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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810630828.3 (22)申请日 2018.06.19 (71)申请人 中国医学科学院阜外医院 地址 100037 北京市西城区北礼士路167号 (72)发明人 杨跃进黄沛森陈桂浩 (74)专利代理机构 北京三友知识产权代理有限 公司 11127 代理人 韩蕾姚亮 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) A61K 35/28(2015.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 9/00(2006.01) (54)发明名称 基于药。
2、物预处理的间充质干细胞来源外泌 体的制备方法 (57)摘要 本发明提供了一种基于药物预处理的间充 质干细胞来源外泌体的制备方法。 本发明的间充 质干细胞来源外泌体的制备方法包括： 采用他汀 类药物预处理间充质干细胞， 并培养处理后的间 充质干细胞以收集其分泌的外泌体。 本发明还提 供了他汀类药物在制备促进间充质干细胞的抗 凋亡能力和/或促归巢能力的制剂中的应用， 还 提供了他汀类药物在制备促进间充质干细胞分 泌具有心梗微环境改善作用和/或心肌修复能力 的外泌体的制剂中的应用。 权利要求书1页 说明书4页 附图12页 CN 108728410 A 2018.11.02 CN 108728410 。
3、A 1.一种间充质干细胞来源外泌体的制备方法， 该方法包括： 采用他汀类药物预处理间 充质干细胞， 并培养处理后的间充质干细胞以收集其分泌的外泌体。 2.根据权利要求1所述的方法， 该方法包括： 在间充质干细胞的培养基中加入他汀类药物预处理12-24小时后， 更换细胞培养基为 无外泌体的完全培养基继续培养； 48小时后收集条件培养基并利用超速离心法分离得到经 他汀类药物预处理间充质干细胞分泌的外泌体。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 其中， 所述超速离心法包括步骤： 收集条件培养基后， 300g离心10min去除细胞； 2000g离心20min去除细胞碎片； 16500g 高速离心30mi。
4、n去除大囊泡； 120000g超速离心70min收取沉淀并重悬后， 再次120000g超速 离心70min获得外泌体。 4.根据权利要求1或2所述的方法， 其中， 所述他汀类药物包括阿托伐他汀。 5.根据权利要求1或2所述的方法， 其中， 所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞或 脂肪间充质干细胞。 6.按照权利要求15任一项所述方法制备得到的外泌体。 7.他汀类药物在制备促进间充质干细胞的抗凋亡能力和/或促归巢能力的制剂中的应 用。 8.他汀类药物在制备促进间充质干细胞分泌具有心梗微环境改善作用和/或心肌修复 能力的外泌体的制剂中的应用。 9.根据权利要求7或8所述的应用， 其中， 所述他汀类。
5、药物包括阿托伐他汀； 优选地， 利 用1 M他汀类药物预处理间充质干细胞24小时。 10.根据权利要求7或8所述的应用， 其中， 所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞或 脂肪间充质干细胞。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108728410 A 2 基于药物预处理的间充质干细胞来源外泌体的制备方法 技术领域 0001 本发明是关于一种基于药物预处理的间充质干细胞来源外泌体的制备方法， 具体 是关于一种基于他汀类药物预处理的高效间充质干细胞来源外泌体的制备方法。 背景技术 0002 WHO统计数据表明： 2016年心血管疾病是全球第一大死因(约1760万人， 32.2)， 其中有948万人死于。
6、缺血性心脏病(17.3)(Collaborators GM.Global,regional,and national under-5mortality,adult mortality,age-specific mortality,and life expectancy,19702016:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.The Lancet 2017； 390(10100):1084-1150； Collaborators GCOD.Global, regional,and national ag。
7、e-sex specific mortality for 264causes of death,1980 2016:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.The Lancet 2017； 390(10100):1151-1210)。 急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)导致大量心肌缺血坏死， 继而被瘢痕组织替代引发心衰和死亡。 现有治疗手段无法有 效再生和修复心肌。 近年来干细胞移植治疗， 尤其是间充质干细胞(MSCs,mesenchymal stem ce。
