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1、(10)申请公布号 CN 103451314 A (43)申请公布日 2013.12.18 CN 103451314 A *CN103451314A* (21)申请号 201310459219.3 (22)申请日 2013.09.30 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 南京艾迪康医学检验所有限公司 地址 211100 江苏省南京市江宁区天印大道 671 号卫生应急指挥中心 3-4 楼 (72)发明人 周晓犊 王淑一 (74)专利代理机构 杭州裕阳专利事务所 ( 普通 合伙 ) 33221 代理人 应圣义 (54) 发明名称 检测 ID。
2、H1、 IDH2 基因多态突变位点的引物、 方法和试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了检测 IDH1、 IDH2 基因多态突变 热点的引物、 方法和试剂盒, 其中所用引物包括 : ( ) 扩增 IDH1 基因包含第 132 位氨基酸序列的 引物 ; ()扩增IDH2基因包含第140、 172位氨基 酸序列的引物 ; 采用普通 PCR 技术, 可用于快速检 测急性粒细胞白血病 (AML) 患者体内 IDH1、 IDH2 基因多态热点的突变情况。本发明有效地提高自 动化程度, 省去了以往对于IDH1和IDH2进行全外 显子测序的繁琐流程和大量检测费用, 有助于快 速、 准确地诊断患者预后, 且费用。
3、低。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 10 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书10页 序列表1页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103451314 A CN 103451314 A *CN103451314A* 1/2 页 2 1. 检测 IDH1、 IDH2 基因多态热点突变情况的引物, 其特征在于, 包括 : ( ) 扩增 IDH1 基因的引物, 其碱基序列为 : IDH1-132-F : GATGAGAAGAGGGTTGAGGA IDH1-132-R : GTTGGAAATTTCT。
4、GGGCCAT ( ) 扩增 IDH2 基因的引物, 其碱基序列为 : IDH2-140/172-F : CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT IDH2-140/172-R : CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。 2. 如权利要求 1 所述的引物, 其特征在于, 还包括测序引物, 其碱基序列为 : ( ) 检测 IDH1 基因的测序引物碱基序列为 : IDH1-132-F : GATGAGAAGAGGGTTGAGGA IDH1-132-R : GTTGGAAATTTCTGGGCCAT ( ) 检测 IDH2 基因的测序序列的引物碱基序列为 : IDH2-140/172-F : CT。
5、GTGTTGTTGCTTGGGGTT IDH2-140/172-R : CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。 3.如权利要求1所述的引物, 其特征在于, 引物序列IDH1-132-F和IDH1-132-R是扩增 IDH1 基因包含第 132 位氨基酸序列的引物。 4. 如 权 利 要 求 1 所 述 的 引 物,其 特 征 在 于,引 物 序 列 IDH2-140/172-F 和 IDH2-140/172-R 是扩增扩增 IDH2 基因包含第 140、 第 172 位氨基酸序列的引物。 5. 检测 IDH1、 IDH2 基因多态热点突变情况的方法, 包括以下步骤 : 抽提血液中的组织 D。
6、NA ; 用 PCR 扩增步骤 1 中提取的 DNA ; 对步骤 2 中的扩增产物进行测序 ; 对测序结果进行判断, 确定 IDH1、 IDH2 基因是否发生突变 ; 其中 PCR 扩增引物为 : ( ) 扩增 IDH1 基因的引物, 其碱基序列为 : IDH1-132-F : GATGAGAAGAGGGTTGAGGA IDH1-132-R : GTTGGAAATTTCTGGGCCAT ( ) 扩增 IDH2 基因的引物, 其碱基序列为 : IDH2-140/172-F : CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT IDH2-140/172-R : CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。 。
