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1、(10)申请公布号 CN 102643350 A (43)申请公布日 2012.08.22 CN 102643350 A *CN102643350A* (21)申请号 201210112740.5 (22)申请日 2012.04.17 C07K 19/00(2006.01) C12Q 1/37(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军第三军医大学 地址 400038 重庆市沙坪坝区高滩岩正街 30 号 (72)发明人 连继勤 何凤田 倪振洪 (74)专利代理机构 重庆志合专利事务所 50210 代理人 胡荣珲 (54) 发明名称 一种检测活细胞内 ATG4B 活性的多肽及其应 用 (5。
2、7) 摘要 本发明涉及一种能够特异性检测活细胞中 ATG4B 酶活性的新型多肽的制备及应用， 特别涉 及一种新型小肽的设计、 合成以及该小肽在检测 与 ATG4B 活性相关的细胞自噬水平方面的应用。 本发明所述多肽用于检测活细胞内 ATG4B 活性， 具有操作简单， 快速， 检测结果客观、 准确的优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 一种多肽， 其特征在于 ： 该多肽为融合肽， 其氨基酸序。
3、列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 2. 一种试剂盒， 其特征在于 ： 包含带有标记物的权利要求 1 所述的多肽。 3. 根据权利要求 2 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述标记物为检测用小分子化合物。 4. 根据权利要求 2 所述的试剂盒， 其特征在于 ： 所述检测用小分子化合物为荧光素或 硝基苯胺盐。 5. 根据权利要求 2 所述的试剂盒， 其特征在于， 该试剂盒的的基本组成为 ： 用无菌水配 成终浓度为 1mM 的带标记物的多肽 ： PH 值为 7.5 的反应缓冲液 ： 100mM Hepes、 20甘油、 0.5mM EDTA、 5mM DTT。 6. 根据权利要求 2 所述的。
4、试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒用于检测活细胞内 ATG4B 的活性。 权 利 要 求 书 CN 102643350 A 2 1/5 页 3 一种检测活细胞内 ATG4B 活性的多肽及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种能够特异性检测活细胞中 ATG4B 酶活性的新型多肽的制备及应 用， 特别涉及一种新型小肽的设计、 合成以及该小肽在检测与 ATG4B 活性相关的细胞自噬 水平方面的应用。 背景技术 0002 自噬相关蛋白 4B(Autophagy-raleted protein 4B， ATG4B) 是细胞自噬过程中的 一种关键酶， 首先由等于2003年发现并报道， 随后Taich。
5、i等解析了其结构， 并逐渐 阐明了其在细胞自噬发生过程中的作用与机制。 0003 1.ATG4B 的基本组成及结构 0004 ATG4B 全长由 394 个氨基酸残基构成， 其结构中包含 8 个 螺旋结构和 13 个 折叠结构 ( 图 1)， 共组成柔性与蛋白酶 2 个结构域。其中 D278， H280 和 C74 位氨基酸残基 是其发挥功能中的关键位点 ( 图 2)。 0005 2.ATG4B 在细胞自噬过程中的作用及机制 0006 细胞自噬 (Autophagy) 是细胞的一种基本存活机制， 其主要功能是及时清除细胞 内损伤的细胞器、 蛋白质等组份， 保持细胞内部的清洁与稳定， 并能将分解。