8、lls)， 例如骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs)， 移植治疗AMI被寄予厚望(Orlic D,Kajstura J,Chimenti S,Jakoniuk I,Anderson SM,Li B,Pickel J,McKay R,Nadal-Ginard B,Bodine DM and others.Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium.Nature 2001； 410(6829):701-705； Fisher SA,Doree C,Mathur A,Marti。
9、n-Rendon E.Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure.Circulation Research 2015； 116(8):1361-1377； Afzal MR, Samanta A,Shah ZI,Jeevanantham V,Abdel-Latif A,Zuba-Surma EK,Dawn B.Adult Bone Marrow Cell Therapy for Ischemic Heart Disease:Evidence and Insights From Randomized C。
10、ontrolled Trials.Circ Res 2015； 117(6):558-575)。 然而临床研究 表明， 间充质干细胞虽能一定程度通过旁分泌保护作用改善梗死后心功能， 但效果并不显 著。 进一步研究表明， 其发挥旁分泌保护作用的主要机制是通过分泌一种细胞外囊泡结 构外泌体(exosome)实现的(Makridakis M,Roubelakis MG,Vlahou A.Stem cells: insights into the secretome.Biochim Biophys Acta 2013； 1834(11):2380-2384； Huang P,Tian X,Li Q,Y。
11、ang Y.New strategies for improving stem cell therapy in ischemic heart disease.Heart Fail Rev2016； 21(6):737-752； Lai RC,Arslan F,Lee MM ,Sze NS ,Choo A ,Chen TS ,Salto-Tellez M ,Timmers L ,Lee CN ,El OR and others.Exosome secreted by MSC reduces myocardial ischemia/reperfusion injury.Stem Cell Res 。
12、2010； 4(3):214-222)。 外泌体具有来源广、 稳定、 无免疫原性等优 点， 且BM-MSCs来源的外泌体(MSC-Exo)可改善心梗微环境， 因此， 有望成为新一代的心肌修 复产品(Lamichhane TN,Sokic S,Schardt JS,Raiker RS,Lin JW,Jay SM.Emerging Roles for Extracellular Vesicles in Tissue Engineering and Regenerative 说明书 1/4 页 3 CN 108728410 A 3 Medicine.Tissue Engineering Part B。
13、:Reviews 2015； 21(1):45-54)。 发明内容 0003 本发明的一个目的在于提供一种高效间充质干细胞来源外泌体的制备方法。 0004 本发明的研究发现， 他汀类药物例如阿托伐他汀(Atorvastatin,ATV)预处理间充 质干细胞， 可显著提高间充质干细胞的抗凋亡能力和促归巢能力， 制备出具有显著心梗微 环境改善作用和高效心肌修复能力的干细胞来源外泌体。 0005 一方面， 本发明提供了一种间充质干细胞来源外泌体的制备方法， 该方法包括： 采 用他汀类药物预处理间充质干细胞， 并培养处理后的间充质干细胞以收集其分泌的外泌 体。 0006 根据本发明的具体实施方案， 本。
14、发明的间充质干细胞来源外泌体的制备方法包 括： 0007 在间充质干细胞的培养基中加入他汀类药物预处理12-24小时后， 更换细胞培养 基为无外泌体的完全培养基继续培养； 48小时后收集条件培养基并利用超速离心法分离得 到经他汀类药物预处理间充质干细胞分泌的外泌体。 0008 根据本发明的具体实施方案， 本发明的间充质干细胞来源外泌体的制备方法中， 所述超速离心法包括步骤： 0009 收集条件培养基后， 依次离心去除细胞、 离心去除细胞碎片、 高速离心去除大囊 泡， 然后超速离心收取沉淀并重悬后， 再次超速离心获得外泌体； 0010 在本发明的一优选具体实施方案中， 收集条件培养基后， 300。
