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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201210167423.3 (22)申请日 2012.05.28 C07D 303/32(2006.01) C07D 303/38(2006.01) C07D 301/32(2006.01) A61K 31/336(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 南京中医药大学 地址 210082 江苏省南京市汉中路 282 号 (72)发明人 段金廒 陶伟伟 杨念云 唐于平 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 杨海军 CN 101397244 A,2009.04.01,。
2、 CN 101530408 A,2009.09.16, 梁侨丽 等.大戟科Casbane烷型二萜化合物 的研究进展 .天然产物研究与开发 .2009, 第 21 卷 ( 第 3 期 ),545-547. Qiao-Li Liang， 等 .A new cytotoxic casbane diterpene from Euphorbia pekinensis.Fitoterapia .2009, 第 80 卷 ( 第 8 期 ),514-516. 梁侨丽 等 . 京大戟的化学成分研究 .中草 药 .2008, 第 39 卷 ( 第 12 期 ),1779-1781. 訾华浦 等.西松烷型二萜对小。
3、鼠H22肝癌腹 水瘤的抑制作用及其机制 .青岛大学医学院学 报 .2010, 第 46 卷 ( 第 4 期 ),315-318. (54) 发明名称 具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物及其 应用 (57) 摘要 本发明公开了具有抗肿瘤活性的新西松烷型 二萜化合物。 体外抗肿瘤活性研究表明， 本发明提 供的西松烷型二萜化合物对多种肿瘤细胞， 包括 胃癌、 结肠癌、 肝癌或肾癌等均具有很强的抗肿瘤 活性， 且经过毒性实验研究表明， 本发明提供的具 有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物毒性较低， 可望开发成新的抗肿瘤药物。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王伟 (19)中华人民共和国国。
4、家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 102675252 B 2016.06.29 CN 102675252 B 1.具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物， 其特征在于， 其结构式如下： 其中R羧基。 2.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物在制备抗肿瘤药物中的应 用。 3.根据权利要求2所示的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物在制备抗肿瘤药物中 的应用， 其特征在于， 所述的肿瘤为胃癌、 结肠癌、 肝癌和肾癌。 权利要求书 1/1 页 2 CN 102675252 B 2 具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物及其应用 技术领域 0001 本发明。
5、涉及具有抗肿瘤活性的化合物， 具体涉及从中药京大戟中提取的得到的具 有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物新化合物及其在预防和治疗肿瘤疾病中的用途， 属医 药技术领域。 背景技术 0002 恶性肿瘤是严重危害人类健康和生命的多发病和常见病， 早在20003000年前埃 及和我国已有关于肿瘤的记载。 包括中国在内的很多国家， 尤其是中等发达国家， 恶性肿瘤 所致死亡在所有死亡原因中占首位或第二位， 且发病率在世界范围内仍呈上升趋势， 在肿 瘤的术疗、 放疗、 化疗、 生物治疗四大疗法中， 化疗仍是主要的治疗方法， 现有的化疗药物抗 肿瘤活性有限， 且毒副作用较大， 病人耐受能力差， 且价格昂贵。 因此。
6、， 通过研究天然植物中 的化学抗癌物质预防癌症的发生和发展， 已成为癌症化学预防研究的一个重要领域， 并受 到世界各国科学界的普遍关注及研究热点。 0003 京大戟 （EuphorbiaePekinensisradix） 为大戟科植物大戟Euphorbia PekinensisRupr.的干燥根。 味辛， 性温； 有大毒。 归肝经。 具有泻水逐饮， 消肿散结的功 效。 为历版中国药典收载的中药材品种。 已有研究报道， 大戟属植物富含强抗肿瘤的二萜， 但对中药京大戟的化学成分和生物活性研究报道甚少， 本发明对京大戟化学成分进行系统 深入研究， 分离得到具有抗肿瘤活性的新西松烷型二萜化合物。 发明。
