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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310293649.2 (22)申请日 2013.07.12 C12N 15/29(2006.01) C12N 15/82(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A01H 5/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 南京农业大学 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇国 家农业科技园南京农业大学基地 (72)发明人 渠慎春 罗昌国 章镇 乔玉山 蔡斌华 张仕杰 辛璐 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 徐冬涛 傅婷婷 CN 1027。
2、87123 A,2012.11.21, 说明书全文 . Ralph,S.G 等 .EF147787.1.GenBank .2009, 全文 . 罗昌国等.湖北海棠MhWRKY40b 在几种胁迫 下的表达分析 .园艺学报 .2013, 第 40 卷 ( 第 1 期 ),1-9. 罗昌国等.湖北海棠MhWRKY40b 在几种胁迫 下的表达分析 .园艺学报 .2013, 第 40 卷 ( 第 1 期 ),1-9. (54) 发明名称 湖北海棠 MhWRKY40a 基因及其应用 (57) 摘要 本发明公开了 湖北海棠 MhWRKY40a 基因及 其应用。 湖北海棠 MhWRKY40a 基因， 核苷酸序。
3、列 如 SEQ ID NO.1。所述的 MhWRKY40a 基因在创制 耐盐和抗低温新种质和 / 或植物品种改良中的应 用。本发明首次从 湖北海棠 克隆得到了一个新 的 MhWRKY40a 基因， 该基因序列与拟南芥、 葡萄及 大麦之间的同源性为 50.89%。但 MhWRKY40a 基因 蛋白三级结构与模式植物拟南芥上的同源基因明 显不同， 前者具5个折叠而后者具4个折叠。 MhWRKY40a 转基因烟草具有较强的耐盐和抵御低 温胁迫的能力， 并提高了抗性相关基因的表达， 说 明 MhWRKY40a 基因具有提高植物耐盐和抗寒的功 能。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 潘俊。
4、宇 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书7页 序列表6页 附图8页 (10)授权公告号 CN 103387994 B (45)授权公告日 2015.03.04 CN 103387994 B 1/1 页 2 1. 湖北海棠MhWRKY40a基因， 其特征在于核苷酸序列如 SEQ ID NO.1。 2. 含有权利要求 1 所述的 MhWRKY40a 基因的重组表达载体。 3. 根据权利要求 2 所述的重组表达载体， 其特征在于所述的重组表达载体是将权利 要求 1 所述的MhWRKY40a基因插入到表达载体pYH4215的 BamH及Sac的酶切位点之 间所。
5、得。 4. 含有权利要求 1 所述的 MhWRKY40a基因的宿主细胞。 5. 根据权利要求 4 所述的含有 MhWRKY40a 基因的宿主细胞， 其特征在于所述的宿主 细胞为农杆菌。 6.权利要求 1 所述的 MhWRKY40a基因在创制耐盐及低温新种质和/或植物品种改良 中的应用。 7.权利要求 2 所述的含有 MhWRKY40a基因的重组表达载体在创制耐盐及低温新种质 和 / 或植物品种改良中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103387994 B 2 1/7 页 3 湖北海棠 MhWRKY40a 基因及其应用 技术领域 0001 本发明属于基因工程领域， 涉及 湖北海棠 MhWRKY。