15、g离心10min去除细 胞； 2000g离心20min去除细胞碎片； 16500g高速离心30min去除大囊泡； 120000g超速离心 70min收取沉淀并重悬后， 再次120000g超速离心70min获得外泌体。 0011 根据本发明的具体实施方案， 本发明的间充质干细胞来源外泌体的制备方法中， 所述他汀类药物包括阿托伐他汀。 0012 根据本发明的具体实施方案， 本发明的间充质干细胞来源外泌体的制备方法中， 所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。 0013 另一方面， 本发明还提供了按照本发明所述方法制备得到的外泌体。 0014 另一方面， 本发明还提供了他汀类药物在制。
16、备促进间充质干细胞的抗凋亡能力 和/或促归巢能力的制剂中的应用。 0015 另一方面， 本发明还提供了他汀类药物在制备促进间充质干细胞分泌具有心梗微 环境改善作用和/或心肌修复能力的外泌体的制剂中的应用。 0016 根据本发明的具体实施方案， 本发明中， 所述他汀类药物包括阿托伐他汀； 优选 地， 利用1 M他汀类药物预处理间充质干细胞24小时。 0017 根据本发明的具体实施方案， 本发明中， 所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细 胞或脂肪间充质干细胞。 0018 在本发明的一个具体实施方案中， 利用1 M ATV预处理BM-MSC 24小时可获得具有 高效心肌修复和内皮保护功能的外泌体。 附。
17、图说明 说明书 2/4 页 4 CN 108728410 A 4 0019 图1A-图1C显示本发明实施例中间充质干细胞来源外泌体的鉴定结果。 0020 图2A-图2D显示不同浓度ATV预处理间充质干细胞来源外泌体对内皮细胞的作用 差异。 0021 图3A-图3H显示ATV预处理间充质干细胞来源外泌体促进血管内皮细胞成管、 迁移 和存活检测结果。 0022 图4A-图4F显示经ATV预处理间充质干细胞来源外泌体可显著改善大鼠心梗后心 功能、 减小梗死面积的检测结果。 0023 图5A-图5K显示经ATV预处理间充质干细胞来源外泌体的保护作用与其上调 lncRNAH19有关的检测结果。 具体实施。
18、方式 0024 下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的特点及所具有的技术效果， 但本发 明并不因此而受到任何限制。 实施例中， 各原始试剂材料均可商购获得， 未注明具体条件的 实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件， 或按照仪器制造商所建议的条件。 0025 实施例1 0026 间充质干细胞来源外泌体的制备方法： 利用差速贴壁法分离原代大鼠(Sprague- Dawley大鼠， 60-80g)BM-MSCs并传代扩增至第3-4代备用。 在BM-MSCs完全培养基(IMDM, Invitrogen,美国)中加入ATV预处理24小时后， 更换细胞培养基为无外泌体的完全培养基 (经超速离心18。
19、小时后得到的含10FBSIMDM)继续培养。 48小时后收取条件培养基并利用 超速离心法分离得到经ATV预处理BM-MSCs分泌的外泌体(MSCATV-Exo)。 超速离心法具体步 骤包括： 收取条件培养基后， 300g离心10min去除细胞； 2000g离心20min去除细胞碎片； 16500g高速离心30min去除大囊泡； 120000g超速离心70min收取沉淀并重悬后， 再次 120000g超速离心70min获得外泌体。 0027 对制备好的MSCATV-Exo进行鉴定： 包括电镜(HITACHI,H-600IV,日本)分析观察形 态结构， NTA(Malvern Instrument。
20、s,NanoSight,英国)分析外泌体的粒径分布以及通过 Western Blot检测外泌体蛋白标志物。 0028 比较不同浓度ATV预处理对MSCATV-Exo功能的影响， 筛选出最佳ATV预处理浓度。 利 用此最佳ATV浓度预处理制备的MSCATV-Exo进行功能学评价， 包括对血管内皮细胞的成管、 迁移和抗凋亡作用的影响和心肌内注射后改善大鼠心梗后心功能、 减小梗死面积的效果。 最后进行分子生物学评价， 即MSCATV-Exo中lncRNA H19表达水平检测。 0029 评价指标(研究结果) 0030 利用超速离心法分离得到的MSCATV-Exo在电镜下呈现球形或圆盘形， 大小在10。
21、0nm 左右； NTA分析其粒径分布在30-150nm范围内； Western Blot检测显示MSCATV-Exo高表达 TSG101、 Alix、 CD63、 CD81等外泌体蛋白标志物。 ATV预处理后与无预处理的BM-MSC分泌的外 泌体在形态、 粒径分布和蛋白标志物上没有显著差异。 具体结果可参见图1A-图1C， 其中， 图 1A： 电镜下观察间充质干细胞来源外泌体(MSC-Exo)的形态结构， 呈球形或圆盘形， 大小在 100nm左右， 经他汀预处理后形态不变； 图1B： 用NTA分析MSC-Exo的粒径分布， 他汀预处理和 未处理的MSC-Exo的粒径分布均在30-150nm范围。
