc转移酶
在一个实施方案中，糖基转移酶是UDP-GalNAc大家族的成员：多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶(GalNAc-转移酶)，其通常将GalNAc转移给丝氨酸和苏氨酸受体位点(Hassan等人，J.Biol. Chem.275：38197-38205(2000))。迄今为止已鉴定且表征了哺乳动物GalNAc-转移酶家族的12个成员(Schwientek等人，J.Biol. Chem.277：22623-22638(2002))，并且根据基因组数据库的分析已预测了这个基因家族的几个另外的假定成员。GalNAc-转移酶同种型具有不同的动力学性质，并且显示出在时间和空间上的差异表达模式，暗示它们具有不同的生物学功能(Hassan等人，J.Biol. Chem.275：38197-38205(2000))。GalNAc-转移酶的序列分析已导致这些酶包含2个不同亚单位的假设：中心催化单位，和与植物凝集素蓖麻蛋白具有序列相似性的C末端单位，命名为“凝集素结构域”(Hagen等人，J.Biol. Chem.274：6797-6803(1999)；Hazes，Protein Eng.10：1353-1356(1997)；Breton等人，Curr.Opin.Struct.Biol.9：563-571(1999))。涉及所选择的保守残基的定点诱变的先前实验证实，在催化结构域中的突变消除催化活性。相比之下，在“凝集素结构域”中的突变对GalNAc-转移酶同种型GalNAc-T1的催化活性没有显著影响(Tenno等人，J.Biol. Chem.277(49)：47088-96(2002))。因此，C末端“凝集素结构域”被认为不是功能性的，并且对于GalNAc-转移酶的酶促功能不发挥作用(Hagen等人，J.Biol.Chem.274：6797-6803(1999))。
未显示明显的GalNAc-糖肽特异性的多肽GalNAc-转移酶看起来也通过其假定的凝集素结构域而被调节(PCT WO 01/85215A2)。近来，发现GalNAc-T1假定凝集素结构域中的突变，类似于在GalNAc-T4中先前分析的那些(Hassan等人，J.Biol. Chem.275：38197-38205(2000))，以与GalNAc-T4相似的方式修饰酶的活性。因此，尽管野生型GalNAc-T1将多个保守的GalNAc残基加入具有多个受体位点的多肽底物内，但突变的GalNAc-T1无法将超过一个GalNAc残基加入相同底物中(Tenno等人，J.Biol. Chem.277(49)：47088-96(2002))。最近，已测定了鼠类GalNAc-T1(Fritz等人，PNAS 2004，101(43)：15307-15312)以及人GalNAc-T2(Fritz等人，J.Biol. Chem.2006，281(13)：8613-8619)的x射线晶体结构。人GalNAc-T2结构揭示在催化和凝集素结构域之间出乎意料的弹性，并且暗示由GalNAc-T2用于捕获糖基化底物的新机制。缺乏凝集素结构域的GalNAc-T2的动力学分析证实这个结构域在作用于糖肽底物中的重要性。然而，就非糖基化底物而言的酶活性不受凝集素结构域去除的显著影响。因此，缺乏凝集素结构域的截短的人GalNAc-T2酶或具有截短的凝集素结构域的这些酶可以用于多肽底物的糖基化，其中不需要所得到的单糖基化多肽的进一步糖基化。
通过基因工程由经克隆的基因产生蛋白质例如酶GalNAc T1-XX是众所周知的。参见例如，美国专利号4,761,371。一种方法涉及足够样品的收集，随后通过N末端测序来测定酶的氨基酸序列。这种信息随后用于分离编码全长(膜结合的)转移酶的cDNA克隆，所述全长转移酶在昆虫细胞系Sf9中表达后导致完全活性酶的合成。随后使用在16种不同蛋白质中的已知糖基化序列周围的氨基酸的半定量分析，随后为合成肽的体外糖基化研究，测定酶的受体特异性。这项工作已证实特定氨基酸残基在糖基化的肽区段中是过度表现的，并且在糖基化的丝氨酸和苏氨酸残基周围的特定位置中的残基可能比其他氨基酸部分对受体效率具有更明显的影响。
因为已证实GalNAc转移酶的突变可以用于产生与由野生型酶产生的那种不同的糖基化模式，所以在本发明中利用一种或多种突变型或截短的GalNAc转移酶在本发明的范围内。GalNAc-T2蛋白质的催化结构域和截短突变体在例如2004年6月3日提交的美国临时专利申请60/576,530；和2004年8月3日提交的美国临时专利申请60/598584中描述；所述2个美国临时专利申请为了所有目的通过引用合并入本文。催化结构域也可以通过与已知糖基转移酶比对进行鉴定。截短的GalNAc-T2酶例如人GalNAc-T2(Δ51)、人GalNAc-T2(Δ51Δ445)，并且获得这些酶的方法也在WO 06/102652(2006年3月24日提交的PCT/US06/011065)和2005年1月6日提交的PCT/US05/00302中描述，所述专利为了所有目的通过引用合并入本文。
(b)岩藻糖基转移酶
在某些实施方案中，在本发明的方法中使用的糖基转移酶是岩藻糖基转移酶。岩藻糖基转移酶是本领域技术人员已知的。示例性岩藻糖基转移酶包括将L-岩藻糖从GDP-岩藻糖转移给受体糖的羟基位置的酶。将非核苷酸糖转移给受体的岩藻糖基转移酶也在本发明中有用。
在某些实施方案中，受体糖是例如在寡糖糖苷中的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-基团中的GlcNAc。用于这个反应的合适的岩藻糖基转移酶包括Galβ(1→3，4)GlcNAcβ1-α(1→3，4)岩藻糖基转移酶(FTIII E.C.No.2.4.1.65)，其首先从人乳中得到表征(参见，Palcic，等人，CarbohydrateRes.190：1-11(1989)；Prieels，等人，J.Biol. Chem.256：10456-10463(1981)；和Nunez，等人，Can.J.Chem.59：2086-2095(1981))，和在人血清中发现的Galβ(1→4)GlcNAcβ-α岩藻糖基转移酶(FTIV、FTV、FTVI)。FTVII(E.C.No.2.4.1.65)，唾液酸基α(2→3)Galβ((1→3)GlcNAcβ岩藻糖基转移酶，也已得到表征。重组形式的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-α(1→3，4)岩藻糖基转移酶也已得到表征(参见，Dumas，等人，Bioorg.Med.Letters 1：425-428(1991)和Kukowska-Latallo，等人，Genes and Development 4：1288-1303(1990))。其他示例性岩藻糖基转移酶包括例如α1，2岩藻糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.69)。酶促岩藻糖基化可以通过Mollicone，等人，Eur.J.Biochem.191：169-176(1990)或美国专利号5,374,655中描述的方法执行。用于产生岩藻糖基转移酶的细胞还将包括用于合成GDP-岩藻糖的酶促系统。
