技术领域
本发明属于食品添加剂与功能食品配料领域，具体地说是一种酶法水解制 备小白杏杏仁蛋白抗氧化肽的方法。
背景技术
基于人工合成抗氧化剂的毒、副作用，目前利用农产品加工副产物进行天然 抗氧化剂制备引起了广大学者的普遍关注，已成为国内外食品、医药及化妆品等 领域研究的热点。将小白杏杏仁油或脱脂后杏仁蛋白粕作为营养滋补及药物配伍 资源，已得到了疆内外广大消费者尤其是少数民族居民的认可，以安全性普遍认 知的小白杏杏仁蛋白为肽源进行抗氧化肽开发，可为小白杏蛋白副产物的应用及 精深加工提供基础依据，辅助于抗氧化食品添加剂及保健食品因子市场开拓与品 质升级。作为纯天然食品配料的植物蛋白，其水解液富含多种氨基酸和肽，可为 食品带来不同的功能特征。由于碱溶酸沉技术制备功能肽的高成本及低安全性等 问题的普遍存在，控制酶解技术已逐步成为低成本、高安全性植物蛋白水解液制 备的有效方法。
目前国内外天然抗氧化肽的酶解制备多以水解度为指标进行水解条件初筛， 再次结合水解样品自由基清除率评价及水解肽段富集法(超滤等分离技术)，定向 获得某些肽段产物。然而酶解体系中不同肽段可能存在协同抗氧化作用，酶解产 物肽段定向筛选过程在很大程度上忽视不同肽段因子协同效力的同时，造成了优 质蛋白副产物资源的叠加浪费，且肽段超滤等分离技术存在工艺繁琐、设备投资 大、成本高、操作复杂及水资源浪费等问题；再者，自由基清除率只能说明待试 样品是否具有抗氧化性能，而不能反映其抗氧化效果，因此现存的以清除率为指 标所实施的抗氧化肽的制备方法有待科学改进。
发明内容
为了克服或改进现有抗氧化肽生产过程中参数优化方法及超滤分离技术应 用的不足或缺陷，本发明的目的是提供一种酶法水解制备小白杏杏仁抗氧化肽的 方法，在为相关产品开发提供借鉴的同时实现优质蛋白副产物资源的有效利用。 该方法以酶解体系对自由基清除效果(自由基的半抑制浓度，IC50)为指标，通过 控制复合酶解反应条件，制得具有明显抗氧化性能的小白杏杏仁蛋白抗氧化肽。 本发明工艺操作简单、设备及人力投资小、重复性好、减少了水资源的浪费与污 染。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种酶法水解制备小白杏杏仁抗氧化肽的方法，该方法通过控制酶解反应条 件，提高反应产物清除自由基的效果，具体步骤如下：
1）将蛋白含量70%-80%的小白杏杏仁脱脂粕粉碎过50目筛，每100g脱脂 杏仁粉与450-600mL水混合后静置浸泡20min，胶体磨碾磨1min；
2）搅拌调整混合溶液的pH值为7.5-8.5，加入碱性蛋白酶与胰蛋白酶复合 质量比为3:1的复合酶3500-4500U/g(底物)；
3）将所形成的待酶解体系溶液置于反应釜中，在35-45℃下密闭反应2.5-3h， 反应结束后立即将酶解体系温度升高至95℃灭酶10min终止反应，得到含抗氧 肽的富集反应液。
本发明中，所述抗氧化肽主要针对羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除性 能。
根据本发明的方法制备的抗氧化肽，可应用于食品天然保鲜剂的基料以功能 性抗氧化食品的配料。得到的抗氧化肽具有较强的自由基清除作用。
以酶解体系对自由基清除效果(IC50)为指标，采用碱性蛋白酶、胰蛋白酶复 合水解小白杏杏仁蛋白，无需采用超滤等分离技术，可制备可控酶解条件下协同 作用状态的抗氧化复合肽。
将蛋白含量70%-80%的小白杏杏仁脱脂粕粉碎过50目筛，每100g脱脂杏 仁粉与450-600mL水混合后静置浸泡20min，胶体磨碾磨1min；搅拌调整混合 溶液的pH值为7.5-8.5，加入碱性蛋白酶与胰蛋白酶复合质量比为3:1的复合酶 3500-4500U/g(底物)；将所形成的待酶解体系溶液置于反应釜中，在35-45℃下密 闭反应2.5-3h，反应结束后立即将酶解体系温度升高至95℃灭酶10min终止反 应，得到具有抗氧化性能的酶解肽液，反应液浓缩后加载体麦芽糊精混匀后喷雾 干燥制得粉状抗氧化肽，该杏仁蛋白抗氧化肽清除羟基自由基、超氧阴离子自由 基的效果明显，食用安全性高。