22、内； 图1C： 外泌体的蛋白标志物鉴定， 他汀 预处理的MSC-Exo高表达TSG101、 Alix、 CD63、 CD81等外泌体蛋白标志物。 说明书 3/4 页 5 CN 108728410 A 5 0031 对通过不同浓度ATV(0.01、 0.1、 1、 10 M)预处理所得的MSCATV-Exo进行功能学分 析， 发现利用1 M ATV预处理得到的MSCATV-Exo促进内皮细胞成管和迁移的作用最为显著。 具体结果可参见图2A-图2D。 其中， 图2A-图2B： 不同浓度ATV(0.01、 0.1、 1、 10 M)预处理间充 质干细胞后提取的外泌体对内皮细胞成管的作用差异比较， 其。
23、中1 MATV预处理后效果最佳 (图2B)； 图2C-图2D： 不同浓度ATV预处理间充质干细胞后提取的外泌体对内皮细胞迁移的 作用差异比较， 其中1 M ATV预处理后效果最佳(图2D)。 0032 与未经ATV预处理的MSC-Exo相比， MSCATV-Exo可显著促进血管内皮细胞的成管和 迁移， 并能够促进缺氧无血清条件下内皮细胞的存活和抗凋亡作用。 具体可参见图3A-图 3H， 其中， 图3A-图3B： 成管试验， 与对照组相比， 经ATV预处理间充质干细胞来源外泌体 (MSCATV-Exo)显著促进血管内皮细胞成管； 图3C-图3D： 划痕试验， 与对照组相比， MSCATV-Exo。
24、 显著促进血管内皮细胞迁移； 图3E-图3F： 流式细胞学检测， 与对照组相比， MSCATV-Exo显著 促进血管内皮细胞在缺氧无血清条件下的存活； 图3G-图3H： Hoechst 33342染色， 与对照组 相比， MSCATV-Exo显著减少血管内皮细胞在缺氧无血清条件下的凋亡。 0033 与未经ATV预处理的MSC-Exo相比， MSCATV-Exo心肌内注射后可显著改善大鼠心梗 后心功能、 减小梗死面积。 具体可参见图4A-图4F， 其中， 图4A-图4B： 经ATV预处理间充质干 细胞来源外泌体(MSCATV-Exo)移植显著改善心梗大鼠心功能； 图4C-图4D： Masson染。
25、色显示 MSCATV-Exo移植显著减小大鼠心梗面积； 图4E-图4F： 天狼星红染色提示MSCATV-Exo移植显著 减小大鼠心梗局部胶原沉积。 0034 与MSC-Exo相比， MSCATV-Exo高表达lncRNA H19， 达到10倍以上。 利用小干扰RNA敲 低经ATV预处理的MSC中lncRNA H19的表达水平再提取其分泌的外泌体(MSCATV(Si)-Exo)则 上述保护作用消除， 说明lncRNA H19与MSCATV-Exo高效的内皮细胞保护作用、 心功能改善以 及缩小梗死面积的作用有关。 具体可参见图5A-图5K， 其中， 图5A-图5B： 经ATV预处理间充质 干细胞来。
26、源外泌体(MSCATV-Exo)高表达lncRNA H19， 利用小干扰RNA敲低后的外泌体(MSCATV (Si)-Exo)中lncRNA H19表达水平显著下降； 图5C-图5H： 与MSCATV-Exo相比， MSCATV(Si)-Exo 的内皮保护作用减弱； 图5I-图5K： 与MSCATV-Exo相比， MSCATV(Si)-Exo的改善梗死后心功能、 心肌修复的作用减弱。 0035 结论： 利用1 M ATV预处理BM-MSC 24小时可获得具有高效内皮保护和心肌修复功 能的外泌体， 其机制与上调外泌体中lncRNAH19水平有关。 说明书 4/4 页 6 CN 108728410。
27、 A 6 图1A 图1B 说明书附图 1/12 页 7 CN 108728410 A 7 图1C 图2A 图2B 说明书附图 2/12 页 8 CN 108728410 A 8 图2C 图2D 图3A 说明书附图 3/12 页 9 CN 108728410 A 9 图3B 图3C 图3D 说明书附图 4/12 页 10 CN 108728410 A 10 图3E 图3F 图3G 说明书附图 5/12 页 11 CN 108728410 A 11 图3H 图4A 说明书附图 6/12 页 12 CN 108728410 A 12 图4B 图4C 图4D 说明书附图 7/12 页 13 CN 108728410 A 13 图4E 图4F 图5A 说明书附图 8/12 页 14 CN 108728410 A 14 图5B 图5C 图5D 说明书附图 9/12 页 15 CN 108728410 A 15 图5E 图5F 图5G 说明书附图 10/12 页 16 CN 108728410 A 16 图5H 图5I 图5J 说明书附图 11/12 页 17 CN 108728410 A 17 图5K 说明书附图 12/12 页 18 CN 108728410 A 18 。