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新的偶合方法
    【技术领域】

    本发明涉及一种生产含有肽键的化合物的新方法。现有技术

    众所周知，在现有工艺中肽键一般是通过胺和羧酸的偶合来形成的。

    这种偶合反应常常在存在所谓的“偶合试剂”的条件下进行，其中所说的偶合试剂如草酰氯、EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐)、DCC(二环己基碳化二亚胺)、异丁基氯甲酸酯、HBTU([N，N，N′，N′-四甲基-O-(苯并三唑-I-基)脲阳离子六氟代磷酸酯])、HATU(O-(aza苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲阳离子六氟代磷酸酯)或TBTU([N，N，N′，N′-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲阳离子四氟硼酸酯])，以及适当的碱。

    这类物质一般被用于增强偶合反应的效率和/或给出想要的“偶合”产物，这类物质的缺点是它们很昂贵。此外，它们还可能促进副反应的进行和/或副产物的形成，这样就导致在使用这些被偶合的产物前就必须对其进行纯化，和/或向环境中排放的化学废液的水平超标。

    因此，需要一种改进的、经济有效的方法来形成肽键。该类方法应该优选的将所需使用的试剂的量减到最小，减少副反应地数目和形成的副产物的量，并且还能减少在被偶合产物在进一步加工前所需除去的副产物的量。.

    欧洲专利中请EP168 769和EP336 368，以及US专利号为5,359,086的美国专利公开了N-羟基酸酐(NCAs)与环氨基酸的偶合，其中所说的环氨基酸如脯氨酸及其酯。在这文件中并没有提及NCAs与环氨基酸酰胺的偶合。

    我们令人吃惊的发现，可以通过一种有效率的一步法过程来形成肽键，在该方法中，NCAs直接与特别的环状氨基酸酰胺衍生物偶合。本发明的描述

    本发明的第一方面是要提供一种生产如式I所示的化合物的方法，其中

    R1代表H或C1-3烷基，该烷基可任意被一个或多个取代基所取代和/或末端带有一个或多个取代基，所述取代基选自卤素、氰基、硝基、S(O)2NH2、C(O)R4、C(O)OR5、SR6、S(O)R7、S(O)2R8、N(R9)R10或OR11；

    R2代表C1-8烷基、-A1-C4-8环烷基或-A1-C6-10芳基，所有的这些基团都可以被一个或多个取代基随意取代，所述取代基选自C1-4烷基(该基团可以任意的被一个或多个卤素取代基所取代)、亚甲基二氧、卤素、氰基、硝基、S(O)2NH2、C(O)R4、C(O)OR5、SR6、S(O)R7、S(O)2R8、N(R9)R10或OR11；

    R3代表N(R12)R13或CH(R12)R13；

    R13在每次出现时代表苯基、C1-3烷基苯基或C(O)苯基，所有这些基团都可以任意的被一个或多个选自氰基、脒基、羟基脒基、卤素、C1-4烷基(该基团可以任选的被一个或多个卤素基团所取代)、SR6、N(R9)R10或OR11的取代基所取代；

    R9和R10在每次出现时分别代表H、C1-4烷基或C(O)R14；

    A1在每次出现时代表一个单键或C1-4亚烷基；

    n代表1、2或3；

    R5在每次出现时代表H、C1-6烷基或C1-3烷基苯基，其中后者可以任意的被一个或多个取代基所取代，这些取代基选自C1-4烷基(该基团可以被一个或多个卤素取代基所取代)、亚甲二氧基，卤素、氰基、硝基、S(O)2NH2、C(O)R4、C(O)OR5a、SR6、S(O)R7、S(O)2R8、N(R9)R10或OR11；