7、内容 0004 发明目的： 本发明的目的是为了克服现有技术的不足， 提供一种具有强抗肿瘤活 性的新的西松烷型二萜化合物及其在预防和治疗肿瘤疾病中的用途。 0005 技术方案： 为了实现以上目的， 本发明采取的技术方案为： 0006 具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物， 其结构式如下： 0007 0008 其中R为醛基或羧基， 为新的西松烷型二萜化合物， 其中当R为醛基时新化合物命 名为pekineninsD， 当R为羧基时新化合物命名为pekineninsE。 0009 本发明提供的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物的提取分离方法包括以下 步骤： 0010 1、 取干燥的京大戟根， 用80-1。
8、00%乙醇提取2至3次， 每次1至3小时， 合并提取液， 回 说明书 1/6 页 3 CN 102675252 B 3 收乙醇后， 得到乙醇提取物； 0011 2、 取乙醇提取物加水混悬， 用石油醚萃取， 得到石油醚部位。 0012 3、 取石油醚部位采用硅胶柱层析， 先以石油醚： 乙酸乙酯=10： 1的洗脱剂洗脱， 然 后以石油醚： 乙酸乙酯=3： 1的洗脱剂洗脱， 得到石油醚： 乙酸乙酯=3： 1的洗脱部位反复柱层 析， 得到新的西松烷型二萜化合物pekineninsD和pekineninsE。 0013 以上制备方法中， 步骤1提取方法可以是冷浸、 渗漉、 微波提取、 超声提取、 回流提。
9、 取等。 0014 以本发明提供的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物， 将西松烷型二萜化合物 （pekineninsD和pekineninsE） 和药学上可接受的载体制备成片剂、 胶囊剂、 注射剂、 粉针 剂、 颗粒剂、 脂肪乳剂、 微囊、 滴丸、 软膏剂或透皮控释贴剂等剂型。 0015 将本发明提供的西松烷型二萜化合物制成片剂时， 把西松烷型二萜化合物和乳糖 或玉米淀粉， 需要时加入润滑剂硬脂酸镁， 混合均匀， 整粒， 然后压片制成片剂。 0016 本发明提供的西松烷型二萜化合物制成胶囊剂时把西松烷型二萜化合物和载体 乳糖或玉米淀粉混合均匀， 整粒， 然后装胶囊制成胶囊剂。 0017 本发明。
10、提供的西松烷型二萜化合物制成颗粒剂时， 把西松烷型二萜化合物和稀释 剂乳糖或玉米淀粉、 混合均匀， 整粒， 干燥， 制成颗粒剂。 0018 本发明提供的西松烷型二萜化合物制成粉针剂、 注射液时加入载体按药学常规方 法制备得到。 0019 本发明提供的西松烷型二萜化合物制成脂肪乳剂、 软膏剂或透皮控释贴剂等剂型 时加入载体按药学常规方法制备得到。 0020 本发明提供的的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物 （pekineninsD和 pekineninsE） 在制备抗肿瘤药物中的应用。 0021 作为优选方案， 本发明提供的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物在制备抗肿 瘤药物中的应用， 所述的肿。
11、瘤为胃癌、 结肠癌、 肝癌或肾癌。 0022 有益效果： 本发明提供的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物和现有技术相比 具有以下优点： 0023 本发明通过对京大戟化学成分进行系统深入研究， 经过波谱和质谱数据分析表明 从京大戟根中分离得到二个西松烷型二萜化合物 （pekineninsD和pekineninsE） ， 为新化 合物。 且经过体外抗肿瘤活性研究表明， 本发明提供的西松烷型二萜化合物对多种肿瘤细 胞， 包括胃癌、 结肠癌、 肝癌或肾癌等均具有很强的抗肿瘤活性， 且经过毒性实验研究表 明， 本发明提供的具有抗肿瘤活性的西松烷型二萜化合物毒性较低， 是一种优良的抗肿瘤 新化合物， 可开。
12、发成新的抗肿瘤药物。 附图说明 0024 图1为pekineninsD的结构示意图； 0025 图2为pekineninsE的结构示意图； 0026 图3为pekineninsD的1HNMR图； 0027 图4为pekineninsD的13CNMR图； 0028 图5为pekineninsE的1HNMR图； 说明书 2/6 页 4 CN 102675252 B 4 0029 图6为pekineninsE的13CNMR图。 具体实施方式 0030 根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。 然而， 本领域的技术人员容易理解， 实 施例所描述的具体的物料配比、 工艺条件及其结果仅用于说明本发明， 而。
