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1、(10)授权公告号 CN 103145825 B (45)授权公告日 2014.09.10 CN 103145825 B (21)申请号 201310082500.X (22)申请日 2013.03.14 C07K 14/47(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (73)专利权人 南京化工职业技术学院 地址 210048 江苏省南京市大厂葛关路 625 号 专利权人 马鞍山汇智生物技术有限公司 (72)发明人 李冰峰 刘练 管增东 余利灯 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 徐冬涛 李晓峰 CN 102127166 A,2011.07.。
2、20, CN 101402954 A,2009.04.08, 林志超 . 四种胰脏铁蛋白的理化特性 .中 国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学 辑 .2009, (54) 发明名称 一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种脾脏铁蛋白提取纯化的方 法， 将动物脾脏绞碎， 溶剂提取， 热变除杂， 氯化镁 或氯化钙盐除杂， 提取液浓缩， 粗品沉淀， 粗品结 晶。本发明所用方法既节省了生产成本又缩短了 生产周期， 成本低， 提取料液量小， 加硫酸铵少， 适 合于生产的规模扩大化。并且铁蛋白的提取率有 显著提高， 而且所用辅料部分还可收。 (51)Int.Cl. (56)对比文件。
3、 审查员 王翔宇 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103145825 B CN 103145825 B 1/1 页 2 1. 一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于将动物脾脏绞碎， 溶剂提取， 热变除 杂， 氯化镁或氯化钙盐除杂， 提取液浓缩， 粗品沉淀， 粗品结晶 ； 该方法具体包括以下按步骤 ： 1） 将动物脾脏粉碎成匀浆 ； 2） 将所述的匀浆与水混合， 并再粉碎以便于铁蛋白的溶出 ； 3） 将步骤 2） 中再粉碎后的匀浆加热至 60 85， 立即。
4、降温至 25以下 ； 4） 将步骤 3） 所得匀浆加入 CaCl2或 MgCl2除杂得提取液 ； 5） 将步骤 4） 所得提取液离心后取上清液超滤浓缩后得浓缩液 ； 6） 将步骤 5） 所得浓缩液中加丙酮进行分级沉淀铁蛋白得粗品铁蛋白， 或者加硫酸铵沉 淀铁蛋白得粗品铁蛋白 ； 7） 将步骤 6） 所得的粗品铁蛋白用水或 / 和硫酸铵溶液溶解得粗品铁蛋白溶解液并用 硫酸镉结晶， 得精品铁蛋白。 2.根据权利要求1所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于步骤1） 中将动物脾 脏绞碎后用胶体磨粉碎至粒度 250m 的匀浆。 3.根据权利要求1所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于步骤2）。
5、 中将所述的 匀浆与水混合并用胶体磨再粉碎 12 遍。 4.根据权利要求1所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于步骤4） 中氯化镁或 氯化钙的添加量为匀浆的 1%5%。 5.根据权利要求1所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于步骤5） 中所述的上 清液经超滤浓缩至原体积的 1/21/6。 6.根据权利要求1所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于步骤6） 浓缩液中加 丙酮进行分级沉淀， 分级沉淀的过程为 ：（1） 初沉 ： 向浓缩液中加入丙酮得初沉溶液， 静置， 离心留上清液 ；（2） 复沉 ： 向上清液中加丙酮得复沉溶液， 离心得粗品铁蛋白。 7. 根据权利要求 6 所述的脾。
6、脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于初沉时所述初 沉溶液中丙酮的体积百分浓度为 5%18%， 复沉时所述复沉溶液中丙酮的体积百分浓度为 52%69%。 8.根据权利要求1所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于步骤6） 浓缩液中加 硫酸铵沉淀铁蛋白时， 硫酸铵的添加量为浓缩液的 30%40%。 9. 根据权利要求 8 所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于所述硫酸铵的添加 量为浓缩液的 35%。 10. 根据权利要求 1 所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于步骤 7） 中用来溶 解粗品铁蛋白的硫酸铵溶液的质量百分浓度为 0.51.5%， 硫酸镉的添加量为粗品铁蛋白溶 解液的 。