6、产生的氨基酸等 产物作为细胞生长的原料， 因此被称为细胞内的 “垃圾处理厂” 。细胞自噬的过程可分为 3 个阶段 ： 首先生成一段双层磷脂膜 ； 其次双层膜不断延伸， 将需要降解的细胞成分包裹形 成自噬小体 ； 然后自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体， 并借助溶酶体中的蛋白酶将自 噬小体中的细胞成分降解 ( 图 3)。 0007 其中， 在自噬小体的生成过程中， ATG4B 扮演着重要角色。如图 4 所示， 在自噬 小体形成过程中， ATG4B 首先将其底物蛋白 LC3 切去一段， 使其由 LC3-I(18Kda) 变为 LC3-II(16Kda)， 然后由 Atg3/Atg7 及 Atg5/。
7、Atg12 在 LC3-II 的 C 端连接上一段脂链， 并将 LC3-II 锚定在自噬小体的膜上。LC3 蛋白在这一过程中的变化是细胞自噬过程的标志性事 件， 因此被用于鉴定细胞内自噬水平的高低， 即 LC3-II 的量越高代表自噬水平越高， 也意 味着 ATG4B 活性越高。 0008 3.ATG4B 对 LC3 的酶解作用 0009 LC3又称为自噬相关蛋白8(Autophagy related protein 8， ATG8)， 是细胞自噬发 生过程中的关键蛋白， 是 ATG4B 的特异性酶解底物。研究表明， ATG4B 在 LC3 中的酶解位点 位于其116位的甘氨酸残基， 其中的T。
8、FG三肽是ATG4B酶解识别的基本底物序列(图5)， 因 此 TFG 三肽可单独作为 ATG4B 的底物使用。 0010 4.ATG4B 活性检测方法 0011 由于 ATG4B 在细胞自噬发生过程中的重要作用， 目前通常将细胞内 ATG4B 的活性 水平作为细胞自噬水平的指标， 常用的检测方法包括以下几种 ： 0012 (1) 蛋白质免疫印迹法 (Western blot) 0013 通过分离细胞并制备蛋白质样品， 电泳分离后使用 LC3 的抗体检测细胞内 LC3-I 说 明 书 CN 102643350 A 3 2/5 页 4 与 LC3-II 之间的变化来判断细胞自噬的发生与 ATG4B。
9、 活性。是目前细胞自噬检测中最常 用方法， 优点是直观、 清晰， 缺点是无法精确定量， 操作繁杂。 0014 (2) 基于 TFG 三肽的活性检测 0015 由于TFG三肽可作为ATG4B的底物直接作用， 因此将TFG三肽的C末端用荧光素标 记 ( 如 AFC) 后可用于检测 ATG4B 活性。但由于 TFG 三肽不能自由穿过细胞膜而进入细胞， 因此需将细胞裂解后， 把细胞裂解物与检测底物孵育， 然后再检测相关荧光值的变化， 从而 反映 ATG4B 活性水平。此方法优点是可以直接定量细胞内 ATG4B 活性， 方法相对简单 ； 缺点 是无法直接测定活细胞内的 ATG4B 活性。 0016 (3。
10、) 基于 LC3 蛋白的 FRET 检测 0017 Min 等报道， 将 LC3 蛋白的 N 端与 C 端分别偶联绿色荧光蛋白与黄色荧光蛋白， 表 达的重组蛋白可作为检测底物而测定 ATG4B 活性。由于检测底物上标记有两种荧光蛋白， 其发射波长会发生能量转移 (FRET)， 而 ATG4B 切除底物后将 C 端释放而引起荧光变化可作 为检测指标。 此方法优点是可直接定量细胞内ATG4B活性， 并可高通量检测 ； 缺点是需要制 备稳定表达 GFP-LC3-YFP 重组蛋白的细胞系， 质量无法控制， 操作繁杂。 发明内容 0018 本发明的第一个目的在于提供一种检测活细胞内 ATG4B 活性的多。