7、6. 如权利要求 5 所述的方法, 其特征在于, 测序引物碱基序列为 : ( ) 检测 IDH1 基因的测序引物碱基序列为 : IDH1-132-F : GATGAGAAGAGGGTTGAGGA IDH1-132-R : GTTGGAAATTTCTGGGCCAT ( ) 检测 IDH2 基因的测序序列的引物碱基序列为 : IDH2-140/172-F : CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT IDH2-140/172-R : CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。 7. 一种检测 IDH1、 IDH2 基因多态突变位点的试剂盒, 包括 (i) 组织 DNA 抽提试剂 ; 权 利 要 求。
8、 书 CN 103451314 A 2 2/2 页 3 (ii) 检测体系 PCR 扩增反应液 ; (iii) 测序体系试剂 ; (iv) 阳性对照品和阴性对照品 ; 其中 PCR 扩增反应液引物为 : ( ) 扩增 IDH1 基因的引物, 其碱基序列为 : IDH1-132-F : GATGAGAAGAGGGTTGAGGA IDH1-132-R : GTTGGAAATTTCTGGGCCAT ( ) 扩增 IDH2 基因的引物, 其碱基序列为 : IDH2-140/172-F : CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT IDH2-140/172-R : CAAGAGGATGGCTAGGCGA。
9、G。 8. 如权利要求 7 所述的试剂盒, 其特征在于, 测序引物碱基序列为 : ( ) 检测 IDH1 基因的测序引物碱基序列为 : IDH1-132-F : GATGAGAAGAGGGTTGAGGA IDH1-132-R : GTTGGAAATTTCTGGGCCAT ( ) 检测 IDH2 基因的测序序列的引物碱基序列为 : IDH2-140/172-F : CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT IDH2-140/172-R : CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。 9. 如权利要求 7 所述的试剂盒, 其特征在于, 阳性对照品 : 分别为含有 IDH1 第 132 位 氨基酸序。
10、列和 IDH2 第 140 位、 172 位氨基酸序列的溶液 ; 阴性对照品 : 无 IDH1 第 132 位氨 基酸序列和 IDH2 第 140 位、 172 位氨基酸序列的溶液。 权 利 要 求 书 CN 103451314 A 3 1/10 页 4 检测 IDH1、 IDH2 基因多态突变位点的引物、 方法和试剂盒 0001 技术领域 0002 本发明属生命科学和生物技术领域, 特别涉及检测 IDH1、 IDH2 基因多态突变热点 的引物, 采用普通 PCR 技术, 可用于快速检测急性粒细胞白血病 (AML) 患者体内 IDH1、 IDH2 基因多态位点的突变情况。 0003 背景技术 。
11、0004 造血组细胞的获得性遗传和表观遗传学的改变是急性髓系白血病 (AML) 的发病因 素之一, 这些变化改变了造血组细胞的生长、 增殖和分化的正常机制。AML 发病时骨髓原始 细胞隐藏着一种或以上的染色体变异, 这些变异不仅是 AML 的诊断标志, 更是评价完全缓 解率 (CR), 复发风险 (RR) ) 及总生存 (OS) 的指标。然而, 国外资料表明, AML 的染色体核型 异常检出率为60-80%。 因此, 仍有一大部分AML患者没有发现染色体变异, 这组患者所患的 疾病为核型正常的 AML (CN-AML), 是 AML 中占比例最多的亚型, 按细胞遗传学分析, 它们归 为预后中等。