7、2%10%。 11. 根据权利要求 10 所述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其特征在于所述硫酸铵溶液 的质量百分浓度为 1%， 所述硫酸镉的添加量为粗品铁蛋白溶解液的 5%。 权 利 要 求 书 CN 103145825 B 2 1/3 页 3 一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法 技术领域 ： 0001 本发明属生物提取领域， 具体涉及一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法。 背景技术 ： 0002 铁蛋白是一种含铁的蛋白质， 具有电子致密特点， 可对细胞抗原进行精确的定位 且在电镜下可见。利用抗原与抗体特异性结合产生微量沉淀的原理， 对组织细胞内的抗原 和抗体进行超微结构鉴定和定位。因此铁蛋白在医学、 生物。
8、学研究方面有着广泛的前途。 0003 铁蛋白一般来自动物， 以肝、 脾含量较高， 其中马脾脏含量最高， 因而商品铁蛋白 主要从马脾脏中获得的。 0004 传统的提取的方法主要是取新鲜马脾用组织匀浆机粉碎， 加水提取， 热变除杂， 去 油脂， 硫酸铵沉淀， 粗品透析除盐， 硫酸镉结晶。整个工艺提取周期长， 成本高。特别是组织 匀浆机处理效率比较低， 加热后保温使很多铁蛋白变性失活， 提取料液量大， 加硫酸铵多且 添加过程易使铁蛋白失活， 透析处理耗时更不适合于生产的规模扩大化。 发明内容 ： 0005 本发明提供一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 该方法解决传统工艺周期长、 成本 高的问题。 000。
9、6 本发明的目的通过以下技术方案实现 ： 0007 一种脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于将动物脾脏绞碎， 溶剂提取， 热变除杂， 氯化镁或氯化钙盐除杂， 提取液浓缩， 粗品沉淀， 粗品结晶。 0008 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于该方法具体包括以下按步骤 ： 0009 1） 将动物脾脏粉碎成匀浆 ； 0010 2） 将所述的匀浆与水混合， 并再粉碎以便于铁蛋白的溶出 ； 0011 3） 将步骤 2） 中再粉碎后的匀浆加热至 60 85， 立即降温至 25以下 ； 0012 4） 将步骤 3） 所得匀浆加入 CaCl2或 MgCl2除杂得提取液 ； 0013 5） 将步骤 4） 所。
10、得提取液离心后取上清液超滤浓缩后得浓缩液 ； 0014 6） 将步骤 5） 所得浓缩液中加丙酮进行分级沉淀铁蛋白得粗品铁蛋白， 或者加硫酸 铵沉淀铁蛋白得粗品铁蛋白 ； 0015 7） 将步骤 6） 所得的粗品铁蛋白用水或 / 和硫酸铵溶液溶解得粗品铁蛋白溶解液 并用硫酸镉结晶， 得精品铁蛋白。 可以用水溶解粗品铁蛋白并用硫酸镉结晶， 重复进行几次 得到精品铁蛋白 ； 也可以用硫酸铵溶液溶解粗品铁蛋白并用硫酸镉结晶， 重复进行几次得 到精品铁蛋白 ； 或者用水和硫酸铵溶液结合使用溶解粗品铁蛋白并用硫酸镉结晶， 得精品 铁蛋白。 0016 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于步骤 1） 中将。
11、动物脾脏绞碎后用胶体磨 粉碎至粒度 250m 的匀浆。 0017 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于步骤 2） 中将所述的匀浆与水混合并用 说 明 书 CN 103145825 B 3 2/3 页 4 胶体磨再粉碎 12 遍。 0018 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于步骤 4） 中氯化镁或氯化钙的添加量为 匀浆的 1%5%（w/v， 即每 100ml 匀浆中加入 15g 氯化镁或氯化钙） 。 0019 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于步骤 5） 中所述的上清液经超滤浓缩至 原体积的 1/21/6。 0020 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于步骤 6） 浓缩液中加。
12、丙酮进行分级沉 淀， 分级沉淀的过程为 ：（1） 初沉 ： 向浓缩液中加入丙酮得初沉溶液， 静置， 离心留上清液 ； （2） 复沉 ： 向上清液中加丙酮得复沉溶液， 离心得粗品铁蛋白。 0021 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于初沉时所述初沉溶液中丙酮的体积百 分浓度为 5%18%， 复沉时所述复沉溶液中丙酮的体积百分浓度为 52%69%。 0022 上述的脾脏铁蛋白提取纯化的方法， 其在于步骤 6） 浓缩液中加硫酸铵沉淀铁蛋白 时， 硫酸铵的添加量为浓缩液的 30%40%（w/v， 即每 100ml 浓缩液中加入 3040g 硫酸铵） ， 优选为 35%。 0023 上述的脾脏铁蛋白。