(c)半乳糖基转移酶
在另一组实施方案中，糖基转移酶是半乳糖基转移酶。示例性半乳糖基转移酶包括α(1，3)半乳糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.151，参见例如，Dabkowski等人，Transplant Proc.25：2921(1993)和Yamamoto等人Nature 345：229-233(1990)、牛(GenBank j04989，Joziasse等人，J.Biol. Chem.264：14290-14297(1989))、鼠类(GenBank m26925；Larsen等人，Proc.Nat’l. Acad.Sci. USA 86：8227-8231(1989))、猪(GenBank L36152；Strahan等人，Immunogenetics 41：101-105(1995))。另一种合适的α1，3半乳糖基转移酶是涉及B血型抗原合成的那种(EC 2.4.1.37，Yamamoto等人，J.Biol.Chem.265：1146-1151(1990)(人))。在本发明的实践中还合适的是可溶形式的α1，3-半乳糖基转移酶，例如由Cho，S.K.和Cummings，R.D.(1997)J.Biol.Chem.，272，13622-13628报告的那种。
在另一个实施方案中，半乳糖基转移酶是β(1，3)-半乳糖基转移酶，例如核心-1-GalT1。人核心-1-β1，3-半乳糖基转移酶已得到描述(参见例如，Ju等人，J.Biol. Chem.2002，277(1)：178-186)。黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)酶在Correia等人，PNAS 2003，100(11)：6404-6409和Muller等人，FEBS J.2005，272(17)：4295-4305中描述。另外的核心-1-β3半乳糖基转移酶包括其截短形式，公开于WO/0144478和2006年9月6日提交的美国临时专利申请号60/842,926中。在一个示例性实施方案中，β(1，3)-半乳糖基转移酶是选自通过PubMed登记号AAF52724(CG9520-PC的转录物)描述的酶及其修饰形式的成员，所述修饰形式例如对于在细菌中表达进行密码子优化的那些变异。示例性、可溶性核心-1-GalT1(核心-1-GalT1Δ31)酶的序列在下文显示：
还适合于在本发明的方法中使用的是β(1，4)半乳糖基转移酶，其包括例如EC 2.4.1.90(LacNAc合成酶)和EC 2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛(D′Agostaro等人，Eur.J.Biochem.183：211-217(1989))、人(Masri等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.157：657-663(1988))、鼠类(Nakazawa等人，J.Biochem.104：165-168(1988))，以及E.C.2.4.1.38和神经酰胺半乳糖基转移酶(EC 2.4.1.45，Stahl等人，J.Neurosci.Res.38：234-242(1994))。其他合适的半乳糖基转移酶包括例如α1，2半乳糖基转移酶(来自例如栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)，Chapell等人，Mol. Biol. Cell 5：519-528(1994))。
(d)唾液酸转移酶
唾液酸转移酶是在本发明的重组细胞和反应混合物中有用的另一种类型的糖基转移酶。产生重组唾液酸转移酶的细胞也将产生CMP-唾液酸，其是唾液酸转移酶的唾液酸供体。适合于在本发明中使用的唾液酸转移酶的例子包括ST3Gal III(例如，大鼠或人ST3Gal III)、ST3GalIV、ST3Gal I、ST6Gal I、ST3Gal V、ST6Gal II、ST6GalNAc I、ST6GalNAc II和ST6GalNAc III(在本文中使用的唾液酸转移酶命名法如Tsuji等人，Glycobiology 6：v-xiv(1996)中描述)。被称为α(2，3)唾液酸转移酶(EC 2.4.99.6)的示例性α(2，3)唾液酸转移酶，将唾液酸转移给Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非还原末端Gal。参见，Van denEijnden等人，J.Biol. Chem.256：3159(1981)，Weinstein等人，J.Biol.Chem.257：13845(1982)和Wen等人，J.Biol.Chem.267：21011(1992)。另一种示例性α2，3-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.4)将唾液酸转移给二糖或糖苷的非还原末端Gal。参见，Rearick等人，J.Biol.Chem.254：4444(1979)和Gillespie等人，J.Biol.Chem.267：21004(1992)。进一步的示例性酶包括Gal-β-1，4-GlcNAc α-2，6唾液酸转移酶(参见，Kurosawa等人Eur.J.Biochem.219：375-381(1994))。
优选地，对于糖肽的碳水化合物的糖基化，唾液酸转移酶将能够将唾液酸转移给序列Galβ1，4GlcNAc-，在完全唾液酸化的碳水化合物结构上在末端唾液酸下的最常见的次末端序列(参见下表14)。
表14：使用Galβ1，4GlcNAc序列作为受体底物的唾液酸转移酶
1)Goochee等人，Bio/Technology 9：1347-1355(1991)
2)Yamamoto等人，J.Biochem.120：104-110(1996)
3)Gilbert等人，J.Biol.Chem.271：28271-28276(1996)