12、组。 0005 异柠檬酸脱氢酶 (IDH) 家族包括以 NAD 或 NADP 为辅助因子, 催化异柠檬酸的氧化 脱酸反应生成 - 酮戊二酸的酶类, 同时分别生成 NADH 或 NADPH。在哺乳动物细胞中, IDH 同工酶有以下三种形式 : 依赖 NAD 的线粒体 IDH, 依赖 NADP 的线粒体 IDH, 依赖 NADP 的胞质 IDH。编码依赖 NADP 的人 IDH 1 酶的 IDH 1 基因位于染色体 2q33.3, 并且定位于细胞质和 过氧化物酶体中 ; 编码依赖 NADP 的线粒体 IDH2 酶的 IDH2 基因位于染色体 15q26.1。尽管 IDH1 和 IDH2 都参与了细。
13、胞内氧化损伤的防御机制, 但 IDH1 在脂质的代谢机制中起了重要 作用。 0006 近年来, 更多的研究发现, IDH1 和 IDH2 突变存在于急性髓系白血病 (AML) 、 急性 淋巴性白血病 (ALL) 、 骨髓增殖性疾病 (MPD) 中, 在慢性粒细胞白血病 (CML) 中尚未检测到 突变。文献报道 IDH 1 和 IDH2 热点突变在 CN-AML 患者中的发生率分别为 5.5-9.6% 和 3-11%, 并认为具有 IDH 1 和 IDH2 热点突变的 AML 患者具有较低的 CR, 较高的 RR 和较短的 OS。目前对于 IDH1 和 IDH2 的检测主要采用全外显子测序的方法。
14、, 该方法流程繁琐和检测 费用高。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种检测 IDH1、 IDH2 基因多态突变热点的引物, 采用 PCR 技 术, 可用于快速检测急性粒细胞白血病 (AML) 患者体内 IDH1、 IDH2 基因多态位点的突变情 况。所述检测 IDH1、 IDH2 基因多态热点突变情况的引物, 其特征在于, 包括 : ( ) 扩增 IDH1 基因的引物, 其碱基序列为 : IDH1-132-F : GATGAGAAGAGGGTTGAGGA(SEQ NO1) 说 明 书 CN 103451314 A 4 2/10 页 5 IDH1-132-R : GTTGGAAATTTC。
15、TGGGCCAT(SEQ NO2) ( ) 扩增 IDH2 基因的引物, 其碱基序列为 : IDH2-140/172-F : CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT(SEQ NO3) IDH2-140/172-R : CAAGAGGATGGCTAGGCGAG(SEQ NO4) 。 0008 进一步地, 还包括测序引物, 其碱基序列为 : ( ) 检测 IDH1 基因的测序引物碱基序列为 : IDH1-132-F : GATGAGAAGAGGGTTGAGGA(SEQ NO1) IDH1-132-R : GTTGGAAATTTCTGGGCCAT(SEQ NO2) ( ) 检测 IDH2 基因的测。
16、序序列的引物碱基序列为 : IDH2-140/172-F : CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT(SEQ NO3) IDH2-140/172-R : CAAGAGGATGGCTAGGCGAG(SEQ NO4) 。 0009 进一步地, 引物序列 IDH1-132-F 和 IDH1-132-R 是扩增 IDH1 基因包含第 132 位氨 基酸序列的引物。 0010 进一步地, 引物序列 IDH2-140/172-F 和 IDH2-140/172-R 是扩增扩增 IDH2 基因包 含第 140、 第 172 位氨基酸序列的引物。 0011 本发明还提供了检测 IDH1、 IDH2 基因多态热。
17、点突变情况的方法, 包括以下步骤 : 1. 抽提血液中的组织 DNA ; 2. 用 PCR 扩增步骤 1 中提取的 DNA ; 3. 对步骤 2 中的扩增产物进行测序 ; 4. 对测序结果进行判断, 确定 IDH1、 IDH2 基因是否发生突变 ; 其中 PCR 扩增引物为 : ( ) 扩增 IDH1 基因的引物, 其碱基序列为 : IDH1-132-F : GATGAGAAGAGGGTTGAGGA IDH1-132-R : GTTGGAAATTTCTGGGCCAT ( ) 扩增 IDH2 基因的引物, 其碱基序列为 : IDH2-140/172-F : CTGTGTTGTTGCTTGGGGT。