    R4、R5a、R6、R11、R12和R14在每次出现时分别代表H和C1-4烷基；以及

    R7和R8在每次出现时分别代表C1-4烷基，

    该方法包括将如式II所示的化合物与如式III所示的化合物反应，其中R1和R2的定义同上，其中R3和n的定义同上，

    该方法在下文中被称为“本发明的方法”。

    R1、R2、R4、R5、R5a、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R14所代表的烷基和可以取代R2、R5和R13的烷基均可以是直链烷基，并且当有足够数目的碳原子(如三个)时也可以是支链烷基和/或环烷基。此外，当有足够的碳原子数(即四个)时，该类烷基也可以是部分环状的/无环的。该类烷基也可以是饱和烷基，或当有足够的碳原子数(即两个)时，可以是不饱和烷基和/或中间杂有氧原子。

    为了避免疑惑，R5和R13所代表的烷基苯基基团的连接点在该类基团的烷基部分。该类基团的烷基部分可以是直链或，当有足够的碳原子数(即三个)时可以是支链烷基。该类烷基也可以是饱和的烷基或，当有足够的碳原子数(即两个)时可以是不饱和的烷基和/或中间杂有氧原子。

    A1代表的烯基链可以是直链烯基或，当有足够的碳原子数时可以是支链烯基。该类链也可以是饱和的烷基或，当有足够的碳原子数(即两个)时可以是不饱和的和/和中间杂有氧原子。

    这里所使用的定义“卤素”包括氟、氯、溴或碘。

    优选的R1包括C1-3烷基(如乙基或，尤其是甲基基团)，该基团被取代基C(O)OR5所取代和/或封端，当烷基是C2-3烷基基团时，更优选C(O)OR5取代基并不位于NH基团也与之相连的那个碳原子上。优选的R5包括H、直链或支链C1-3烷基(如异丙基或乙基)或C1-2烷基苯基(如苄基)。

    优选的R2包括-Al-C5-7环烷基或-Al-苯基，其中，在两种情况中，A代表单键或C1-2烯亚烷基。尤其优选的R2基团包括环己基。

    优选的R3包括N(R12)R13，其中R12代表C1-2烷基或，尤其是H和R13代表C1-2烷基苯基(如苄基)，该基团可以被脒基、羟基脒基或，优选的氰基所取代，该取代基优选的位于该基团的苯基部分(相对于C1-2烷基而言)的4位。当R13代表苯基部分被脒基、羟基脒基或氰基取代的烷基苯基时，可以被提及的另外一些取代基团包括苯基部分被一个或多个卤素原子(如氟)任意取代的基团。

    优选的n值为2，尤其优选1。

    本发明的方法优选的是在存在合适的碱和适合的溶剂的条件下进行的，其中的溶剂系统可以包含水和/或有机溶剂。所使用的碱和溶剂系统应该不与所形成的反应物或产物起化学反应、或使其产生立体化学变化、或导致其它副反应。

    合适的碱包括无机碱和有机碱，其中所说的无机碱实例如氢氧化物、醇化物、碱金属(如Na或K)的碳酸氢盐或碳酸盐，其中所说的有机碱实例如常用的叔胺碱(如三乙胺，二异丙基乙基胺和N-甲基吗啉)。尤其优选的碱包括胺碱。

    适合的含水溶剂包括水。适合的有机溶剂包括醋酸酯(如乙酸乙酯、异丙基醋酸酯、丁基醋酸酯)、乙腈、甲苯、二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺和这些溶剂中任何一些的混合物。

    优选的在所使用的溶剂系统中存在水。我们已经有益的发现，当用水作为溶剂时，本方法的效率对所使用的式III的胺的固态性质不敏感。

    式II的NCA化合物在现有技术中是已知的或可以用常规的方法进行制备(例如参见在德国专利申请DE40 11 171和国际专利申请WO96/12729中所描述的类似方法)。

    例如，式II的化合物可以通过将式IV的氨基酸化合物与碳酰氯反应来进行制备，其中R1和R2的定义同上。例如，该反应可以在适宜的溶剂如四氢呋喃的存在下在升高温度(如在30℃和回流温度之间)的条件下来完成。