13、不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。 0031 实施例1西松烷型二萜化合物的制备 0032 取京大戟根20公斤， 粉碎后以8倍量浓度为95%乙醇提取两次， 每次2小时， 合并提 取液， 回收乙醇后， 低温干燥， 得乙醇提取物。 乙醇提取物以水混悬后， 以1： 1量的石油醚萃 取3次， 回收石油醚， 得到石油醚部位。 石油醚部位采用硅胶柱层析， 先以石油醚： 乙酸乙酯= 10： 1洗脱10个柱体积， 然后以石油醚： 乙酸乙酯=3： 1洗脱， 合并石油醚： 乙酸乙酯=3： 1洗脱 部位， 进行反复柱层析， 得到pekineninsD （收率： 36 .0mg） ， 结构式如图1所示，。
14、 和 pekineninssE （收率： 28.0mg） ， 结构式如图2所示。 0033 pekineninsD的结构解析： 白色粉末， 高分辨质谱给出m/z319.2273M+H+， 分 子式： C20H30O3。 如图3所示， 1HNMR谱显示该化合物存在4个甲基 1.17(s,H3-16), 1.21(s,H3-17), 1.63(s,H3-19), 1.27(s,H3-20)， 1个与吸电子基团相连的 次甲基质子信号 （ 4.10， dd） ;2个稀键质子信号 （ 5.92,d） 和 （ 5.09,t） ， 1个醛基质子 信号 （ 10.08,s） 。 如图4所示， 13CNMR谱结。
15、合DEPT光谱表明该化合物具有4个甲基， 5个亚 甲基， 7个次亚甲基以及4个季碳， 确定pekineninsD的母核为西松烷型二萜。 1HNMR谱存在 质子信号 （ 2.88,dd） 以及13CNMR谱信号 （ 62.4， 59.7） 表明存在环氧基团， 综合HMBC、 NOE确定取代基的链接位置以及构型， 最终确定pekineninsD的结构式， 化学名称为： 5 - hydroxy-1 H,2 H-casba-11 ,12 -epoxy-3Z,7E-trien-18-al （5 -羟基-1 H， 2 H-西松 烷-11 ， 12 -环氧-3Z， 7E-二烯-18-醛基） 。 0034 p。
16、ekineninsE的结构解析： 白色粉末， 高分辨质谱给出m/z335.2220M+H+， 分子 式： C20H30O4。 如图5所示， 1HNMR谱显示该化合物存在4个甲基 1.11(s,H3-17), 1.17(s,H3-17), 1.67(s,H3-19), 1.28(s,H3-20)， 1个与吸电子基团相连的 次甲基质子信号 （ 4.14， dd） ;2个稀键质子信号 （ 5.63,d） 和 （ 5.08,t） 。 如图6所示， 13CNMR谱结合DEPT光谱表明该化合物具有4个甲基， 5个亚甲基， 7个次亚甲基以及4个季碳， 确定pekineninsE的母核为西松烷型二萜。 1HN。
17、MR谱存在质子信号 （ 2.85,dd） 以及13C NMR谱信号 （ 63.6， 60.7） 表明存在环氧基团。 分析比较pekineninsE与pekineninsD的1H NMR及13CNMR发现， pekineninsE的1HNMR （如图5、 6所示） 中未出现醛基质子信号， 但出现 了羧基碳信号170 .3。 综合HMBC、 NOE确定取代基的链接位置以及构型， 最终确定 pekineninsE的结构式为： 5 -hydroxy-1 H,2 H-casba-11 ,12 -epoxy-3Z,7E-trien- 18-oicacid （5 -羟基-1 H， 2 H-西松烷-11 ， 。
18、12 -环氧-3Z， 7E-二烯-18-羧基） 。 0035 实施例2体外抗肿瘤试验 0036 1、 抗人胃癌细胞MGC-803实验 0037 人胃癌细胞株MGC-803用含10%小牛血清、 100U/mL青霉素、 0.1mg/ml链霉素的 RPMI-1640培养基在37 C、 5%CO2培养箱中常规培养。 用0.25%胰酶加0.02%EDTA消化、 传代。 取对数生长期细胞， 经胰酶消化后用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液制备细胞悬浮液， 说明书 3/6 页 5 CN 102675252 B 5 细胞浓度约为1105个/ml， 接种于96孔培养板内， 每孔180L； 本发明实施例1。
19、制备得到的 新化合物pekineninssD （结构如图1、 下同） 和pekineninssE （结构如图2、 下同） 分别设1 g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40g/ml6个浓度， 每孔再分别加入20L二甲亚 砜， 每组设4个复孔， 置37 C、 5%CO2培养箱中培养72h后， 每孔加入10LWST-8溶液， 继续培 养4h后， 使用EL-x800酶标仪在 =450nm下测荧光值。 以加入不含细胞的培养基的孔作空白 值， 以阴性对照组的孔作对照值。 按照公式计算药物抑制 （%） = （对照组荧光值试验组荧光 值） / （对照组荧光值空白组荧光值）。