13、提取纯化的方法， 其在于步骤 7） 中用来溶解粗品铁蛋白的硫 酸铵溶液的质量百分浓度为 0.51.5%， 优选为 1%， 硫酸镉的添加量为粗品铁蛋白溶解液的 2%10% （w/v， 每 100ml 粗品铁蛋白溶解液中加入 210g 硫酸镉） ， 优选为 5% 。 0024 本发明的有益效果 ： 0025 本发明所用方法既节省了生产成本又缩短了生产周期， 成本低， 提取料液量小， 加 硫酸铵少， 适合于生产的规模扩大化。 并且铁蛋白的提取率有显著提高 （与现有方法相比铁 蛋白的提取率可提高约 20% 左右） ， 而且所用辅料部分还可收。 附图说明 ： 0026 图 1 为本发明实施例方法所得精品。
14、铁蛋白经电泳检测的铁蛋白活性铁染色。 0027 图 2 为铁蛋白活性考马斯亮蓝染色。 0028 图 3 为铁蛋白 SDS-page 变性电泳。 具体实施方式 : 0029 以下通过实施实例对本发明作进一步说明， 但其并不限制本发明的保护范围。 0030 实施例 1 ： 0031 取马脾脏 2.7 kg， 绞碎后用胶体磨粉碎至粒度为 250m 的匀浆， 加水 4.0 L 后继 续胶体磨匀浆2遍以便于铁蛋白溶出， 加热至75， 立即降温至20以下， 得匀浆约6.2 L， 加入氯化镁 186 g 除杂得提取液， 将提取液离心得上清液 4.0 L， 将上清液 100KD 超滤浓缩 至 1400 ml 。
15、得浓缩液， 向浓缩液中加入硫酸铵固体 490 g（硫酸铵的添加量为浓缩液的 35%， 即每 100ml 浓缩液中加入 35g 硫酸铵） ， 静置， 离心得粗品铁蛋白 121.5 g， 将粗品铁蛋白用 1600ml 水溶解得粗品铁蛋白溶解液， 加硫酸镉 （硫酸镉添加量为粗品铁蛋白溶解液的 5%， 即每 100ml 粗品铁蛋白溶解液中加入 5g 硫酸镉） ， 静置结晶， 结晶完全后离心取晶体以质量 百分浓度为 1% 的硫酸铵水溶液溶解， 加硫酸镉结晶 2 次， 得精品铁蛋白 5.6 g（湿重， 约含 水 50%） ， 以质量百分浓度为 1% 硫酸铵溶液反复溶解后加硫酸铵固体沉淀除镉后加半饱和 硫酸。
16、铵溶液保存。 说 明 书 CN 103145825 B 4 3/3 页 5 0032 实施例 2 ： 0033 取马脾脏 2.7 kg， 绞碎后用胶体磨粉碎至粒度为 250m 的匀浆， 加水 4.0 L 后继 续胶体磨匀浆2遍以便于铁蛋白溶出， 加热至80， 立即降温至20以下， 得匀浆约6.4 L， 加入氯化钙 128g 除杂得提取液， 将提取液离心得上清液 4.2 L， 将上清液 100 KD 超滤浓缩 至 1100 ml 得浓缩液 ； 向浓缩液中加丙酮进行分级沉淀， 分级沉淀的过程为 ：（1） 初沉 ： 向浓 缩液中加入丙酮 150 ml 得初沉溶液， 静置， 离心留上清液 1250ml。
17、 ；（2） 复沉 ： 向上清液中加 丙酮 1500 ml 得复沉溶液， 离心得粗品铁蛋白。将粗品铁蛋白以 1700 ml 质量百分浓度为 1% 的硫酸铵水溶液溶解得粗品铁蛋白溶解液， 加硫酸镉 （硫酸镉添加量为粗品铁蛋白溶解 液的 5%， 即每 100ml 粗品铁蛋白溶解液中加入 5g 硫酸镉） ， 静置结晶， 结晶完全后离心取晶 体以质量百分浓度为 1% 的硫酸铵水溶液溶解， 加硫酸镉结晶 2 次， 得精品铁蛋白 5.5 g（湿 重， 约含水 50%） ， 以质量百分浓度为 1% 硫酸铵溶液反复溶解后加硫酸铵固体沉淀除镉后加 半饱和硫酸铵溶液保存。 0034 对比实施例 ： 0035 取马脾。
18、脏2.7 kg， 绞碎后用胶体磨粉碎至粒度为250m的匀浆， 加水4.0 L， 加热 至 65， 降温至 20以下， 得匀浆约 4.4 L， 离心得上清液 3.1 L， 向上清液中加硫酸铵 1085 g， 静置， 离心得粗品铁蛋白 83.2 g， 用 1200 ml 水溶解得粗品铁蛋白溶解液， 加硫酸镉 （硫酸 镉添加量为粗品铁蛋白溶解液的5%， 即每100ml粗品铁蛋白溶解液中加入5g硫酸镉） ， 静置 结晶， 结晶完全后离心取晶体以质量百分浓度为 1% 的硫酸铵水溶液溶解， 加硫酸镉结晶 2 次， 得精品铁蛋白 4.4 g（湿重， 约含水 50%） ， 以质量百分浓度为 1% 硫酸铵溶液反。
19、复溶解后 加硫酸铵固体沉淀除镉后加半饱和硫酸铵溶液保存。 0036 上述实施例和对比实施例所得精品铁蛋白经电泳检测如图 1 铁蛋白活性铁染色、 图 2 铁蛋白活性考马斯亮蓝染色及图 3 铁蛋白 SDS-page 变性电泳所示。 0037 实施例 1 与对比实施例对比可知， 超滤后硫酸铵用量仅是传统工艺的一半以下， 且料液量少， 处理方便 ； 实施例 2 与对比实施例对比可知， 超滤后加丙酮比加固体硫酸铵耗 时少且不易使蛋白质失活， 另外丙酮可以回收， 成本相应降低。 故本发明从收率和能耗上均 优于传统工艺， 适用于工业生产。 0038 表 1 为实施例 1、 实施例 2 和对比实施例的工艺参数及产品量 0039 说 明 书 CN 103145825 B 5 1/1 页 6 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103145825 B 6 。