    式IV的化合物可以通过将相应的式IV的化合物与式V的化合物进行反应来进行制备，其中在所说的式IV的化合物中R1代表任意取代的/末端取代的C1-3烷基，且其可任选地以酸(如盐酸)加成盐的形式存在，其中在所说的相应的式IV的化合物中R1是H、或一种酸(如盐酸或烷基磺酸)的附加成盐。式(V)化合物是：

                       R1a-L1                  V其中L1代表一个适宜的离去基团(如卤素(例如CL、Br或I)、三氟甲基磺酸酯、甲苯磺酸酯、甲磺酰酯等等)且R1a代表C1-3烷基，该烷基可以被一个或多个取代基取代和/或末端取代，其中所说的取代基选自卤素、氰基、硝基、S(O)2NH2、C(O)R4、C(O)OR5、SR6、S(O)R7、S(O)2R8、N(R9)R10或OR11，且R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10和R11的定义同前。该反应可以通过例如在室温和回流温度之间的温度下，在存在合适的溶剂系统(如水和/或有机溶剂(如四氢呋喃、乙酸乙酯、甲苯、乙腈等等)，包括水/四氢呋喃混合物和水/乙酸乙酯混合物)的条件下进行，在该反应体系中可任选地存在碱(如无机碱，例如碳酸氢钾)。熟练操作者会意识到在进行这一反应之前想要将式IV各化合物的羧酸基团用适合的保护基团(如苄基)保护起来。

    R1代表H且可选择性的以酸(如盐酸)加成盐形式存在的式IV的化合物可以通过将相关的式II的化合物在适宜的反应条件下进行水解来进行制备，其中在所说的式II的化合物中的R1代表H。熟练操作者会意识到可能和/或想要用适合的保护试剂(如苯甲醇)保护式IV的生成物化合物的羧酸基团。

    作为供替代的另外一种选择，R1代表被C(O)OR5取代或末端是C(O)OR5的C1-3烷基的式IV的化合物时，如果其中R1是C2-3烷基，则C(O)OR5基团并不位于连有NH基团的碳原子上时，则该化合物可以通过将相关的式IV的化合物在存在式VI的化合物或式VII的化合物的情况下，在合适的反应条件下进行氢化作用来进行制备，其中在所说的式IV的化合物中，R1代表H。式VI的化合物如下：

                  OHC-R1b               VI式VIII的化合物如下：其中，在两种情况中，R1b代表C(O)OR5或C1-2烷基，该烷基被C(O)OR5所取代或末端是C(O)OR5，且R5所的定义同前，并且在式VII的化合物的情况中，Ra基团单独代表C1-4烷基基团或连接起来形成一个C2-4烯基链。R1是氢的式IV的化合物与式VI的化合物或式VII的化合物的反应例如可以在存在合适的溶剂系统(如烷基醇(例如甲醇、乙醇、异丙醇或正丙醇)，其中所用的醇应该能够避免相关反应中的反应物或产物的反-酯化反应)的条件下进行，并且，可以任意的存在一些合适的酸，如无机酸(例如HCl)或有机酸(例如甲磺酸、甲苯磺酸等等)。熟练操作者会意识到这些反应可以在室温下或在高于室温的温度下(例如高至所使用溶剂的回流温度(例如约40到60℃，如约50℃))、在氢气例如在氢气正压力(例如3到8(例如4到6，如5))下、在存在合适的氢化作用催化剂体系(例如Pd/C/Pt/C)的条件下进行。熟练操作者也会知道改变相关反应的反应压力会改变溶剂的回流温度。

    本发明的第二个方面是要提供一种制备式IV的化合物的方法，其中在所说的式IV的化合物中R1代表C1-3烷基，该烷基被C(O)OR5所取代或末端是C(O)OR5，如果其中R1是C2-3烷基，则C(O)OR5基团并不位于连有NH基团的碳原子上，该方法包括在存在前面所定义的式VI的化合物或式VII的化合物的情况下对相关的式IV的化合物进行氢化作用，其中在所说的式IV的化合物中R1代表H。