20、 100%。 0038 实验结果： 化合物pekineninssD的1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40 g/ml6个浓度对人胃癌细胞MGC-803的抑制率分别为2.12%， 7.31%， 13.85%， 21.76%， 46.80%， 81.92%。 计算pekineninssD抑制MGC-803肿瘤细胞株的IC50为18.3g/ml。 0039 化合物pekineninssE的1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40g/ml6个 浓度对人胃癌细胞MGC-803的抑制率分别为4.45%， 7.27%， 16.62。
21、%， 23.51%， 35.72%， 81.73%。 计算pekineninssE抑制MGC-803肿瘤细胞株的IC50为20.2g/ml。 0040 实验结果表明本发明分离得到的新化合物pekineninssD和pekineninssE对人 胃癌细胞具有很好的抑制作用。 0041 2、 抗人结肠癌细胞SW620实验 0042 人结肠癌细胞SW620用含10%小牛血清、 100U/mL青霉素、 0.1mg/ml链霉素的RPMI- 1640培养基在37 C、 5%CO2培养箱中常规培养。 用0.25%胰酶加0.02%EDTA消化、 传代。 取对数 生长期细胞， 经胰酶消化后用含10%小牛血清的R。
22、PMI-1640培养液制备细胞悬浮液， 细胞浓 度约为1105个/ml， 接种于96孔培养板内， 每孔180L； 本发明提供的新化合物 pekineninssD和pekineninssE分别设1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40g/ ml6个浓度， 每孔再分别加入20L二甲亚砜， 每组设4个复孔， 置37 C、 5%CO2培养箱中培养 72h后， 每孔加入10LWST-8溶液， 继续培养4h后， 使用EL-x800酶标仪在 =450nm下测荧光 值。 以加入不含细胞的培养基的孔作空白值， 以阴性对照组的孔作对照值。 按照公式计算药 物抑制 （%） = 。
23、（对照组荧光值试验组荧光值） / （对照组荧光值空白组荧光值） 100%。 0043 实验结果： 化合物pekineninssD的1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40 g/ml6个浓度对人结肠癌细胞的抑制率分别为1.34%， 8.24%， 11.43%， 19.86%， 40.71%， 81.84%。 计算pekineninssD抑制SW620肿瘤细胞株的IC50为19.8g/ml。 0044 化合物pekineninssE的1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40g/ml6个 浓度对人结肠癌细胞的抑制率分别为3.。
24、84%， 6.35%， 13.36%， 21.45%， 49.55%， 82.49%。 计算 pekineninssE抑制SW620肿瘤细胞株的IC50为18.2g/ml。 0045 实验结果表明本发明分离得到的新化合物pekineninssD和pekineninssE对人 结肠癌细胞具有很好的抑制作用。 0046 3、 抗人肝癌细胞SMMC-7721实验 0047 人肝癌细胞SMMC-7721用含10%小牛血清、 100U/mL青霉素、 0.1mg/ml链霉素的 RPMI-1640培养基在37 C、 5%CO2培养箱中常规培养。 用0.25%胰酶加0.02%EDTA消化、 传代。 取对数生长。
25、期细胞， 经胰酶消化后用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液制备细胞悬浮液， 细胞浓度约为1105个/ml， 接种于96孔培养板内， 每孔180L； 本发明提供的新化合物 pekineninssD和pekineninssE分别设1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40g/ 说明书 4/6 页 6 CN 102675252 B 6 ml6个浓度， 每孔再分别加入20L二甲亚砜， 每组设4个复孔， 置37 C、 5%CO2培养箱中培养 72h后， 每孔加入10LWST-8溶液， 继续培养4h后， 使用EL-x800酶标仪在 =450nm下测荧光 值。 以。