研究发现，与大豆蛋白、核桃蛋白相比，小白杏杏仁蛋白易水解程度较高， 且适宜水解后具有很强的抗氧化性，但是其抗氧化性能强弱与水解度不呈现线性 关系。本发明以自由基清除效果(IC50)为酶解指标，通过控制原料蛋白含量及酶 解反应条件，可显著提高反应产物的抗氧化性能，从而得到天然抗氧肽。
本发明的有益效果：本发明以脱脂小白杏杏仁粕为原料制备的抗氧化肽，其 生产成本较低、工艺操作简单、设备及人力投资小、重复性好，减少了水资源的 浪费与污染，同时可使酶解产物的抗氧化性能显著提升。通过本发明制得的抗氧 化肽不仅具有较为显著清除自由基的效果而且安全营养，为天然保鲜剂、功能性 抗氧化食品的开发提供可靠的基料或配料，可以提高我国抗氧化产品的质量和安 全性，适应天然食品添加剂市场发展的要求。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1
将100g小白杏脱脂杏仁粉(蛋白含量70%)和450mL水混合，分别浸泡及碾 磨20min、1min后调整该混合溶液的pH至7.5，加入碱性蛋白酶与胰蛋白酶复 合质量比为3:1的复合酶4500U/g(底物)，将所形成的待酶解体系溶液置于反应釜 中，在35℃下密闭反应2.5h，反应结束后立即将酶解体系温度升高至95℃灭酶 10min终止反应，得到具有抗氧化性能的酶解肽液，反应液浓缩后加载体麦芽糊 精混匀后喷雾干燥即制得粉末状抗氧化肽，其对羟基自由基、超氧阴离子自由基 的半抑制浓度(IC50)分别为0.34mg/mL、0.55mg/mL。
实施例2
将100g小白杏杏仁脱脂粕(蛋白含量73%)和470mL水混合，分别浸泡及碾 磨20min、1min后调整该混合溶液的pH至8.0，加入碱性蛋白酶与胰蛋白酶复 合质量比为3:1的复合酶4500U/g(底物)，将所形成的待酶解体系溶液置于反应釜 中，在37℃下密闭反应2.5h，反应结束后立即将酶解体系温度升高至95℃灭酶 10min终止反应，得到具有抗氧化性能的酶解肽液，反应液浓缩后加载体麦芽糊 精混匀后喷雾干燥即制得粉末状抗氧化肽，其对羟基自由基、超氧阴离子自由基 的半抑制浓度(IC50)分别为0.36mg/mL、0.50mg/mL。
实施例3
将100g小白杏杏仁脱脂粕(蛋白含量75%)和550mL水混合，分别浸泡及碾 磨20min、1min后调整该混合溶液的pH至7.8，加入碱性蛋白酶与胰蛋白酶复 合质量比为3:1的复合酶4000U/g(底物)，将所形成的待酶解体系溶液置于反应釜 中，在40℃下密闭反应3h，反应结束后立即将酶解体系温度升高至95℃灭酶 10min终止反应，得到具有抗氧化性能的酶解肽液，反应液浓缩后加载体麦芽糊 精混匀后喷雾干燥即制得粉末状抗氧化肽，其对羟基自由基、超氧阴离子自由基 的半抑制浓度(IC50)分别为0.33mg/mL、0.45mg/mL。
实施例4
将100g小白杏杏仁脱脂粕(蛋白含量75%)和600mL水混合，分别浸泡及碾 磨20min、1min后调整该混合溶液的pH至8.5，加入碱性蛋白酶与胰蛋白酶复 合质量比为3:1的复合酶3500U/g(底物)，将所形成的待酶解体系溶液置于反应釜 中，在38℃下密闭反应2.5h，反应结束后立即将酶解体系温度升高至95℃灭酶 10min终止反应，得到具有抗氧化性能的酶解肽液，反应液浓缩后加载体麦芽糊 精混匀后喷雾干燥即制得粉末状抗氧化肽，其对羟基自由基、超氧阴离子自由基 的半抑制浓度(IC50)分别为0.32mg/mL、0.49mg/mL。
实施例5
将100g小白杏杏仁脱脂粕(蛋白含量80%)和500mL水混合，分别浸泡及碾 磨20min、1min后调整该混合溶液的pH至8.5，加入碱性蛋白酶与胰蛋白酶复 合质量比为3:1的复合酶4000U/g(底物)，将所形成的待酶解体系溶液置于反应釜 中，在45℃下密闭反应3h，反应结束后立即将酶解体系温度升高至95℃灭酶 10min终止反应，得到具有抗氧化性能的酶解肽液，反应液浓缩后加载体麦芽糊 精混匀后喷雾干燥即制得粉末状抗氧化肽产品，其对羟基自由基、超氧阴离子自 由基的半抑制浓度(IC50)分别为0.30mg/mL、0.47mg/mL。
实施例6