    与本文或现有技术所描述的制备相同的化合物的其它方法相比，这些用于制备R1代表C1-3烷基，该烷基被C(O)OR5所取代或末端是C(O)OR5的式IV的化合物的方法的优点在于，该化合物用这些方法可以通过几步被制备出来。尤其特别的是，正如在本文所描述的，这种方法在与例如式V的化合物进行偶合前不需要对R1代表H的式IV的化合物中的羧酸基团进行保护。

    式III、V、VI和VII的化合物可以买到，或者在现有文献中是已知的，或者可以通过这里所描述的类似的方法或一般的合成方法，使用标准技术，用合适的试剂和反应条件从一些易于得到的起始物质来得到。

    在芳基(例如苯基)和(如果适当的话)杂环上的取代基，在这里所定义的化合物上的基团可以用一些本领域技术人员所公知的技术被转化成一些其它的取代基。例如，氨基可以被转换成酰胺，酰胺可以被水解成氨基，羟基可以被转换成烷氧基，烷氧基可以被水解成羟基，以及在合适的情况下，氰基可以被转换成脒基或羟基脒基。

    本领域熟练操作者应当意识到，在上述方法中，中间化合物的功能基团可以被或需要被保护基团保护起来。特别是想要用合适的保护基团(例如苄基基团)将式IV的化合物(及其酸附加盐)的羧酸基团保护起来，该保护基团在与碳酰氯反应之前可以被除去。

    想要被保护的功能基团包括羟基、氨基和羧酸。适合的保护羟基的基团包括三烷基甲硅烷基和二芳基烷基甲硅烷基(如三-丁基二甲基甲硅烷基，三丁基二苯基甲硅烷基和三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基和烷基羰基(如甲基-和乙基羰基)。适合的氨基保护基团包括苄基、三-丁氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基或苄氧基羰基。适合的羧酸保护基团包括C1-6烷基、烯丙基或苄基酯。

    功能基团的保护和去保护可以发生在前面所述的任意一个反应步骤之前或之后。

    可以用本领域熟练操作者所公知的技术和下面所描述的技术来除去保护基团。

    保护基团的使用的详细描述见“Protective Groups in OrganicChemistry”，由JWF McOmie编辑，Plenum Press(1973)，和“Protective Groups in Organic Synthesis”，第3版，TW Greene&PGM Wutz，Wiley-Interscience(1999)。

    通过本发明的方法制备的式I的化合物可以被用于随后的肽偶合反应和/或可以被转换成其它的式I的化合物。例如R3代表N(R12)R13，其中R13代表苯基、C(O)苯基，或，优选地，(在相关的苯基部分)被氰基取代的C1-3烷基苯基(如苄基)(例如，在C1-3烷基苯基的情况中，在相对于C1-3烷基部分的4-位上被取代)的式I的化合物可以用本领域熟练操作者公知的技术被转化成相关的苯基被脒基，或优选地，羟基脒基所取代的等效的式I的化合物(如羟胺)。

    因此，本发明的方法可用于生产含有肽键的化合物，而且，尤其可用于生产含有环状氨基酸基团的肽化合物。

    本发明的方法具有令人吃惊的优点，即式I的肽化合物可有效的从易于得到的起始物质在不需要使用偶合剂的情况下得到。

    此外，本发明的方法的另外一个优点是，与现有技术中所描述的制备方法相比，用本发明的方法制备式I的化合物时可以有很高的收率，但是却可以使用较少的时间，并且更方便，成本更低。

    用下面的实施例对本发明进行阐述，但本发明并不仅限于下面的实施例。实施例12-[((1R)-2-{(2S)-2-[({4-氰基苄基}-氨基)羰基]氮杂环丁基}-1-环己基-2-氧代乙基)氨基]乙酸乙酯(a)(2R)-2-氨基-2-环己基乙酸苄酯甲磺酸苄盐