18、T IDH2-140/172-R : CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。 0012 进一步地, 测序引物碱基序列为 : ( ) 检测 IDH1 基因的测序引物碱基序列为 : IDH1-132-F : GATGAGAAGAGGGTTGAGGA IDH1-132-R : GTTGGAAATTTCTGGGCCAT ( ) 检测 IDH2 基因的测序序列的引物碱基序列为 : IDH2-140/172-F : CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT IDH2-140/172-R : CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。 0013 本发明还提供了一种检测 IDH1、 IDH2 基因多态突变。
19、位点的试剂盒, 包括 (i) 组织 DNA 抽提试剂 ; (ii) 检测体系 PCR 扩增反应液 ; (iii) 测序体系试剂 ; (iv) 阳性对照品和阴性对照品 ; 说 明 书 CN 103451314 A 5 3/10 页 6 其中 PCR 扩增反应液引物为 : ( ) 扩增 IDH1 基因的引物, 其碱基序列为 : IDH1-132-F : GATGAGAAGAGGGTTGAGGA IDH1-132-R : GTTGGAAATTTCTGGGCCAT ( ) 扩增 IDH2 基因的引物, 其碱基序列为 : IDH2-140/172-F : CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT IDH。
20、2-140/172-R : CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。 0014 进一步地, 测序引物碱基序列为 : ( ) 检测 IDH1 基因的测序引物碱基序列为 : IDH1-132-F : GATGAGAAGAGGGTTGAGGA IDH1-132-R : GTTGGAAATTTCTGGGCCAT ( ) 检测 IDH2 基因的测序序列的引物碱基序列为 : IDH2-140/172-F : CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT IDH2-140/172-R : CAAGAGGATGGCTAGGCGAG。 0015 进一步地, 阳性对照品 : 分别为含有 IDH1 第 132 位氨基。
21、酸序列和 IDH2 第 140 位、 172 位氨基酸序列的溶液 ; 阴性对照品 : 无 IDH1 第 132 位氨基酸序列和 IDH2 第 140 位、 172 位氨基酸序列的溶液。 0016 有益效果 : 本发明设计了扩增 IDH1 第 132 位, IDH2 第 140 位、 172 位氨基酸序列的 引物。采用普通 PCR 技术, 构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、 退火温度等反应条 件, 可使扩增效率达到最佳。本发明利用 PCR 技术检测患者 IDH1 和 IDH2 突变热点的方法, 可有效地提高自动化程度, 省去了以往对于 IDH1 和 IDH2 进行全外显子测序的繁琐流程和 。
22、大量检测费用, 有助于快速、 准确的诊断患者预后, 对于临床上急性粒细胞白血病 (AML) 患 者的治疗和用药有极大的指导意义。 0017 附图说明 0018 图 1 样本 1 IDH1 R132 测序图谱。 0019 图 2 样本 2 IDH1 R132 测序图谱。 0020 图 3 样本 3 IDH1 R132 测序图谱。 0021 图 4 样本 5 IDH2 R140 测序图谱。 0022 图 5 样本 5 IDH2 R172 测序图谱。 0023 图 6 样本 6 IDH2 R140 测序图谱。 0024 图 7 样本 6 IDH2 R172 测序图谱。 0025 图 8 样本 8 I。
23、DH2 R140 测序图谱。 0026 图 9 样本 8 IDH2 R172 测序图谱。 0027 具体实施方式 0028 实施例 1 说 明 书 CN 103451314 A 6 4/10 页 7 下面结合具体实施例和附图, 进一步阐述本发明。应当注意的是, 实施例中未说明的 常规条件和方法, 通常按照所属领域实验人员常规采用方法 : 譬如, 奥斯柏和金斯顿主编的 精编分子生物学实验指南 第四版, 或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。 0029 一种检测 IDH1、 IDH2 基因多态突变位点的引物, 该引物的设计是针对 IDH1 和 IDH2 突 变热点所设计的特异性扩增引物, 包括 : 。