6、40a 基因及其应用。 背景技术 0002 湖北海棠 （Malus hupehensis Rehd.） 为蔷薇科梨亚科苹果属多年生落叶小乔木， 具有分布广、 适应性强的特点， 是我国常用的苹果砧木。主要分布于我国湖南、 湖北、 四川、 云南、 贵州、 甘肃、 陕西、 河南、 河北、 山东、 山西、 安徽、 江苏、 浙江、 江西、 福建、 广东。从分类 分布的角度看， 湖北海棠也是我国特有的苹果属植物资源。 此外， 湖北海棠在抗病、 抗旱、 抗 涝、 无融合生殖方面具有重要的研究价值。挖掘湖北海棠抗性基因资源对于形成我为具有 自主知识产权的基因库具有重要的意义。 0003 苹果属植物种类繁多， 。
7、其中不乏一些优良的抗性育种资源， 育种工作者在多花海 棠 （Malus floribunda）找到了抗黑星病基因 Vf， 并成功培育抗黑星病和白粉病苹果品 种普利玛 Prima（Patocchi et al.1999; 束怀瑞 1999） 。20 世纪 60 年代， 在八棱海棠 （Malus robusta）和珠眉海棠 （Malus zumi）发现了对苹果白粉病具有高度抗性的基因 Pl1 和 Pl2（Knight and Alston1968; 束怀瑞 1999） ， 但直到目前为此还没有 Pl1和 Pl2 具体序列信息的报道。通过对近缘的种的抗性基因的挖掘， 以常规的杂交育种手段培育 抗性强。
8、的优良品种仍然是当前乃至今后相当长一段时间培育苹果新品种的安全有效的方 法。美洲粟 （Castanea dentata） 杂交育种是果树上抗性育种资源成功应用的典范， 美洲 粟 （Castanea dentata） 曾经因粟疫病而濒于灭绝， 而中国板粟 （Castanea mollissima） 抗 粟疫菌 （Cryphonectria parasitica） ， 通过两者杂交育种培育的抗粟疫病品种挽救了美洲 粟。目前， 通过转基因方法获得的某些方面抗性 （如抗虫、 抗除草剂等） 的农作物品种使得 其生产成本大大地降低， 其产品在价格方面也有了明显的竞争优势并占据了较大的市场份 额， 国外转基。
9、因大豆和玉米严重挤压国内相应行业的生存空间， 甚至威胁到了我国的粮油 安全问题。在果树上， 转番木瓜环斑病毒 (PRSV) 外壳蛋白基因的抗病番木瓜品种已经进 行商业化生产 10 余年时间， 也是最早进入商品化应用的多年生转基因果树品种 (Fermin et al.2011;Fitch et al.1992;Ling et al.1991;Tripathi et al.2007;Tripathi et al.2008)。我国具有丰富的抗性强的育种资源， 加强对我国的抗性基因资源的开发应用是 一项长远而有意义的工作。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一个新的 湖北海棠 MhWRKY40a 。
10、基因。 0005 本发明的另一目的是提供该 MhWRKY40a 基因的应用。 0006 本发明的目的可通过如下技术方案实现 ： 0007 湖北海棠 MhWRKY40a 基因， 核苷酸序列如 SEQ ID NO.1。 0008 含有所述的 MhWRKY40a 基因的重组表达载体。 0009 所述的重组表达载体优选将所述的 MhWRKY40a 基因插入到表达载体 pYH4215 的 说 明 书 CN 103387994 B 3 2/7 页 4 BamH 及 Sac 切酶的切位点之间所得。 0010 含有所述的 MhWRKY40a 基因的宿主细胞。 0011 所述的宿主细胞优选农杆菌。 0012 本。
11、发明所述的MhWRKY40a基因在创制耐盐耐及低温新种质和/或植物品种改良中 的应用。 0013 所述的含有MhWRKY40a基因的重组表达载体在创制耐盐及耐低温新种质和/或植 物品种改良中的应用。 0014 有益效果 0015 本发明首次从 湖北海棠 克隆得到了一个新的 MhWRKY40a 基因， 通过 DNAMAN 软 件将 湖北海棠 MhWRKY40a 氨基酸序列与 NCBI 上登录的其它物种进行序列比对， 序列比 对分析表明其与拟南芥 AtWRKY40、 葡萄 VvWRKY4 及大麦 WRKY 基因 1、 2、 3 之间的同源性为 50.89%， 推导的氨基酸序列 N 端具有 LZ 和。