在请求保护的方法中使用的唾液酸转移酶的例子是ST3Gal III，其也被称为α(2，3)唾液酸转移酶(EC 2.4.99.6)。这种酶催化唾液酸至Galβ1，3GlcNAc或Galβ1，4GlcNAc糖苷的Gal的转移(参见例如，Wen等人，J.Biol.Chem.267：21011(1992)；Van den Eijnden等人，J.Biol.Chem.256：3159(1991))，并且负责糖肽中天冬酰胺连接的寡糖的唾液酸化。唾液酸通过在2个糖之间形成α-连接与Gal连接。糖之间的键合(连接)在NeuAc的2-位置和Gal的3-位置之间。这种具体酶可以分离自以下：大鼠肝中(Weinstein等人，J.Biol.Chem.257：13845(1982))；人cDNA(Sasaki等人(1993)J.Biol.Chem.268：22782-22787；Kitagawa&Paulson(1994)J.Biol.Chem.269：1394-1401)和基因组(Kitagawa等人(1996)J.Biol.Chem.271：931-938)DNA序列是已知的，促进通过重组表达产生这种酶。在另一个实施方案中，请求保护的唾液酸化方法使用大鼠ST3Gal III。
在本发明中使用的其他示例性唾液酸转移酶包括从空肠弯曲杆菌中分离的那些，包括α(2，3)。参见例如，WO99/49051。
除表5中列出的那些外的唾液酸转移酶也在用于商业上重要的糖肽的唾液酸化的经济和有效的大规模过程中。作为发现这些其他酶的效用的简单测试，使多种量的每种酶(1-100mU/mg蛋白质)与去唾液酸-α1AGP(以1-10mg/ml)反应，以相对于牛ST6Gal I、ST3Gal III或两种唾液酸转移酶，比较目的唾液酸转移酶使糖肽唾液酸化的能力。备选地，从多肽主链中酶促释放的其他糖肽或糖肽、或N联寡糖可以用于代替去唾液酸-α1 AGP用于这种评估。具有比ST6Gal I更有效的使糖肽的N联寡糖唾液酸化的能力的唾液酸转移酶在用于多肽唾液酸化的实际大规模过程中有用(如在本公开内容中对于ST3Gal III举例说明的)。其他示例性唾液酸转移酶显示于图10中。
在本发明的缀合物中，Sia-修饰基团盒可以以α-2，6或α-2，3连接与Gal连接。
融合蛋白
在其他示例性实施方案中，本发明的方法利用融合蛋白，其具有超过一种涉及合成所需糖肽缀合物的酶促活性。融合多肽可以由例如与附属酶的催化活性结构域连接的糖基转移酶的催化活性结构域组成。附属酶催化结构域可以例如催化核苷酸糖形成中的步骤，所述核苷酸糖是糖基转移酶的供体，或催化涉及糖基转移酶循环的反应。例如，编码糖基转移酶的多核苷酸可以在框内与编码涉及核苷酸糖合成的酶的多核苷酸连接。所得到的融合蛋白随后不仅可以催化核苷酸糖的合成，还可以催化糖部分至受体分子的转移。融合蛋白可以是连接到一个可表达的核苷酸序列内的2种或更多种循环酶。在其他实施方案中，融合蛋白包括2种或更多种唾液酸转移酶的催化活性结构域。参见例如，5,641,668。本发明的经修饰的糖肽可以利用多种合适的融合蛋白容易地设计且制造(参见例如，1999年6月24日公开为WO 99/31224的PCT专利申请PCT/CA98/01180)。
固定化的酶
除细胞结合的酶外，本发明还提供了固定在固体和/或可溶性支持物上的酶的使用。在一个示例性实施方案中，提供了根据本发明的方法经由完整糖基连接体与PEG缀合的糖基转移酶。PEG-连接体-酶缀合物任选与固体支持物附着。固体支持的酶在本发明的方法中的使用简化了反应混合物的建立和反应产物的纯化，并且还使得酶的容易回收成为可能。糖基转移酶缀合物用于本发明的方法中。酶和载体的其他组合对于本领域技术人员是显而易见的。
多肽缀合物的纯化
通过本文上文描述的过程产生的多肽缀合物可以无需纯化而使用。然而，通常优选回收此类产物。用于纯化糖基化的多糖的标准的众所周知的技术，例如薄层或厚层色谱法、柱色谱法、离子交换色谱法或膜过滤。优选使用膜过滤，更优选利用反渗透膜，或用于回收的一种或多种柱色谱法技术，如下文和本文引用的参考文献中讨论的。例如，其中膜具有约3000至约10,000的分子量截止的膜过滤可以用于去除蛋白质例如糖基转移酶。纳米过滤或反渗透随后可以用于去除盐和/或纯化产物糖(参见例如，WO 98/15581)。纳米过滤膜是一类反渗透膜，其通过单价盐，但保留大于约100至约2,000道尔顿的多价盐和不带电的溶质，依赖于所使用的膜。因此，在一般的应用中，通过本发明的方法制备的糖将保留在膜中，并且污染盐将经过。
如果经修饰的糖蛋白质在细胞内产生，那么作为第一个步骤，例如通过离心或超滤去除颗粒碎片，包括细胞和细胞碎片。任选地，蛋白质可以用商购可得的蛋白质浓缩滤器进行浓缩，随后通过一个或多个色谱法步骤使多肽变体与其他杂质分离，所述色谱法步骤例如免疫亲和色谱法、离子交换色谱法(例如，在二乙氨基乙基(DEAE)或包含羧甲基或磺丙基的基质上)、羟磷灰石色谱法和疏水相互作用色谱法(HIC)。示例性固定相包括Blue-Sepharose、CM Blue-Sepharose、MONO-Q、MONO-S、小扁豆凝集素-Sepharose、WGA-Sepharose、ConA-Sepharose、Ether Toyopearl、Butyl Toyopearl、Phenyl Toyopearl、SP-Sepharose、或蛋白质A Sepharose。
其他色谱法技术包括SDS-PAGE色谱法、硅石色谱法、色谱聚焦、反相HPLC(例如，具有附加的脂肪族基团的硅胶)、使用例如Sephadex分子筛的凝胶过滤或尺寸排阻色谱法、在选择性结合多肽的柱上的色谱法、和乙醇或硫酸铵沉淀。
在培养中产生的经修饰的糖肽通常这样进行分离：通过从细胞中最初提取酶等，随后经过一个或多个浓缩、盐析、水离子交换或尺寸排阻色谱法步骤，例如SP Sepharose。此外，经修饰的糖蛋白可以通过亲和色谱法进行纯化，HPLC也可以用于一个或多个纯化步骤。
在任何前述步骤中可以包括蛋白酶抑制剂例如甲基磺酰氟(PMSF)以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以阻止偶发污染物的生长。
在另一个实施方案内，使用商购可得的蛋白质浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤装置，首先浓缩来自产生本发明的经修饰的糖肽的系统的上清液。在浓缩步骤后，浓缩物可以应用于合适的纯化基质。例如，合适的亲和基质可以包括与合适支持物结合的多肽、凝集素或抗体分子的配体。备选地，可以采用阴离子交换树脂，例如具有悬垂的DEAE基团的基质或底物。合适的基质包括丙烯酰胺、琼脂糖、右旋糖酐、纤维素或在蛋白质纯化中常用的其他类型。备选地，可以采用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括包含磺丙基或羧甲基基团的各种不溶性基质。磺丙基是特别优选的。