    以一定速率向(2R)-2-氨基-2-环己基乙酸(200g，1.27mol)和苯甲醇(276g，2.54mol)在甲苯(1600mL)的混悬液中加入甲磺酸，该速率使得温度达不到100℃。将该反应在110到115℃之间再搅拌6小时。然后用Dean-Stark汽水分离器将产生的水蒸馏除去。将另外一份苯甲醇(276g，2.54mol)加入其中且将反应物再用水蒸馏12小时。然后将该反应混合物冷却，向其中加入甲基三丁基醚诱发结晶。将该产物过滤，干燥，得到404g(92％)的副标题化合物。(b)(2R)-2-环己基-2-[(2-乙氧基-2-氧乙基)氨基]乙酸苄酯盐酸盐

    向KHCO3(222g，2.22mol)在水中的混悬液中分批加入(2R)-2-氨基-2-环己基乙酸苄酯甲磺酸盐(200g，0.58mol，得自上述步骤(a))。在加完后，将该混合物在20到25℃搅拌15分钟。然后，将该混合物用四氢呋喃(150mL)在连续搅拌得条件下进行稀释，搅拌30分钟。将溴代醋酸乙酯在1小时内加入其中，然后将该混合物在35℃搅拌8小时。然后将温度升高到50℃，再反应4小时。将该反应混合物冷却到室温，然后用甲苯(450mL)进行稀释。将两相分离，有机层用水洗涤两次，浓缩，过滤，用溶于庚烷的盐酸将盐酸盐形式的产物分离出来。在干燥后。得到199g(93％)的副标题产物。(c)(2R)-2-环己基-2-[(2-乙氧基-2-氧乙基)氨基]乙酸(供替代的选择A)

    将溶解于异丙醇(320mL)中的(2R)-2-环己基-2[(2-乙氧基-2-氧乙基)氨基]乙酸苄酯盐酸盐(40g，0.1mol，得自上述步骤(b))在存在5％Pd/C(2g，50％水溶液)的情况下在30℃下水解3h。在通过过滤除去催化剂后，将该滤液用氢氧化四丁基铵中和，将pH调整到5.2。为了除去生成的水，将该混悬液蒸发，用异丙醇洗涤，然后干燥，得到49g(94％)的副标题化合物。(供替代的选择B)

    将乙醛酸乙酯(50％，在甲苯中；71.5g)加入到(2R)-2-氨基-2-环己基乙酸(10g；64mmol)和甲磺酸(4.9g；0.51mol)在乙醇(100mL)的混合物中。将该混合物在存在0.5g的5％Pd/C的情况下，在5atm.的压力，22℃的温度下水解6小时。然后将该混合物加热到50℃，将水解在持续进行14小时。通过过滤将该催化剂除去，将pH调到4至5。向生成物凝胶状结晶浆料中加入水(200mL)，然后将该固体过滤，洗涤，干燥，得到9.4g(50％)、白色粉末态的副标题化合物。IH NMR(D2O)δ1.29(t)，ca.1.1-1.4(m)，ca.1.6-1.9(m)，ca.2.0-2.2(m)，4.04(d)，4.08(q)，4.31(q)13C NMR(D2O)δ13.9，25.9，26.1，26.3，28.5，29.0，39.4，47.6，64.4，66.1，167.7，170.9(d)2-[(4R)-4-环己基-2，5-二氧-1，3-唑烷-3-基]乙酸乙酯