12、 WRKYGQK 的保守结构域， C 端具 Cx45Cx2223HxH 保 守结构域。MhWRKY40a 基因蛋白三级结构与拟南芥 AtWRKY40 的明显不同， 前者具 5 个 折 叠而后者具 4 个 折叠。说明本发明 MhWRKY40a 基因与现有基因有显著的不同。 0016 转 MhWRKY40a 基因烟草提高了种子在盐胁迫下的发芽率、 极显著改善了种苗根 系的生长、 增加了植株的生物量积累， 基因表达分析显示， 转 MhWRKY40a 基因提高了烟草 SOS1、 SOS2、 SOS3 基础表达量 ； 冷胁迫中， 转基因烟草冻害死亡率极显著低于野生型烟草， 基因表达分析显示， 转 MhW。
13、RKY40a 基因提高了烟草 RCI2A 和 DREB2A 在各个处理时间点的表 达量。MhWRKY40a 基因调控抗性相关基因来提高了植株的耐盐性和抗寒性。 附图说明 0017 图 1 克隆载体 PMT19T 和表达载体 pYH4215 中 MhWRKY40a 基因酶切检测 0018 其中， M 为 marker。 0019 图 2 转 MhWRKY40a 基因烟草 GUS 检测 0020 其中， WT 为非转基因对照植株， 即野生型 （wildtype） 植株。 0021 图 3 转 MhWRKY40a 基因烟草 PCR 检测 （A） 及目的基因 RTPCR 检测 （B） 0022 其中，。
14、 WT 为非转基因对照植株， H2O 为空白对照水， 3、 6、 1636 分别表示 63、 66、 616636 转基因株系， M 为 marker。 0023 图 4 转基因烟草种子在不同含盐 （NaCl） 量的培养基上的发芽率， 0024 A 图为转基因烟草种子在含 0mM NaCl 的培养基上的发芽率， B 图为转基因烟草种 子在含 100mM NaCl 的培养基上的发芽率， C 图为转基因烟草种子在含 150mM NaCl 的培养 基上的发芽率， D 图为转基因烟草种子在含 200mM NaCl 的培养基上的发芽率。 0025 图 5 转基因烟草幼苗在不同含盐量的培养基上的生长情况 。
15、0026 图 6 耐盐相关基因在的表达情况 0027 图 7 烟草冻害处理 （12） 的表型 （A） 及存活率 （B） 0028 图 8 抗寒处理 （4） 相关基因 RCI2A（A 图） 和 DREB2A（B 图） 的表达情况 具体实施方式 0029 实施例 1 基因克隆 说 明 书 CN 103387994 B 4 3/7 页 5 0030 采用 CTAB 法提取湖北海棠叶片 RNA， 再将 RNA 反转录成 cDNA， 采用 RTPCR 方 法从叶片的 cDNA 模板中克隆目的基因。PCR 反应体系为模板 cDNA1L（50ngL1） ， 10PCR Buffer2.5L， MgCl21.。
16、5L（25mmolL1） ， dNTP2.0L（2.5mmolL1） ， 上游引 物 F1（SEQ ID NO.2） 、 下游引物 R1（SEQ ID NO.3） 各 1.0L（100ngL1） ， 1.0U rTaq 酶， 用超纯水补足至 25L。PCR 程序为 94 4min ； 94 30s， 56 30s， 72 2min， 35 个循 环 ； 72延伸 10min。取 20L 的 PCR 产物， 在 1.0% 琼脂糖凝胶电泳分析。回收目的片段 连接 pMD19-TSimple（TaKaRa） 载体后， 转化到 DH5 大肠杆菌， 随机挑取 5 个以上单菌落 进行测序， 该基因序列如 。