26、加入不含细胞的培养基的孔作空白值， 以阴性对照组的孔作对照值。 按照公式计算药 物抑制 （%） = （对照组荧光值试验组荧光值） / （对照组荧光值空白组荧光值） 100%。 0048 实验结果： 化合物pekineninssD的1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40 g/ml6个浓度对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制率分别为1.77%， 9.31%， 13.37%， 20.13%， 43.86%， 80.99%。 计算化合物pekineninssD抑制SW620肿瘤细胞株的IC50为19.3g/ml。 0049 化合物pekineninssE的1g/。
27、ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40g/ml6个 浓度对人肝癌细胞SMMC-7721的抑制率分别为1.86%， 6.78%， 14.57%， 19.56%， 32.59%， 80.03%。 计算pekineninssE抑制SMMC-7721肿瘤细胞株的IC50为22.1g/ml。 0050 实验结果表明本发明分离得到的新化合物pekineninssD和pekineninssE对人 肝癌细胞具有很好的抑制作用。 0051 4、 抗人肾癌细胞Ketr-3实验 0052 人肾癌细胞Ketr-3用含10%小牛血清、 100U/mL青霉素、 0.1mg/ml链霉素的R。
28、PMI- 1640培养基在37 C、 5%CO2培养箱中常规培养。 用0.25%胰酶加0.02%EDTA消化、 传代。 取对数 生长期细胞， 经胰酶消化后用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液制备细胞悬浮液， 细胞浓 度约为1105个/ml， 接种于96孔培养板内， 每孔180L； 本发明提供的新化合物 pekineninssD和pekineninssE分别设1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40g/ ml6个浓度， 每孔再分别加入20L二甲亚砜， 每组设4个复孔， 置37 C、 5%CO2培养箱中培养 72h后， 每孔加入10LWST-8溶液， 。
29、继续培养4h后， 使用EL-x800酶标仪在 =450nm下测荧光 值。 以加入不含细胞的培养基的孔作空白值， 以阴性对照组的孔作对照值。 按照公式计算药 物抑制 （%） = （对照组荧光值试验组荧光值） / （对照组荧光值空白组荧光值） 100%。 0053 实验结果： 化合物pekineninssD的1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40 g/ml6个浓度对人肾癌细胞Ketr-3的抑制率分别为2.41%， 8.26%， 17.41%， 22.02%， 39.55%， 78.83%。 计算pekineninssD抑制人肾癌细胞Ketr-3肿瘤细胞株的I。
30、C50为20.1g/ ml。 0054 化合物pekineninssE的1g/ml， 2g/ml， 5g/ml， 10g/ml， 20g/ml， 40g/ml6个 浓度对人肾癌细胞Ketr-3的抑制率分别3.71%， 8.97%， 15.32%， 27.84%， 38.69%， 80.89%。 计 算pekineninssE抑制Ketr-3肿瘤细胞株的IC50为19.0g/ml。 0055 以上实验结果表明本发明分离得到的新化合物pekineninssD和pekineninssE 对人肾癌细胞具有很好的抑制作用。 0056 实施例3pekineninssD和pekineninssE的急性毒性实。
31、验 0057 按Bliss法计算小鼠半数致死量LD50值， LD50值为1.02mg/kg， 实验结果表明本发明 提供的pekineninssD和pekineninssE化合物的急性毒性较低。 0058 实施例4片剂的制备 0059 取上述实施例1制备得到的pekineninssD和pekineninssE加药用辅料淀粉、 硬 脂酸镁等适量， 充分混匀后， 压片， 制成片剂口服使用。 0060 实施例5胶囊剂的制备 0061 取上述实施例1制备得到的pekineninssD和pekineninssE加药用辅料淀粉适 说明书 5/6 页 7 CN 102675252 B 7 量， 充分混匀后， 装入胶囊， 制成胶囊剂口服使用。 0062 以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点， 其目的在于让熟悉此项技术的 人了解本发明内容并加以实施， 并不能以此限制本发明的保护范围， 凡根据本发明精神实 质所做的等效变化或修饰， 都应涵盖在本发明的保护范围内。 说明书 6/6 页 8 CN 102675252 B 8 图1图2 图3 说明书附图 1/3 页 9 CN 102675252 B 9 图4 图5 说明书附图 2/3 页 10 CN 102675252 B 10 图6 说明书附图 3/3 页 11 CN 102675252 B 11 。