24、( ) 扩增 IDH1 基因包含第 132 位氨基酸序列的引物, 其碱基序列为 : IDH1-132-F : GATGAGAAGAGGGTTGAGGA IDH1-132-R : GTTGGAAATTTCTGGGCCAT ( ) 扩增 IDH2 基因包含第 140、 第 172 位氨基酸序列的引物, 其碱基序列为 : IDH2-140/172-F : CTGTGTTGTTGCTTGGGGTT IDH2-140/172-R : CAAGAGGATGGCTAGGCGAG 一种检测 IDH1、 IDH2 基因多态突变位点的试剂盒, 包括 (i) 组织 DNA 抽提试剂 ; (ii) 检测体系 PCR 。
25、反应液 ; 。 0030 (iii) 测序体系试剂 ; (iv) 阳性对照品和阴性对照品。 0031 其中, 组织 DNA 抽提试剂可购自天根 DNA 抽提试剂盒等商品化试剂。 0032 检 测 体 系 PCR 扩 增 反 应 液 包 括 : 10PCR Buffer ; 2mM dNTPs ; KOD FX DNA Polymerase(1U/l) ; 检测 IDH1 基因第 132 位氨基酸序列的上、 下游引物 IDH1-132-F (10m)、 IDH1-132-R (10m) ; 检测 IDH2 基因第 140、 172 位氨基酸序列的上、 下游引物 IDH2-140/172-F(10。
26、m)、 IDH2-140/172-R(10m)。 0033 测序体系试剂包括 : 测序纯化液 (ExoI:0.6U, CIP:1.2U)、 EDTA(125mmol)、 无 水乙醇、 75% 乙醇、 HIDI(高度去离子甲酰胺) 、 测序引物 : 检测 IDH1 基因第 132 位氨 基酸序列的上、 下游引物分别为 IDH1-132-F (3.2m)、 IDH1-132-R (3.2m) ; 检测 IDH2 基因第 140、 172 位氨基酸序列的上、 下游引物分别为 IDH2-140/172-F(3.2m)、 IDH2-140/172-R(3.2m)。 0034 阳性对照品 : 分别为含有 。
27、IDH1 第 132 位氨基酸序列和 IDH2 第 140 位、 172 位氨基 酸序列的溶液。 0035 阴性对照品 : 无 IDH1 第 132 位氨基酸序列和 IDH2 第 140 位、 172 位氨基酸序列的 溶液。 0036 实施例 2 血液 / 细胞 / 组织基因组 DNA 抽提试剂盒 (天根生物) 的操作流程 : (1) 抽提血液中的组织DNA : 1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液, 颠倒混匀, 室温放置5 分钟, 期间再颠倒混匀几次。 3000rpm离心5min, 吸去上清, 留下白细胞沉淀, 加 200uL 缓冲液 GA, 振荡至彻底混匀。2) 加入 20 。
28、l 蛋白酶 K 溶液, 混匀。3) 加入 200 l 缓冲液 GB, 充分颠倒混匀, 70放置 10 分钟, 溶液应变清亮, 简短离心以去除管盖内壁的水 珠。4) 加入 200 l 无水乙醇, 充分振荡混匀 15 秒, 此时可能会出现絮状沉淀, 简短离心 以去除管盖内壁的水珠。5) 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱 CB3 中 (吸附 说 明 书 CN 103451314 A 7 5/10 页 8 柱放入收集管中) , 12, 000 rpm (13, 400g) 离心 30 秒, 倒掉废液, 将吸附柱 CB3 放回收 集管中。6) 向吸附柱 CB3 中加入 500 l 缓冲液 GD。
29、(使用前请先检查是否已加入无水乙 醇) , 12, 000 rpm (13, 400g)离心30 秒, 倒掉废液, 将吸附柱CB3 放入收集管中。 7) 向吸 附柱 CB3 中加入 700 l 漂洗液 PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇) , 12, 000 rpm (13, 400g) 离心 30 秒, 倒掉废液, 将吸附柱 CB3 放入收集管中。8) 向吸附柱 CB3 中加入 500 l 漂洗液 PW, 12, 000 rpm (13, 400g) 离心 30 秒, 倒掉废液。9) 将吸附柱 CB3 放 回收集管中, 12, 000 rpm(13, 400g)离心2 分钟, 倒掉废液。。