最后，采用疏水RP-HPLC介质例如具有悬垂的甲基或其他脂肪族基团的硅胶的一个或多个RP-HPLC步骤，可以用于进一步纯化多肽变体组合物。以各种组合的前述纯化步骤中的某些或全部也可以用于提供同质的经修饰的糖蛋白。
起因于大规模发酵的本发明的经修饰的糖肽可以通过类似于由Urdal等人，J.Chromatog.296：171(1984)公开的那些的方法进行纯化。这个参考文献描述了在制备型HPLC柱上用于纯化重组人IL-2的2个顺次的RP-HPLC步骤。备选地，诸如亲和色谱法的技术可以用于纯化经修饰的糖蛋白。
多肽编码序列的获得
一般的重组技术
通过突变或通过多肽的完全化学合成，通过改变相对应亲本多肽的氨基酸序列，可以实现掺入本发明的O联糖基化序列的突变型多肽的制备。多肽氨基酸序列优选通过在DNA水平上的改变加以改变，特别是通过在预先选择的碱基处使编码多肽的DNA序列突变，以产生将翻译成所需氨基酸的密码子。一个或多个DNA突变优选使用本领域已知的方法进行制备。
本发明依赖于重组遗传学领域中的常规技术。公开在本发明中使用的一般方法的基础课本包括Sambrook和Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版2001)；Kriegler，Gene Transfer andExpression：ALaboratory Manual(1990)；和Ausubel等人，编辑，Current Protocols in Molecular Biology(1994)。
核酸大小以千碱基(kb)或碱基对(bp)给出。这些是来自自琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、经测序的核酸、或所公开的DNA序列的估计值。对于蛋白质，大小以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数目给出。蛋白质大小是来自凝胶电泳、经测序的蛋白质、经衍生的氨基酸序列、或公开的蛋白质序列的估计值。
并非商购可得的寡核苷酸可以化学合成，例如根据首先由Beaucage& Caruthers，Tetrahedron Lett.22：1859-1862(1981)描述的固相亚磷酰胺三酯法，使用自动化合成仪，如Van Devanter等人，Nucleic AcidsRes.12：6159-6168(1984)中描述的。完整基因也可以化学合成。寡核苷酸的纯化使用任何领域公认的策略来执行，例如天然丙烯酰胺凝胶电泳或阴离子交换HPLC，如Pearson&Reanier，J.Chrom.255：137-149(1983)中描述的。
在克隆后使用例如Wallace等人，Gene 16：21-26(1981)的用于测序双链模板的链终止法，可以验证经克隆的野生型多肽基因、编码突变型多肽的多核苷酸和合成的寡核苷酸的序列。
在一个示例性实施方案中，糖基化序列通过改组(shuffle)多核苷酸进行添加。编码候选多肽的多核苷酸可以用DNA改组方案进行调节。DNA改组是循环重组和突变的过程，通过相关基因库的随机片段化执行，随后为通过聚合酶链反应样过程的片段重新装配。参见例如，Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370：389-391(1994)；以及美国专利号5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。
野生型肽编码序列的克隆和亚克隆
编码野生型多肽的许多多核苷酸序列已得到测定，并且可从商业供应商获得，例如人生长激素，例如，GenBank登记号NM 000515、NM002059、NM 022556、NM 022557、NM 022558、NM 022559、NM 022560、NM 022561和NM 022562。
在人基因组研究中的快速进展已使得这样的克隆方法成为可能，其中可以在人DNA序列数据库中搜索任何基因区段，所述基因区段与已知核苷酸序列(例如编码先前鉴定的多肽的序列)具有序列同源性的特定百分比。如此鉴定的任何DNA序列随后可以通过化学合成和/或聚合酶链反应(PCR)技术例如重叠延伸法获得。对于短序列，完全从头合成可以是足够的；而使用合成探针从人cDNA或基因组文库中进一步分离全长编码序列可以是获得较大基因所需的。
备选地，使用标准克隆技术例如聚合酶链反应(PCR)，可以从人cDNA或基因组DNA文库中分离编码多肽的核酸序列，其中基于同源性的引物通常可以衍生自编码多肽的已知核酸序列。为了这个用途的最常用的技术在标准课本例如Sambrook和Russell，同上中描述。
适合于获得关于野生型多肽的编码序列的cDNA文库可以是商购可得的，或可以是构建的。分离mRNA、通过逆转录制备cDNA、将cDNA连接到重组载体内、转染到重组宿主内用于繁殖、筛选和克隆的一般方法是众所周知的(参见例如，Gubler和Hoffman，Gene，25：263-269(1983)；Ausubel等人，同上)。在通过PCR获得核苷酸序列的扩增区段后，区段可以进一步用作探针以从cDNA文库中分离编码野生型多肽的全长多核苷酸序列。合适操作的一般描述可以在Sambrook和Russell，同上中找到。
可以遵循类似操作，以从人基因组文库中获得编码野生型多肽的全长序列，例如上文提及的GenBank登记号中的任何一个。人基因组文库是商购可得的，或可以根据各种领域公认的方法进行构建。一般而言，为了构建基因组文库，首先从其中可能发现多肽的组织中提取DNA。随后将DNA机械剪切或酶促消化，以产生长度约12-20kb的片段。随后通过梯度离心使片段与具有不希望有的大小的多核苷酸片段分离，并且插入噬菌体λ载体中。这些载体和噬菌体在体外进行包装。重组噬菌体通过噬斑杂交进行分析，如Benton和Davis，Science，196：180-182(1977)中所述。集落杂交如由Grunstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72：3961-3965(1975)所述执行。
基于序列同源性，可以设计简并寡核苷酸作为引物组，并且可以在合适条件下执行PCR(参见例如，White等人，PCR Protocols：CurrentMethods and Applications，1993；Griffin和Griffin，PCR Technology，CRC Press Inc.1994)，以扩增来自cDNA或基因组文库的核苷酸序列的区段。使用扩增片段作为探针，获得编码野生型多肽的全长核酸。