17、SEQ ID NO.1 所示。经测序后在 BioXM2.2 软件上进行分析， 预测 其编码区和编码的蛋白， 并在 NCBI 进行 Blast 比对分析。序列比对分析表明其与拟南芥 AtWRKY40、 葡萄 VvWRKY4 及大麦 WRKY 基因 1、 2、 3 之间的同源性为 50.89%， 推导的氨基酸序 列 N 端具有 LZ 和 WRKYGQK 的保守结构域， C 端具 Cx45Cx2223HxH 保守结构域。MhWRKY40a 基因蛋白三级结构与拟南芥 AtWRKY40 的明显不同， 前者具 5 个 折叠而后者具 4 个 折 叠。将获得的新基因命名为 MhWRKY40a。 0031 实施。
18、例 2 载体构建 0032 在酶切位点分析基上， 在原基因克隆引物的5端引入BamH及Sac酶切位点， 设计成带酶切位点的引物 （下划线部分序列） ， 即上游引物 K MhWRKY40a F（SEQ ID NO.4） 、 下游引物 K MhWRKY40a R （SEQ ID NO.5） 。以实施例 1 中测序正确的返还质粒为模板， PCR 扩增出带酶切位点的基因片段。反应体系如下 ： 0033 0034 PCR 程序为 94 4min ； 94 120s， 65 30s， 72 2min， 35 个循环 ； 72延伸 10min。 全部PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。 回收目的片段并连。
19、接PMD19 T Simple 上， 连接产物转化 DH5 大肠杆菌， 随机挑取 5 个以上单菌落进行测序。回收片段连接体系 如下 ： 0035 说 明 书 CN 103387994 B 5 4/7 页 6 0036 载体准备 （大片段） ： 取 pYH4215 载体 （罗昌国南京农业大学博士学位论文湖北海棠 WRKY 转录因子基因克隆与功能分析 2013， 06） 质粒转化 DH5 大肠杆菌， 经过含 Km+抗生素 （pYH4215 为 Km+抗性） 的平板培养筛选单克隆进行放大培养， 提取质粒酶切检测正确后使 用。 0037 pYH4215 载体双酶切体系 （准备 2 5 管） 如下 ： 。
20、0038 0039 0040 酶切在恒温水浴锅中进行， 30反应 3h。产物于 0.8% 的琼脂糖凝胶上检测， 割胶 回收大片段， 短时间存放可置于 4或冰冻或20保存， 长时间存放置于70保存。 0041 目的基因片段 （小片段） 准备 ： 将经测序正确并引物酶切位点的 MhWRKY40 基因克 隆菌液放大培养或直接提取质粒。因基因片段内含有一个 BamH I 酶切位点， 在没有进行点 突变的情况下采用不对称双酶切反应体， 如下 ： 0042 0043 酶切在恒温水浴锅中进行， 30反应 1h。小片段回收、 保存等方法同大片段。 0044 将备好的大片段和小片段按下列体系 4过夜连接反应 ：。
21、 0045 说 明 书 CN 103387994 B 6 5/7 页 7 0046 连接产物转化大肠杆菌， 挑取单克隆放大培养， 并菌液 PCR 鉴定。阳性克隆菌液提 取质粒， 再进行 PCR 和酶切鉴定， 酶切鉴定图见图 1。经鉴定正确的质粒用冻融法转入农杆 菌 EHA105 感受态细胞， 鉴定阳性克隆， 具体方法如下 ： 0047 （1） 取 1 3l 质粒加入到冰上融化的农杆菌 EHA105 感受态细胞中， 用移液枪轻 打混匀， 冰上静置 30min 后放入液氮中 5min。 0048 （2） 37恒温水浴锅温浴 120 180s 后， 立即冰上静置 2 3min。 0049 （3）加入。
22、 800L 无抗生素的 YEB 液体培养基 （无菌条件下， 超净工作台进行） ， 28， 180rpm 活化培养 3h。 0050 （4） 6000rpm 离心 60s， 弃除菌液保留沉淀， 加入 100L 含有 50ugmL1Rif、 50ugmL1Km 的液体 YEB， 移液枪打匀， 均匀涂到附加 50ugmL1Rif、 50ugmL1Km 的 YEB 平板上 （无菌条件下， 超净工作台进行） ， 28倒置暗培养 2 3d。 0051 （5） 挑取单菌落， 转入含有 50ugmL1Rif、 50ugmL1Km 的 YEB 液体培养基中 （无 菌条件下， 超净工作台进行） ， 28、 250。