    在40℃下，将碳酰氯(28.9kg，291.9mol)在1小时内加入到溶于四氢呋喃(340kg)中的(2R)-2-环己基-2-[(2-乙氧基-2-氧乙基)氨基]乙酸(44.2kg，182mol，用上述的步骤(c)中所描述的类似的方法(供替代的选择A)获得的)中。在又进行1小时后认为该反应已经完全。将该反应物在减压下浓缩。将残余物用四氢呋喃(272.6kg)稀释，然后在0℃下将pH用N-甲基吗啉(15.3kg)调节到6.5。使该反应再连续进行45分钟。然后将HCl/二噁烷(0.34kg)加入其中，通过Celitet将残渣过滤除去。将滤饼用四氢呋喃洗涤两次。将滤液合并，然后在20℃下减压浓缩。向该残余物中加入庚烷(250kg)，然后再将该混合物浓缩。再向所得的残余物中加入庚烷(81kg)。将温度调至0℃，然后使该混合物结晶5小时。将该结晶过滤，洗涤(3×30kg庚烷)，干燥(低压，20℃)，得到46kg(95％)的副标题化合物。13C NMR：δ168.2，167.9，152.3，65.3，61.2，43.8，37.5，27.3，26.0，25.6，25.2，13.9(e)2-[((1R)-2-{(2S)-2-[({4-氰基苄基}氨基)羰基]氮杂环丁基}-1-环己基-2-氧代乙基)氨基]乙酸乙酯

    在30℃下，将4-甲基吗啉(4.9g，48.6mmol)加入到(2S)-N-(4-氰基苄基)-2-氮杂环丁烷羰基酰胺(carboxamide)(10.8g，43.9mmol，由与国际专利WO94/29336、WO99/64391和WO00/12473中所描述的方法类似的方法制备而得)和2[(4R)-4-环己基-2，5-二氧-1，3-唑烷-3-基]乙酸乙酯(11.6g，42.2mmol，将上述步骤(d))在乙酸乙酯(28mL)中的混悬液中。在搅拌5分钟后，将氯化钠(水溶液，9.3mL，10％w/w和0.066％EDTA)加入其中。在又搅拌3小时后，将含有标题化合物的有机层分离出来，得到99％想要的化合物。13C NMR(CDCl3)：δ14.3，19.2，26.1，26.2，26.4，29.2，30.0，41.1，42.9，48.6，49.5，61.0，62.0，62.8，111.1，118.9，128.1×2，132.5×2，144.1，171.1，172.4.175.7实施例22-({(1R)-1-环己基-2-氧-2-[(25)-2-(2-苯乙酰基)氮杂环丁基]-乙基}氨基)乙酸乙酯

    向1-[(S)-氮杂环丁基]-2-苯基-1-乙酮盐酸盐(9g，20mmol)和2-[(4R)-4-环己基-2，5-二氧-1，3-唑烷-3-基]乙酸乙酯(6.7g，25mmol，见上述实施例1(d))在乙酸乙酯(50mL)中的溶液中加入N-甲基吗啉(4mL，40mmol)。当根据HPLC认为该反应已经进行完全时，通过萃取逐步累积反应产物。浓缩得到7g(84％)油状的标题化合物。LC-MS：(m+1)＝417(m/z)实施例32-[((1S)-2-{(2R)-2-[({4-[{[(苄氧基)羰基]氨基(羟基亚氨基)甲基]苄基}-氨基)羰基]氮杂环丁基}-1-环己基-2-氧乙基)氨基]乙酸乙酯

    向[4-({[(2S)氮杂环丁基羰基]氨基}甲基)苯基](羟基亚氨基)甲基氨基甲酸苄酯盐酸盐(11.7g，25mmol)和2-[(4R)-4-环己基-2，5-二氧-1，3-唑烷-3-基]乙酸乙酯(6.7g，25mmol，见上述实施例1(d))在四氢呋喃(55mL)中的溶液中加入N-甲基吗啉(5mL，50mmol)。当根据HPLC认为该反应已经进行完全时，将该反应物过滤，通过萃取逐步累积反应产物。干燥，浓缩，得到油状的想要得到的化合物(77％)。LC-MS：(m+1)-608(m/z)实施例4

    用与类似于上述的方法制备了下面的化合物：

    2-[((1R)-2-{(2S)-2-[({4-[氨基(羟基亚氨基)甲基]苄基}氨基)羰基]氮杂环丁基}-1-环己基-2-氧乙基)氨基]乙酸乙酯二(三氟甲磺酸盐)。