在获得编码野生型多肽的核酸序列后，可以将编码序列亚克隆到载体例如表达载体内，从而使得可以从所得到的载体产生重组野生型多肽。随后可以进行对于野生型多肽编码序列的进一步修饰，例如核苷酸置换，以改变分子的特征。
将突变引入多肽序列内
根据编码多核苷酸序列，可以测定野生型多肽的氨基酸序列。随后，通过在氨基酸序列中的各个部位处引入另外的一个或多个糖基化序列，可以修饰这种氨基酸序列，以改变蛋白质的糖基化模式。
几种类型的蛋白质糖基化序列是本领域众所周知的。例如，在真核生物中，N联糖基化在共有序列Asn-Xaa-Ser/Thr的天冬酰胺上发生，其中Xaa是除脯氨酸外的任何氨基酸(Kornfeld等人，Ann Rev Biochem54：631-664(1985)；Kukuruzinska等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84：2145-2149(1987)；Herscovics等人，FASEB J 7：540-550(1993)；和Orlean，Saccharomyces第3卷(1996))。O联糖基化在丝氨酸或苏氨酸残基处发生(Tanner等人，Biochim.Biophys.Acta.906：81-91(1987)；和Hounsell等人，Glycoconj.J.13：19-26(1996))。通过使糖基磷脂酰肌醇与蛋白质的羧基末端羧基连接而形成其他糖基化模式(Takeda等人，Trends Biochem.Sci. 20：367-371(1995)；和Udenfriend等人，Ann.Rev.Biochem.64：593-591(1995)。基于这种认识，因此可以将合适的突变引入野生型多肽序列内，以形成新糖基化序列。
尽管在多肽序列内的氨基酸残基的直接修饰可能适合于引入新N联或O联糖基化序列，但更频繁地，通过使编码多肽的多核苷酸序列突变来完成新糖基化序列的引入。这可以通过使用任何已知的诱变方法来完成，所述诱变方法中的某些在下文讨论。
各种突变产生方案在本领域中得到建立且描述。参见例如，Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，94：4504-4509(1997)；和Stemmer，Nature，370：389-391(1994)。操作可以分开或组合使用，以产生一组核酸变体，并且因此产生所编码多肽的变体。用于诱变、文库构建和其他多样性产生方法的试剂盒是商购可得的。
产生多样性的突变方法包括例如定点诱变(Botstein和Shortle，Science，229：1193-1201(1985))、使用含尿嘧啶的模板的诱变(Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：488-492(1985))、寡核苷酸指导的诱变(Zoller和Smith，Nucl.Acids Res.，10：6487-6500(1982))、硫代磷酸酯-经修饰的DNA诱变(Taylor等人，Nucl. Acids Res.，13：8749-8764和8765-8787(1985))、和使用缺口双链体DNA的诱变(Kramer等人，Nucl. Acids Res.，12：9441-9456(1984))。
用于产生突变的其他方法包括点错配修复(Kramer等人，Cell，38：879-887(1984))、使用修复缺失型宿主菌株的诱变(Carter等人，Nucl. Acids Res.，13：4431-4443(1985))、缺失诱变(Eghtedarzadeh和Henikoff，Nucl. Acids Res.，14：5115(1986))、限制-选择和限制-纯化(Wells等人，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A，317：415-423(1986))、通过总基因合成的诱变(Nambiar等人，Science，223：1299-1301(1984))、双链断裂修复(Mandecki，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7177-7181(1986))、通过多核苷酸链终止法的诱变(美国专利号5,965,408)、和易错PCR(Leung等人，Biotechniques，1：11-15(1989))。
对于在宿主生物体中的优选密码子使用的核酸修饰
编码多肽变体的多核苷酸序列可以进一步改变，以符合特定宿主的优选密码子使用。例如，细菌细胞的一种菌株的优选密码子使用可以用于衍生多核苷酸，其编码本发明的多肽变体，并且包括由这种菌株偏爱的密码子。通过求出由宿主细胞表达的大量基因中的优选密码子使用的频率的平均值(例如，计算服务可从Kazusa DNA Research Institute，Japan的网站获得)，可以计算出由宿主细胞显示出的优选密码子使用的频率。这种分析优选局限于由宿主细胞高度表达的基因。例如美国专利号5,824,864提供了由双子叶植物和单子叶植物显示出的通过高度表达的基因的密码子使用的频率。
在修饰完成时，多肽变体编码序列通过测序加以验证，并且随后亚克隆到合适的表达载体内，用于以与野生型多肽相同的方式重组产生。
突变型多肽的表达
在序列验证后，依赖于编码本文公开的多肽的多核苷酸序列，使用重组遗传学领域中的常规技术可以产生本发明的多肽变体。
表达系统
为了获得编码本发明的突变型多肽的核酸的高水平表达，通常将编码突变型多肽的多核苷酸亚克隆到表达载体内，所述表达载体包含指导转录的强启动子、转录/翻译终止子和用于翻译起始的核糖体结合位点。合适的细菌启动子是本领域众所周知的，并且例如在Sambrook和Russell，同上和Ausubel等人，同上中描述。用于表达野生型或突变型多肽的细菌表达系统可在例如大肠杆菌、芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)、沙门氏菌属(Salmonella)和柄杆菌属(Caulobacter)中获得。用于此类表达系统的试剂盒是商购可得的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核生物表达系统是本领域众所周知的，并且也是商购可得的。在一个实施方案中，真核生物表达载体是腺病毒载体、腺伴随病毒载体或逆转录病毒载体。
用于指导异源核酸表达的启动子依赖于具体应用。启动子任选放置在距离异源转录起始位点与它在其天然环境中距离转录起始位点大约相同的距离。然而，如本领域已知的，可以适应这个距离中的某些变动而无启动子功能的丧失。