30、 将吸附柱CB3 置于室温放置 数分钟, 以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10) 将吸附柱 CB3 转入一个干净的离心管 中, 向吸附膜的中间部位悬空滴加 100l 洗脱缓冲液 TE, 室温放置 2-5 分钟, 12, 000 rpm (13, 400g) 离心 2 分钟, 将溶液收集到离心管中。 0037 (2) 试剂配置 : 按检测人份数配置检测体系 PCR 反应液各 X l, 每人份 18l 分 装 : X=18l 反应液 (n 份标本 +1 份阳性对照 +1 份阴性对照 +1 份空白对照) n 为检测标本数。 0038 (3) 加样 : 加入检测体系PCR反应液中2l DNA ; 阳。
31、性对照和阴性对照直接加2l 阳性对照品和阴性对照品 ; 空白对照加 2l 生理盐水或不加任何物质。 0039 (4) 扩增 : 检测在常规 PCR 仪上进行, 可用仪器包括 ABI veriti(美国 Applied Biosystems 公司) 等。反应条件如下 : PCR 扩增试剂配制方法如下 IDH1 : 试剂名称用量 2*Buffer10l dNTP(2mM)4l IDH1-132-F(10m)0.5l IDH1-132-R(10m)0.5l KODFXDNAPolymerase(1U/l)Polymerase(1U/l)0.5l ddH203.5l 抽提的 DNA1l 总计20l I。
32、DH2 : 试剂名称用量 2*Buffer10l dNTP(2mM)4l IDH2-140/172-F(10m)0.5l IDH2-140/172-R(10m)0.5l 说 明 书 CN 103451314 A 8 6/10 页 9 KODFXDNAPolymerase(1U/l)0.5l ddH203.5l 抽提的 DNA1l 总计20l 其中, 引物序列为 : 引物名称引物序列Tm IDH1-132-FGATGAGAAGAGGGTTGAGGA52 IDH1-132-RGTTGGAAATTTCTGGGCCAT53 IDH2-140/172-FCTGTGTTGTTGCTTGGGGTT55 ID。
33、H2-140/172-RCAAGAGGATGGCTAGGCGAG56 (5) Sanger 测序 : 取 9l PCR 产物与 2l 纯化体系。按照以下程序进行纯化 : 反应阶段反应条件 纯化37 50min 变性95 5min 保存4 将 1l 纯化产物分别与上、 下测序引物按照如下体系进行混合 :(其中上、 下游引物分 别为 IDH2-140/172-F、 IDH2-140/172-R) 。 0040 测序反应程序 : 沉淀环节 : 向完成测序反应的产物中加入2l 125mmol的EDTA, 静置5min ; 加入15ml无水乙醇, 漩涡混匀 ; 3700rpm 离心 30min ; 倒置。
34、离心 15sec, 加入 50ml70% 乙醇, 漩涡混匀 ; 3700rpm 离 心 15min ; 倒置离心 15sec, 置于 95金属浴上 ; 加入 10l HIDI 后进行变性试验。变性程 序 : 说 明 书 CN 103451314 A 9 7/10 页 10 变性程序结束后, 上测序仪 (ABI3730) 测序。 0041 (7)结果判断 : 分别将测序结果与 IDH1 野生型参考序列 (Genbank accn : NG_023319.2) 和 IDH2 野生型参考序列 (Genbank accn : NG_023302.1) 进行比对, 根据实际 突变情况对结果进行报告。 0。
35、042 实施例 3 采用本发明核酸检测试剂和方法检测临床标本。 0043 取送检急性粒细胞白血病 (AML) 患者抗凝血标本 20 例, 按实施例 2 所述方法提取 基因组 DNA、 配制试剂并检测。 0044 每份标本加入检测体系 PCR 反应液中 2l。同时做阳性, 阴性, 空白对照, 一台 96 孔的普通 PCR 仪可同时检测 46 份样品, 每个样本 2 次重复, 一份阳性对照, 一份阴性对照和 一份空白对照。检测时间为 160 分钟。 0045 每个样本经 2 次测序后, 比对突变的情况, 对于结果不统一的样本将进行第三次 测序。最后, 根据测序结果对于预后进行判断。检测结果如下表 。
36、: 说 明 书 CN 103451314 A 10 8/10 页 11 从上表可以看出, 20 例样本中, 本试剂盒检测出 IDH1 和 IDH2 基因一共 8 例突变, 而全 外显子测序法测序法仅检出 6 例突变。经克隆测序确认, 这两例未被市面上的同类检测试 剂盒测出的病例, 的确发生了突变。因此, 相比于市面上同类产品, 本发明检测试剂盒具有 检测结果准确性高等突出特点。能让医生能准确判断患者预后情况, 控制患者的病情。本 发明利用 PCR 技术检测患者 IDH1 和 IDH2 突变热点的方法, 省去了以往对于 IDH1 和 IDH2 进行全外显子测序的繁琐流程和大量检测费用, 实施例 。