23、rpm 振荡培养 24h。 0052 （6） 菌液 PCR 鉴定阳性克隆， 提取质粒酶切鉴定。 0053 （7） 鉴定正确的菌落用于转化烟草。 0054 实施例 3MhWRKY40a 基因转化烟草及检测 0055 转化过程要求无杂菌污染， 超净工作台进行。接种转化的农杆菌 EHA105 单菌 落在含 50ugmL1Rif、 50ugmL1Km 的 YEB 液体培养基中 28、 250rpm 振荡培养至 OD600 约 0.5 1.0， 分装于 50mL 的离心中， 每管装 40mL， 5000rpm 离心 10min， 弃除菌 液， 沉淀 （菌体）用 40mlMS 液体培养基重新悬浮， 28、。
24、 250rpm 振荡活化 1h ； 将烟草叶片 剪成 1 2cm2的叶块 （叶缘亦需剪除， 使边缘均形成伤口） ， 放入活化的农杆菌液中， 浸泡 3 5min， 其间轻摇几次 ； 取出材料， 放在无菌滤纸上吸去多余菌液， 接种于共培养培养基 （MS+BA1.0mgL1+NAA0.2mgL1， pH5.8） 中， 25 28弱光或黑暗条件下共培养 2 3d。 0056 共培养结束后， 将烟草叶片转入筛选培养基 （MS+BA1.0mg L 1+NAA0.2mg L 1+hyg30 mg L 1+cb500mg L 1， pH5.8） 中， 直接置于25下光照培养， 每天光照16h， 光照强度为40。
25、 50molm2s1， 20d 更换一次培养基 （主要防止农杆菌过度繁殖） ， 直至分化出直径 2cm 左右愈伤组织。将愈伤组织切成小块接种于多瓶筛选培养基中， 诱导抗性芽生长。 0057 剪下35cm长的抗性芽， 转入生根培养基 （1/2MS+IBA0.2mg L 1+hyg30mg L 1+cb2 00mg L 1， pH5.8） 中诱导生根， 每瓶接 1 3 个左右抗性芽。抗生芽生根并长高至 8 15cm 时， 对各个植株进行标识、 记录， 并进行 GUS 染色、 PCR、 RTPCR 鉴定， 阳性植株剪下带茎尖 茎段再次接到生根培养基中进行壮苗培养。 待植株生根良好、 生长健壮后 （根。
26、系长达瓶底边 缘、 茎粗壮、 叶大而浓绿） 打开瓶盖练苗 3 5d, 从瓶中取出转基因苗并尽量去除根系上的 培养基后移栽至营养钵中， 保持较高的湿度 10 20d， 成活后可在 10 35的自然条件下 说 明 书 CN 103387994 B 7 6/7 页 8 培养。 0058 转基因烟草 GUS 检测 ： 从抗性植株和阴性对照的顶端幼叶上剪取约 0.5cm2的叶 块， 放入装有3050L GUS染色液的250L离心管中， 37培养箱中进行GUS组织染色， 6 10h 后取出叶片， 用 80的乙醇脱色， 拍照记录， 结果见图 2， 转基因株系叶块边缘被染 成蓝色， 野生型不能被染成蓝色。 0。
27、059 转基因烟草 PCR 检测 ： 提取 GUS 染色阳性烟草植株的 DNA， 用 hyg 引物 （hyg F:GCATAACAGCGGTCATTG（SEQ ID NO.20） ； hyg R:TACTTCTACACAGCCATCG（SEQ ID NO.21） ） 进行 PCR 检测， 结果见图 3A， 可见 MhWRKY40a 基因已经成功转化至烟草中。 0060 转基因烟草 RTPCR 检测 ： 提取 PCR 检测阳性烟草植株的 RNA， 采用 DNase I 去除 RNA 中痕量的 DNA， 然后将其反转录成 cDNA， 用上节的构建载体时的引物进行 RT PCR 检测， 结果见图 3。
28、B， 可见 MhWRKY40a 基因已经成功转化至烟草中。 0061 实施例 4 转 MhWRKY40a 基因烟草耐盐性和抗寒性分析 0062 表 1 转基因烟草基因表达分析引物 0063 0064 种子消毒处理后分别播于 NaCl 浓度为 0、 100、 150、 200molL1的无糖 MS 培养基 中， 在温度为 252、 光照 1200lux（40 50molm-2s-1） 、 每天光照 16h 条件下培养。 无NaCl的培养基种子发芽快、 发芽率高， 57d基本完成发芽， 转基因烟草和野生型烟草发 芽率 95% 左右 ； 添加 100mol L 1NaCl 后， 种子发芽延迟至 9 。