11、肽， 所述多肽用 于检测活细胞内 ATG4B 活性， 具有操作简单， 快速， 检测结果客观、 准确的优点。 0019 本发明所述多肽为融合肽， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 0020 本发明以 ATG4B 作用的底物序列 TFG 为基础， 在 ATG4B 作用的底物序列 TFG 的 N 端偶联穿膜肽 RKKRRQRRR 与氨基酸残基 G， 得到上述的融合肽。 0021 本发明的第二个目的是提供一种包括带有标记物的上述多肽的试剂盒， 所述试剂 盒用于检测活细胞内 ATG4B 的活性。 0022 所述标记物为检测用小分子化合物。 0023 所述标记物为检测用小分子化合物。 0。
12、024 所述检测用小分子化合物为荧光素或硝基苯胺盐。 0025 试剂盒的基本组成包括 ： 带标记物的多肽 ： 用无菌水配成终浓度为 1mM ； PH 值为 7.5 反应缓冲液 (100mM Hepes、 20甘油、 0.5mM EDTA、 5mM DTT)。 0026 本发明所述多肽用于试剂盒时， 在多肽的N端和C端附加标记物， 用于标记背景参 照信号和检测信号， 本发明所述的标记物可以是检测用小分子化合物， 如荧光素或 pNA( 对 硝基苯胺盐 ) 等。用标记物标记多肽 N 端和 C 端色彩可以不同， 其 N 端荧光作为背景参照 信号使用， C 端荧光作为检测信号使用。 0027 也可以在多。
13、肽 C 端单独连接用于标记检测信号的标记物， 使用细胞数量或总蛋白 量作为背景参照信号。 0028 本发明提供的多肽用于检测活细胞内 ATG4B 活性， 检测方法适用于细胞流式分 析、 荧光分光光度计检测分析等。 0029 本发明的优点是 ： 无需裂解细胞， 可以直接检测活细胞内 ATG4B 活性 ； 客观性 强， 全部检测使用仪器完成， 结果为数值， 最大程度避免了人为主观因素 ； 操作相对简单、 快速， 可以在 2 小时内完成测定。 说 明 书 CN 102643350 A 4 3/5 页 5 0030 本发明所达到的技术效果 ： 可直接检测活细胞内 ATG4B 活性， 并且能简单、 快速。
14、、 客观地反映活细胞内 ATG4B 活性。 附图说明 0031 图 1 为 ATG4B 蛋白中二级结构组成示意图 ； 0032 图 2 为 ATG4B 蛋白的空间结构示意图 ； 0033 图 3 为 ATG4B 蛋白参与的细胞自噬过程示意图 ； 0034 图 4 为 ATG4B 在自噬小体形成过程中的作用 ； 0035 图 5 为 ATG4B 对底物 LC3 的酶解示意图 ； 0036 图 6 为 Western blot 分析细胞自噬水平变化 ； 0037 图 7 为细胞裂解物中 ATG4B 活性测定 ； 0038 图 8 为本发明所述多肽的穿膜功能 ； 0039 图 9 为荧光分光光度法测。
15、定 ATG4B 活性 ； 0040 图 10 为流式细胞法测定 ATG4B 活性。 具体实施方式 0041 相关材料、 试剂、 仪器说明 0042 细胞 ： 人宫颈癌 Hela 细胞， 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。 0043 细胞 DMEM 培养基 ： 购自美国 Hyclone 公司， 货号 ： SH30022.01B 0044 细胞饥饿培养基 HBSS ： 购自美国 Hyclone 公司， 货号 ： SH30030.02B 0045 胰酶 ： 购自美国 Hyclone 公司， 货号 ： SH30042.01 0046 PBS 缓冲液 ： 购自北京中杉金桥生物技术有限公司， 。
16、货号 ： ZLI-9061 0047 细胞裂解液 RIPA ： 购自北京碧云天生物科技有限公司， 货号 ： P0013B 0048 LC3 抗体 ： 购自美国 Cell signaling technology 公司， 货号 ： 2775S， 使用浓度 1 1000 0049 -actin 抗体 ： 购自美国 Thermo Scientific 公司， 使用浓度 1 3000 0050 蛋白质含量测定试剂盒 ： BCA 蛋白浓度测定试剂盒 ( 增强型 )， 购自北京碧云天生 物科技有限公司， 货号 ： P0010 0051 荧光酶标仪 ： Spectra Max Gemini XPS plat。