除启动子外，表达载体一般包括转录单位或表达盒，其包含突变型多肽在宿主细胞中表达所需的所有的另外元件。一般的表达盒因此包含与编码突变型多肽的核酸序列和转录物的有效多腺苷酸化所需的信号可操作地连接的启动子，核糖体结合位点和翻译终止。编码多肽的核酸一般与可切割的信号肽序列连接，以促进多肽通过经转化的细胞的肽分泌。此类信号肽尤其包括来自组织型纤溶酶原激活物、胰岛素和神经元生长因子、以及烟芽夜蛾(Heliothis virescens)的保幼激素酯酶的信号肽。盒的另外元件可以包括增强子，并且如果基因组DNA用作结构基因，那么包括具有功能剪接供体和受体位点的内含子。
除启动子序列外，表达盒还应包含在结构基因下游的转录终止区，以提供有效终止。终止区可以得自与启动子序列相同的基因或可以得自不同的基因。
用于将遗传信息转运到细胞内的具体表达载体不是特别关键的。可以使用用于在真核生物或原核生物细胞中表达的任何常规载体。标准细菌表达载体包括质粒例如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D，和融合表达系统例如GST和LacZ。附加标签例如c-myc也可以加入重组蛋白质中，以提供方便的分离方法。
包含来自真核生物病毒的调节元件的表达载体一般在真核生物表达载体中使用，例如SV40载体、乳头状瘤病毒载体和衍生自EB病毒的载体。其他示例性真核生物载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE、和允许在下述启动子的指导下表达蛋白质的任何其他载体：SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠类乳房肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子、或显示对于在真核生物细胞中表达有效的其他启动子。
在某些示例性实施方案中，表达载体选自pCWin1、pCWin2、pCWin2/MBP、pCWin2-MBP-SBD(pMS39)和pCWin2-MBP-MCS-SBD(pMXS39)，如2004年4月9日提交的共同拥有的美国专利申请中公开的，所述美国专利申请通过引用合并入本文。
某些表达系统具有提供基因扩增的标记，例如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。备选地，不涉及基因扩增的高得率表达系统也是合适的，例如在昆虫细胞中的杆状病毒载体，具有在多角体蛋白启动子或其他强杆状病毒启动子的指导下编码突变体多肽的多核苷酸序列。
在表达载体中一般包括的元件还包括在大肠杆菌中起作用的复制子、编码抗生素抗性的基因以允许选择具有重组质粒的细菌、和在质粒的非必需区中的独特的限制位点以允许插入真核生物序列。所选择的具体抗生素抗性基因不是关键的，本领域已知的许多抗性基因中的任何都是合适的。原核生物序列任选这样进行选择，使得在需要时，它们不干扰DNA在真核生物细胞中的复制。
当需要重组蛋白质(例如，本发明的hgh突变型)的周质表达时，表达载体进一步包括编码分泌信号的序列，例如大肠杆菌OppA(周质寡肽结合蛋白质)分泌信号或其修饰形式，其与待表达的蛋白质的编码序列的5′直接连接。这种信号序列指导在细胞质中产生的重组蛋白质通过细胞膜进入壁膜间隙内。表达载体可以进一步包括关于信号肽酶1的编码序列，当重组蛋白质进入壁膜间隙时，所述信号肽酶1能够酶促切割信号序列。关于重组蛋白质的周质生产的更详细的描述可以在例如，Gray等人，Gene 39：247-254(1985)，美国专利号6,160,089和6,436,674中找到。
如上所述，本领域技术人员应认识到，可以对任何野生型或突变型多肽或其编码序列进行各种保守置换，同时仍保留多肽的生物活性。此外，还可以进行多核苷酸编码序列的修饰，以适应在特定表达宿主中的优选密码子使用，而不改变所得到的氨基酸序列。
转染方法
标准转染方法用于产生表达大量突变型多肽的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，所述突变型多肽随后使用标准技术进行纯化(参见例如，Colley等人，J.Biol.Chem.264：17619-17622(1989)；Guide to ProteinPurification，in Methods in Enzymology，第182卷(Deutscher，编辑，1990))。真核生物和原核生物细胞的转染根据标准技术来执行(参见例如，Morrison，J.Bact.132：349-351(1977)；Clark-Curtiss&Curtiss，Methods in Enzymology 101：347-362(Wu等人，编辑，1983)。
可以使用用于将外源核苷酸序列引入宿主细胞内的众所周知的操作中的任何。这些包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、血浆载体、病毒载体和用于将经克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外源遗传材料引入宿主细胞内的其他众所周知方法中的任何(参见例如，Sambrook和Russell，同上)。仅需要所使用的具体基因工程操作能够将至少一种基因成功引入能够表达突变型多肽的宿主细胞内。
突变型多肽在宿主细胞中的表达的检测
在表达载体引入合适的宿主细胞内后，经转染的细胞在有利于突变型多肽表达的条件下进行培养。细胞随后就重组多肽的表达进行筛选，所述重组多肽随后使用标准技术从培养物中回收(参见例如，Scopes，Protein Purification：Principles and Practice(1982)；美国专利号4,673,641；Ausubel等人，同上；以及Sambrook和Russell，同上)。
用于筛选基因表达的几种一般方法是本领域技术人员众所周知的。首先，基因表达可以在核酸水平上进行检测。通常使用使用核酸杂交技术的特异性DNA和RNA测量的多种方法(例如Sambrook和Russell，同上)。某些方法涉及电泳分离(例如，用于检测DNA的Southern印迹法和用于检测RNA的Northern印迹法)，但DNA或RNA的检测同样可以无需电泳而进行(例如通过斑点印迹法)。在经转染的细胞中编码突变型多肽的核酸的存在也可以通过PCR或RT-PCR使用序列特异性引物进行检测。