29、11d， 转基因烟草发芽率下 说 明 书 CN 103387994 B 8 7/7 页 9 降至 92% 93%、 野生型的为 90% 左右 ； 7d 后转基因烟草和野生型发芽率约有 3% 5% 的差 距。当 NaCl 浓度增高至 150 和 200mol L 1时， 7d 后的转基因烟草和野生型烟草发芽率 差距比较明显， 相差约 15% 40%（图 4） 。 0065 转基因烟草和野生型烟草在不含盐的培养基中生长都比较一致， 随着盐浓度的增 高， 烟草种苗生长开始受到影响， 并且转基因和野生型烟草生长差异开始表现出来， 体现在 根系长度、 根系的数量、 叶片数量和植株生物量 4 个方面， 转。
30、基因明显较野生型烟草耐盐， 在盐胁迫下较野生型烟草生长良好 （图 5） 。 0066 移栽成活的幼苗用 200molL1NaCL 浇施处理 60d， 以水浇施处理为对照， 采取叶 样作为荧光定量 PCR 分析用。在长期的盐胁迫下， SOS1 和 SOS2 都上调表达， 但转基因烟 草的 SOS1 和 SOS2 上调幅度不及野生型烟草高 ； 而无盐胁迫条件下， 转基因烟草的 SOS1 和 SOS2 的表达量较野生型的高。SOS3 在盐处理中表达量没有较大变化， 但在无盐胁迫的情况 下， 转基因烟草较野生型的高。盐处理与无盐处理之间以及转基因与野生型之间 NHX 表达 变化不明显 （图 6） 。 。
31、0067 将正常生长的种植60d的盆栽烟草苗置于-5环境中12h， 然后恢复正常的培养， 调查冻害后的死亡率。 5处理烟草植株 12h 再恢复到正常培养， 植株冻害后存活率调查 结果显示， 野生型烟草存活率只有36%， 而转基因的为72%85%， 转基因烟草极显著提高了 植株的抗寒性 （图 7） 。 0068 将正常光照、 温度条件下生长的盆栽植株置于 4低温光照培养箱中， 分别于处理 后 0、 6、 12、 24h 采取叶样作为荧光定量 PCR 分析用。进一步对野生型和转基因烟草抗寒相 关基因 RCI2A 和 DREB2A 在 4低温胁迫下的表达分析结果表明， RCI2A 则在 24h 内呈。
32、持续 上调表达的趋势 ； DREB2A 在处后 6 24h 均上调表达至较高的表达水水平。而野生型和转 基因烟草比较， RCI2A 和 DREB2A 在转基因烟草表达量高， 而在非转基因烟草中表达量低 （图 8） 。 说 明 书 CN 103387994 B 9 1/6 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 103387994 B 10 2/6 页 11 0003 序 列 表 CN 103387994 B 11 3/6 页 12 0004 序 列 表 CN 103387994 B 12 4/6 页 13 0005 序 列 表 CN 103387994 B 13 5/6 页 14 00。
33、06 序 列 表 CN 103387994 B 14 6/6 页 15 序 列 表 CN 103387994 B 15 1/8 页 16 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103387994 B 16 2/8 页 17 图 3 说 明 书 附 图 CN 103387994 B 17 3/8 页 18 说 明 书 附 图 CN 103387994 B 18 4/8 页 19 图 4 说 明 书 附 图 CN 103387994 B 19 5/8 页 20 图 5 说 明 书 附 图 CN 103387994 B 20 6/8 页 21 图 6 说 明 书 附 图 CN 103387994 B 21 7/8 页 22 图 7 说 明 书 附 图 CN 103387994 B 22 8/8 页 23 图 8 说 明 书 附 图 CN 103387994 B 23 。