17、e reader， 美国 0052 倒置荧光显微镜 ： OLYMPUS IX-81， 日本 0053 流式细胞分析仪 ： Beckman XL， 美国 0054 实施例 1 0055 一、 多肽的设计 0056 以 ATG4B 作用的底物序列 TFG 为基础， 在其 N 端借肽键直接偶联一段穿膜肽 RKKRRQRRR 与氨基酸残基 G， 形成一段新型的多肽 ( 融合肽 )( 由上海吉尔生化有限公司合 成 )。所述多肽氨基酸序列为 RKKRRQRRRGTFG， 分子量为 1701.02。 0057 实施例 2 0058 二、 多肽底物的设计与合成 0059 将多肽的 N 端和 C 端标记物标记，。
18、 得到多肽底物。所述标记物为检测用小分子化 说 明 书 CN 102643350 A 5 4/5 页 6 合物， 如荧光素或硝基苯胺盐 (pNA) 等， 本实施例的标记物采用荧光素。标记多肽 N 端和 C 端的荧光素色彩不同， N 端荧光作为背景参照信号使用， C 端荧光作为检测信号使用。还可 以在融合肽 C 端单独用荧光素标记作为检测信号， 使用细胞数量或总蛋白量作为背景参照 信号。本实施例多肽的 N 端用 FITC 绿色荧光标记， C 端用 AMC 蓝色荧光标记。当然， 多肽 的 N 端和 C 端还可以用其它标记方法， 如 N 端用 FITC 标记后， C 端可配合使用红色荧光罗 丹明标记。
19、 ； N 端用红色荧光罗丹明标记后 C 端可配合使用 FITC 或 pNA 或 AFC 标记等 ； 也可 以单独在 C 端使用罗丹明或 FITC 或 pNA 或 AFC 等标记。 0060 本实施例设计的多肽底物结构如下 ： 0061 FITC-RKKRRQRRRGTFG-AMC( 底物 1) 0062 多肽底物的分子量为2361.77， 由上海吉尔生化有限公司合成。 底物1为固体黄色 粉末， 经 HPLC 检测纯度为 97.30。合成量 10.8mg， 溶于 4.573ml 无菌水中， 终浓度为 1mM， 存放于 -20冰箱。 0063 为验证底物 1 的功能及优势， 同时还委托上海吉尔生化。
20、有限公司合成了底物 2 作 为实验对照， 底物 2 的结构如下 ： 0064 FITC-GTFG-AMC( 底物 2) 0065 底物 2 分子量为 1040.15， 为黄色固体粉末， 纯度 95.67， 合成量 10.0mg， 溶于 9.6ml 无菌水中， 终浓度为 1mM， 存放于 -20冰箱。 0066 底物 2 中的多肽氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 0067 实施例 3 0068 三、 多肽可检测细胞裂解物中 ATG4B 活性 0069 1. 细胞自噬诱导模型 0070 为了检测本发明所述多肽是否具有检测 ATG4B 活性的能力， 首先构建了细胞自 噬诱导模型。将人。
21、宫颈癌细胞 Hela 以 1105/ml 的比例接种至 6 孔细胞培养板中， 每孔 2ml。过夜培养后将培养基去掉， 对照组仍用正常培养基培养， 实验组细胞经 PBS 洗涤后换 用 HBSS( 含钙、 镁离子与 10mM 的 Hepas 缓冲液 ) 培养基分别培养 2， 3， 4 小时， 作为细胞饥 饿模型。诱导结束后， 收集各组细胞， 裂解后用蛋白质免疫印迹法测定 LC3 变化情况。结果 如图 6 所示， 随诱导时间增加， LC3-II 蛋白的表达量升高， 表明 ATG4B 活性增强， 细胞自噬 水平增加， 以饥饿 3 小时为最佳诱导条件。 0071 2. 细胞裂解物中 ATG4B 活性测定。