其次，基因表达可以在多肽水平上进行检测。本领域技术人员常规使用各种免疫学测定法，以测量基因产物的水平，特别是使用与本发明的突变型多肽特异性反应的多克隆或单克隆抗体(例如，Harlow和Lane，Antibodies，ALaboratory Manual，第14章，Cold Spring Harbor，1988；Kohler和Milstein，Nature，256：495-497(1975))。此类技术要求通过选择具有针对突变型多肽或其抗原性部分的高特异性的抗体的抗体制备。产生多克隆和单克隆抗体的方法是充分建立的，并且它们的描述可以在参考文献中找到，参见例如，Harlow和Lane，同上；Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.，6：511-519(1976)。制备针对本发明的突变型多肽的抗体且执行检测突变型多肽的免疫学测定法的更详细的描述在后文部分中提供。
重组产生的突变型多肽的纯化
证实重组突变型多肽在经转染的宿主细胞中的表达后，宿主细胞随后以合适的规模进行培养用于纯化重组多肽的目的。
1.从细菌中的纯化
当本发明的突变型多肽通过经转染的细菌大量重组产生时，一般在启动子诱导后，尽管表达可以是组成性的，蛋白质可以形成不溶性聚集物。存在适合于纯化蛋白质包涵体的几种方案。例如，聚集物蛋白质(下文称为包涵体)的纯化一般涉及包涵体的提取、分离和/或纯化，通过细菌细胞的破坏，例如通过在约100-150μg/ml溶酶体和0.1％Nonidet P40(非离子型洗涤剂)的缓冲液中温育。细胞悬浮液随后可以使用Polytron研磨器(Brinkman Instruments，Westbury，NY)进行研磨。备选地，细胞可以在冰上进行超声处理。裂解细菌的备选方法在Ausubel等人and Sambrook和Russell，同上中描述，并且对于本领域技术人员是显而易见的。
细胞悬浮液一般进行离心，并且使包含包涵体的团块重悬浮于缓冲液中，所述缓冲液不是溶解而是洗涤包涵体，例如20mM Tris-HCl(pH7.2)、1mM EDTA、150mM NaCl和2％Triton-X 100，非离子型洗涤剂。可能需要重复洗涤步骤以去除尽可能多的细胞碎片。包涵体的其余团块可以重悬浮于合适的缓冲液中(例如，20mM磷酸钠，pH 6.8，150mM NaCl)。其他合适的缓冲液对于本领域技术人员是显而易见的。
在洗涤步骤后，通过添加溶剂使包涵体溶解，所述溶剂是强氢受体和强氢供体(或各自具有这些性质中的一种的溶剂的组合)。形成包涵体的蛋白质随后可以通过用相容缓冲液稀释或透析进行复性。合适的溶剂包括但不限于，尿素(约4M至约8M)、甲酰胺(至少约80％，基于体积/体积)、和盐酸胍(约4M至约8M)。能够溶解形成聚集物的蛋白质的某些溶剂，例如SDS(十二烷基硫酸钠)和70％甲酸，可能不适合于在这个操作中使用，这是由于蛋白质的不可逆变性的可能，伴随免疫原性和/或活性的缺乏。尽管盐酸胍和相似试剂是变性剂，但这种变性不是不可逆的，并且复性可以在变性剂的去除(通过例如透析)或稀释后发生，允许重新形成免疫学和/或生物学活性的目的蛋白质。在溶解后，蛋白质可以通过标准分离技术与其他细菌蛋白质分离。关于从细菌包涵体中纯化重组多肽的进一步描述，参见例如，Patra等人，Protein Expression and Purification 18：182-190(2000)。
备选地，可以从细菌周质中纯化重组多肽，例如突变型多肽。当重组蛋白质输出到细菌的周质内时，细菌的周质部分可以通过冷渗透休克加上本领域技术人员已知的其他方法进行分离(参见例如，Ausubel等人，同上)。为了从周质中分离重组蛋白质，使细菌细胞离心以形成团块。使团块重悬浮于包含20％蔗糖的缓冲液中。为了裂解细胞，使细菌离心，并且使团块重悬浮于冰冷的5mM MgSO4中，并且在冰浴中保持约10分钟。使细胞悬浮液离心，并且倾析上清液且保存。通过本领域技术人员众所周知的标准分离技术，可以使上清液中存在的重组蛋白质与宿主蛋白质分离。
2.用于纯化的标准蛋白质分离技术
当重组多肽例如本发明的突变型多肽以可溶形式在宿主细胞中表达时，它的纯化可以遵循标准蛋白质纯化操作，例如本文下文描述的那些，或纯化可以使用其他地方例如在PCT公开号WO2006/105426中公开的方法来完成，所述专利通过引用合并入本文。
溶解度分馏
通常作为起始步骤，并且如果蛋白质混合物是复杂的，那么起始盐分级可以使许多不希望有的宿主细胞蛋白质(或衍生自细胞培养基的蛋白质)与目的重组蛋白质例如本发明的突变型多肽分离。优选的盐是硫酸铵。硫酸铵通过选择性减少蛋白质混合物中的水量而使蛋白质沉淀。蛋白质随后基于其溶解度进行沉淀。蛋白质越疏水，它就越可能在更低的硫酸铵浓度下沉淀。一般的方案是将饱和硫酸铵加入蛋白质溶液中，从而使得所得到的硫酸铵浓度为20-30％。这将沉淀大多数疏水蛋白质。弃去沉淀物(除非目的蛋白质是疏水的)，并且将硫酸铵加入上清液中至已知使目的蛋白质沉淀的浓度。沉淀物随后在缓冲液中溶解，并且需要时通过透析或透析过滤去除过量的盐。依赖于蛋白质溶解度的其他方法例如冷乙醇沉淀，是本领域技术人员众所周知的，并且可以用于分级复杂的蛋白质混合物。
超滤
基于所计算的分子量，使用超滤通过不同孔径的膜(例如，Amicon或Millipore膜)，可以分离更大和更小尺寸的蛋白质。作为第一步，使蛋白质混合物通过具有一定孔径的膜进行超滤，所述孔径具有比目的蛋白质例如突变型多肽的分子量更低的分子量截止。超滤的渗余物随后针对膜进行超滤，所述膜具有大于目的蛋白质的分子量的分子量截止。重组蛋白质将经过膜进入滤液内。滤液随后可以如下所述进行色谱法分析。
柱色谱法
目的蛋白质(例如，本发明的突变型多肽)也可以基于其大小、净表面电荷、疏水性或对于配体的亲和力与其他蛋白质分离。此外，针对多肽产生的抗体可以与柱基质和待免疫纯化的多肽缀合。所有这些方法是本领域众所周知的。
对于本领域技术人员显而易见的是，色谱法技术可以以任何规模并且使用来自许多不同制造商(例如，Pharmacia Biotech)的设备来执行。
用于检测突变型多肽表达的免疫测定法
为了证实重组突变型多肽的产生，免疫学测定法可以用于检测样品中多肽的表达。免疫学测定法也用于定量重组激素的表达水平。针对突变型多肽的抗体是执行这些免疫学测定法必需的。
针对突变型多肽的抗体的产生
用于产生与目的免疫原特异性反应的多克隆和单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的(参见例如，Coligan，Current Protocols inImmunology Wiley/Greene，NY，1991；Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Press，NY，1989；Stites等人(编辑)Basic and Clinical Immunology(第4版)Lange MedicalPublications，Los Altos，CA，和其中引用的参考文献；Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(第2版)Academic Press，New York，NY，1986；以及Kohler和Milstein Nature 256：495-497，1975)。此类技术包括通过从噬菌体或相似载体中的重组抗体的文库中分离抗体的抗体制备(参见，Huse等人，Science 246：1275-1281，1989；和Ward等人，Nature 341：544-546，1989)。