将100g小白杏脱脂杏仁粉(蛋白含量70%)和450mL水混合，分别浸泡及碾 磨20min、1min后调整该混合溶液的pH至7.3，加入碱性蛋白酶与胰蛋白酶复 合质量比为3:1的复合酶4500U/g(底物)，将所形成的待酶解体系溶液置于反应釜 中，在50℃下密闭反应3h，反应结束后立即将酶解体系温度升高至95℃灭酶 10min终止反应，得到具有抗氧化性能的酶解肽液，反应液浓缩后加载体麦芽糊 精混匀后喷雾干燥即制得粉末状抗氧化肽，其对羟基自由基、超氧阴离子自由基 的半抑制浓度(IC50)分别为2.56mg/mL、3.33mg/mL。
实施例7
将100g小白杏杏仁脱脂粕(蛋白含量73%)和400mL水混合，分别浸泡及碾 磨20min、1min后调整该混合溶液的pH至8.0，加入碱性蛋白酶与胰蛋白酶复 合质量比为3:1的复合酶4500U/g(底物)，将所形成的待酶解体系溶液置于反应釜 中，在40℃下密闭反应2.5h，反应结束后立即将酶解体系温度升高至95℃灭酶 10min终止反应，得到具有抗氧化性能的酶解肽液，反应液浓缩后加载体麦芽糊 精混匀后喷雾干燥即制得粉末状抗氧化肽，其对羟基自由基、超氧阴离子自由基 的半抑制浓度(IC50)分别为0.98mg/mL、1.37mg/mL。
实施例8
将100g小白杏杏仁脱脂粕(蛋白含量75%)和700mL水混合，分别浸泡及碾 磨20min、1min后调整该混合溶液的pH至7.8，加入碱性蛋白酶与胰蛋白酶复 合质量比为3:1的复合酶5000U/g(底物)，将所形成的待酶解体系溶液置于反应釜 中，在30℃下密闭反应3h，反应结束后立即将酶解体系温度升高至95℃灭酶 10min终止反应，得到具有抗氧化性能的酶解肽液，反应液浓缩后加载体麦芽糊 精混匀后喷雾干燥即制得粉末状抗氧化肽，其对羟基自由基、超氧阴离子自由基 的半抑制浓度(IC50)分别为1.52mg/mL、1.71mg/mL。
实施例9
将100g小白杏杏仁脱脂粕(蛋白含量75%)和600mL水混合，分别浸泡及碾 磨20min、1min后调整该混合溶液的pH至8.5，加入碱性蛋白酶与胰蛋白酶复 合质量比为3:1的复合酶3000U/g(底物)，将所形成的待酶解体系溶液置于反应釜 中，在38℃下密闭反应4h，反应结束后立即将酶解体系温度升高至95℃灭酶 10min终止反应，得到具有抗氧化性能的酶解肽液，反应液浓缩后加载体麦芽糊 精混匀后喷雾干燥即制得粉末状抗氧化肽，其对羟基自由基、超氧阴离子自由基 的半抑制浓度(IC50)分别为1.59mg/mL、1.65mg/mL。
实施例10
将100g复合蛋白粕(小白杏杏仁蛋白含量60%，大豆分离蛋白20%)和500mL 水混合，分别浸泡及碾磨20min、1min后调整该混合溶液的pH至8.5，加入碱 性蛋白酶与胰蛋白酶复合质量比为3:1的复合酶4000U/g(底物)，将所形成的待酶 解体系溶液置于反应釜中，在45℃下密闭反应4h，反应结束后立即将酶解体系 温度升高至95℃灭酶10min终止反应，得到具有抗氧化性能的酶解肽液，反应 液浓缩后加载体麦芽糊精混匀后喷雾干燥即制得粉末状抗氧化肽，其对羟基自由 基、超氧阴离子自由基的半抑制浓度(IC50)分别为1.84mg/mL、2.57mg/mL。
通过实施例比较说明小白杏脱脂杏仁粕中不同蛋白含量及其它酶解条件对 目标产物抗氧化效果的影响较为明显，采用本专利要求的可控酶解反应条件富集 制备的抗氧化肽对羟基自由基、超氧阴离子自由基清除效果明显，其半抑制浓度 (IC50)变化范围较小，分别为0.30-0.36mg/mL、0.45-0.55mg/mL；在随机改变其 中某一种或几种酶解条件，相应富集产物IC50提升明显，即抗氧化效果显著减弱。
对上述实施例所得的不同条件下的抗氧化肽进行自由基清除效果对照分析， 可充分论证采用此种酶水解法制备小白杏杏仁抗氧化肽的科学性、简捷性及可行 性，为天然保鲜剂、功能性抗氧化食品的开发提供可靠的基料或配料，可以提高 我国抗氧化产品的质量和安全性，适应天然食品添加剂市场发展的要求。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或 变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。