22、 0072 将对照组及实验组细胞去培养基， 用 PBS 洗 2 次， 加入细胞裂解液于冰上裂解 10min。将细胞裂解液吸出， 各取 50l 与底物 1 或 2(2l， 1mM) 混匀后在 37培养箱中作 用 40min， 然后在荧光分光光度计上以 320nm 激发波长、 400nm 发射波长进行荧光测定。同 时使用考马斯亮蓝法测定细胞裂解液中蛋白质含量， 对测定的荧光值进行标准化。 0073 测定结果如图 7 所示， 底物 1 与 2 均可以很好的测定细胞裂解物中 ATG4B 活性， 两 者间不存在显著差异， 且测定的趋势与蛋白质免疫印迹分析结果相吻合， 说明底物 1 可以 作为 ATG4B。
23、 的底物进行活性测定。 0074 实施例 4 0075 四、 多肽具有穿膜功能 0076 为测定本发明所述多肽是否能穿过细胞膜进入细胞内， 将人宫颈癌细胞 Hela 以 说 明 书 CN 102643350 A 6 5/5 页 7 1105/ml 的比例接种至 6 孔细胞培养板中， 每孔 2ml。过夜培养后将底物 1 与底物 2 按 1M的浓度分别加入培养基中进行培养， 分别于20min， 40min， 1h后将培养基去除并用PBS 洗涤 3 次后在荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光情况， 结果如图 8 所示。 0077 从图 8 可看出， 对照组底物 2 完全不具有穿膜功能， 而实验组的底物 1。
24、 具有明显的 穿膜功能， 且随孵育时间增加其穿膜效应增强。 0078 实施例 5 0079 五、 多肽可检测活细胞内 ATG4B 活性 0080 1. 荧光分光光度法测定活细胞内 ATG4B 活性 0081 按照细胞自噬诱导模型， 对照组为正常培养细胞， 实验组为Hela细胞饥饿3小时。 随后在对照及实验组的细胞培养基中添加底物 1， 浓度为 1M， 在 37培养箱中继续作 用1小时， 去培养基， 用PBS洗3次后用胰酶将细胞消化下来， 用PBS重悬细胞后取100l 直接在荧光荧光分光光度计上以 320nm 激发波长、 400nm 发射波长测定蓝色荧光值， 同时以 488nm 为激发波长， 5。
25、25nm 为发射波长测定绿色荧光值。蓝色荧光值的测定结果将空白值去 除后以绿色荧光值进行标准化， 然后与对照组进行比较分析， 结果见图 9。 0082 从图 9 可看出， 经饥饿诱导后， 活细胞内 ATG4B 活性明显升高， 与实例 2 中的结果 相一致， 说明新型多肽完全可用于活细胞内 ATG4B 活性的检测。 0083 2. 流式细胞仪测定活细胞内 ATG4B 活性 0084 细胞处理同1。 将细胞重悬于PBS中后直接用于流式细胞分析， 蓝色荧光的激发波 长为 320nm， 发射波长为 400nm， 分别计数实验组及对照组细胞中的蓝色荧光阳性细胞数， 结果见图 10。 0085 从图 10。
26、 中可看出， 饥饿诱导后蓝色荧光阳性细胞群明显右移， 比例显著升高， 表 明细胞内 ATG4B 活性显著升高， 与荧光分光光度计测定的结果相符。 0086 结论 ： 0087 与正常的 ATG4B 底物序列 ( 底物 2) 相比， 本发明所述的融合肽底物 ( 底物 1) 不 但能够检测细胞裂解液中中ATG4B活性， 而且还可以进入活细胞内部直接测定ATG4B活性， 检测方法适用于荧光分光光度计法与流式细胞仪法。 说 明 书 CN 102643350 A 7 1/1 页 8 0001 序 列 表 CN 102643350 A 8 1/4 页 9 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102643350 A 9 2/4 页 10 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102643350 A 10 3/4 页 11 图 8 说 明 书 附 图 CN 102643350 A 11 4/4 页 12 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 102643350 A 12 。