为了产生包含具有所需特异性的抗体的抗血清，目的多肽(例如，本发明的突变型多肽)或其抗原片段可以用于免疫接种合适的动物，例如小鼠、兔或灵长类动物。标准佐剂例如弗氏佐剂可以依照标准免疫接种方案使用。备选地，衍生自那种特定多肽的合成抗原肽可以与载体蛋白质缀合，并且随后用作免疫原。
通过进行测试放血且测定针对目的抗原的反应性滴度，监控动物针对免疫原制剂的免疫应答。当获得针对抗原的合适的高抗体滴度时，从动物中收集血液并且制备抗血清。随后可以执行抗血清的进一步分级，以富集与抗原特异性反应的抗体，和抗体的纯化。参见，Harlow和Lane，同上，以及上文提供的蛋白质纯化的一般描述。
使用本领域技术人员熟悉的多种技术获得单克隆抗体。一般地，通常通过与骨髓瘤细胞融合，使来自用所需抗原免疫接种的动物的脾细胞永生化(参见Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol. 6：511-519，1976)。永生化的备选方法包括例如用EB病毒、癌基因或逆转录病毒转化，或本领域众所周知的其他方法。就具有对于抗原的所需特异性和亲和力的抗体的产生筛选起于单一永生化细胞的集落，并且通过多种技术包括注射到脊椎动物宿主的腹膜腔内，可以增强通过此类细胞产生的单克隆抗体的得率。
此外，根据由Huse等人，同上概述的一般方案，通过筛选人B细胞cDNA文库，在鉴定编码具有所需特异性的抗体或此类抗体的结合片段后，也可以重组产生单克隆抗体。上文讨论的重组多肽生产的一般原理和方法可应用于通过重组方法的抗体生产。
需要时，能够特异性识别本发明的突变型多肽的抗体可以就其针对野生型多肽的交叉反应性进行测试，并且因此与针对野生型蛋白质的抗体区分开。例如，得自用突变型多肽免疫的动物的抗血清可以运行通过在其上固定有野生型多肽的柱。经过柱的抗血清的部分仅识别突变型多肽，并且不识别野生型多肽。类似地，针对突变型多肽的单克隆抗体也可以就其在仅识别突变型而不是野生型多肽方面的排他性进行筛选。
例如通过使样品与固定在固体支持物上的突变型多肽特异性的多克隆或单克隆抗体一起温育，仅特异性识别本发明的突变型多肽而不是野生型多肽的多克隆或单克隆抗体用于使突变型蛋白质与野生型蛋白质分离。
用于检测重组多肽表达的免疫测定法
获得对于本发明的突变型多肽特异的抗体后，通过对技术人员提供定性和定量结果的各种免疫测定方法，可以测量样品例如细胞裂解物中的多肽量。关于一般而言的免疫学和免疫测定法操作的综述，参见例如，Stites，同上；美国专利号4,366,241；4,376,110；4,517,288；和4,837,168。
免疫测定法中的标记
免疫测定法通常利用标记试剂以与结合复合物特异性结合且标记结合复合物，所述结合复合物由抗体和靶蛋白质形成。标记试剂其自身可以是包括抗体/靶蛋白质复合物的部分之一，或可以是与抗体/靶蛋白质复合物特异性结合的第三种部分，例如另一种抗体。通过分光光度、光化学、生物化学、免疫化学、电子、光学或化学方法，标记可以是可检测的。例子包括但不限于，磁珠(例如，DynabeadsTM)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和ELISA中常用的其他酶)、和色度法标记例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。
在某些情况下，标记试剂是具有可检测标记的第二种抗体。备选地，第二种抗体可以缺乏标记，但它可以反而由经标记的第三种抗体结合，所述第三种抗体对于第二种抗体与之相对应的物种的抗体特异。第二种抗体可以用可检测部分例如生物素进行修饰，第三种经标记的分子可以与所述可检测部分特异性结合，例如酶标记的链霉亲和素。
能够特异性结合免疫球蛋白恒定区的其他蛋白质，例如蛋白质A或蛋白质G，也可以用作标记试剂。这些蛋白质是链球菌细菌的细胞壁的正常组成成分。它们显示出与来自各种物种的免疫球蛋白恒定区的强非免疫原性反应性(一般参见，Kronval，等人J.Immunol.，111：1401-1406(1973)；和Akerstrom，等人，J.Immunol.，135：2589-2542(1985))。
免疫测定法形式
用于从样品中检测目的靶蛋白质(例如，突变型人生长激素)的免疫测定法可以是竞争性或非竞争性的。非竞争性免疫测定法是其中直接测量被捕获的靶蛋白质的量的测定法。在一种优选的“夹心”测定法中，例如，对于靶蛋白质特异的抗体可以与抗体固定在其中的固体底物直接结合。它随后捕获测试样品中的靶蛋白质。因此被固定的抗体/靶蛋白质复合物随后被标记试剂结合，例如具有标记的第二种或第三种抗体，如上所述。
在竞争性测定法中，通过测量所加入的(外源)靶蛋白质被样品中存在的靶蛋白质从靶蛋白质特异的抗体中取代(或竞争掉)，间接测量样品中的靶蛋白质的量。在此类测定法的一般例子中，使抗体固定，并且使外源靶蛋白质进行标记。因为与抗体结合的外源靶蛋白质的量与样品中存在的靶蛋白质的浓度成反比，所以基于与抗体结合且因此固定的外源靶蛋白质的量可以因此测定样品中的靶蛋白质水平。
在某些情况下，western印迹(免疫印迹)分析用于检测且定量样品中的突变型多肽的存在。该技术一般包括基于分子量通过凝胶电泳使样品蛋白质分离，将经分离的蛋白质转移至合适的固体支持物(例如，硝化纤维素滤器、尼龙滤器、或经衍生的尼龙滤器)，并且使样品与特异性结合靶蛋白质的抗体一起温育。这些抗体可以是直接标记的，或备选地随后可以使用经标记的抗体(例如，经标记的绵羊抗小鼠抗体)检测，所述经标记的抗体与针对突变型多肽的抗体特异性结合。
其他测定法形式包括脂质体免疫测定法(LIA)，其使用经设计为结合特异性分子(例如，抗体)且释放被封装的试剂或标记的脂质体。被释放的化学制品随后根据标准技术进行检测(参见，Monroe等人，Amer.Clin.Prod.Rev.，5：34-41(1986))。
处理方法
除上文讨论的缀合物外，通过给处于发展疾病的危险中的受试者或具有疾病的受试者施用本发明的多肽缀合物，本发明还提供了预防、治愈或改善疾病状态的方法。另外，本发明提供了用于将本发明的缀合物靶向机体的特定组织或区域的方法。
提供下述实施例以举例说明本发明的组合物和方法，但不限制本发明。