37、4 取 AML 患者临床样品 6 份, 按实施例 2 所述方法提取基因组、 配制试剂并检测。每份样 品加入检测体系 PCR 反应液中 2l。同时做阳性, 阴性, 空白对照各一份。用普通 PCR 仪检 测, 时间为 160 分钟。其中前 4 例进行 IDH1 突变检测, 后 4 例进行 IDH2 检测。 说 明 书 CN 103451314 A 11 9/10 页 12 0046 样品 1 经融合基因筛查检测, 发现 AML-ETO 融合基因表达活跃, 临床诊断预后良 好。本试剂盒的检测结果的检测结果图如图 1 所示, R132 未发生突变, 为 IDH1 野生型, 预 后与临床结果吻合, 建议。
38、维持当前治疗方案。 0047 样品 2 经融合基因筛查检测, 发现 MLL-ENL 融合基因表达活跃, 临床诊断预后不 佳。本试剂盒的检测结果图如图 2 所示, 395G/A 杂合, 导致产生 IDH1 132R、 H 杂合, 该突变 预后不良, 预后判断与临床结果吻合, 建议尽快进行异基因移植。 0048 样品 3 经融合基因筛查检测, 发现 MLL-AF4 融合基因表达活跃, 临床诊断预后不 佳。 本试剂盒的检测结果图如图3所示, 394CA, 导致产生IDH1 R132S, 该突变预后不良, 预后判断与临床结果吻合, 建议尽快进行异基因移植。 0049 样品 4 经融合基因筛查检测, 发。
39、现 MLL-AF9 融合基因表达活跃, 临床诊断预后不 佳。本试剂盒的的检测结果图如图 4-5 所示, 419G A, 导致产生 IDH2 R140Q ; R172 无突 变, 该类型预后不良, 预后判断与临床结果吻合, 建议尽快进行异基因移植。 0050 样品 5 经融合基因筛查检测, 未发现标志性融合基因转录本, 临床诊断预后一般。 本试剂盒的的检测结果图如图 6-7 所示, R140 和 R172 均未发生突变, 为 IDH2 野生型, 该类 型预后良好, 预后判断与临床结果吻合, 建议维持当前治疗方案。 0051 样品 6 经融合基因筛查检测, 发现 MLL-ELL 融合基因表达活跃,。
40、 临床诊断预后不 佳。本试剂盒的检测结果图如图 8-9 所示, R140 无突变 ; 515G A, 导致产生 IDH2 R172K, 该突变预后不良, 预后判断与临床结果吻合, 建议尽快进行异基因移植。 0052 序列表 南京艾迪康医学检验所有限公司 检测 IDH1、 IDH2 基因多态突变位点的引物、 方法和试剂盒 4 PatentIn version 3.3 1 20 DNA 人工序列 1 gatgagaaga gggttgagga 20 2 20 DNA 人工序列 2 gttggaaatt tctgggccat 20 3 20 说 明 书 CN 103451314 A 12 10/10。
41、 页 13 DNA 人工序列 3 ctgtgttgtt gcttggggtt 20 4 20 DNA 人工序列 4 caagaggatg gctaggcgag 20 说 明 书 CN 103451314 A 13 1/1 页 14 序列表 南京艾迪康医学检验所有限公司 检测 IDH1、 IDH2 基因多态突变位点的引物、 方法和试剂盒 4 PatentIn version 3.3 1 20 DNA 人工序列 1 gatgagaaga gggttgagga 20 2 20 DNA 人工序列 2 gttggaaatt tctgggccat 20 3 20 DNA 人工序列 3 ctgtgttgtt gcttggggtt 20 4 20 DNA 人工序列 4 caagaggatg gctaggcgag 20 序 列 表 CN 103451314 A 14 1/3 页 15 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103451314 A 15 2/3 页 16 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103451314 A 16 3/3 页 17 图 7 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 103451314 A 17 。