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1、(10)授权公告号 CN 103265634 B (45)授权公告日 2014.11.26 CN 103265634 B (21)申请号 201310154397.5 (22)申请日 2013.04.28 C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (73)专利权人 中国农业科学院作物科学研究所 地址 100081 北京市海淀区中关。
2、村南大街 12 号 (72)发明人 李宏宇 张春雨 刘斌 赵涛 刘军 林辰涛 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 CN 102775499 A,2012.11.14, CN 102775498 A,2012.11.14, Keiichiro Hiratsu et al.,.Dominant repression of target genes by chimeric repressors that include the EAR motif, a repression domain, in Arabdopsis. The Plant Journal。
3、 .2003, 第 34 卷 ( 第 5 期 ), (54) 发明名称 水稻转录因子 Os01g64730 基因的应用 (57) 摘要 本发明涉及水稻转录因子 Os01g64730 基因 的应用， 其是利用转录因子抑制基序 EAR 与水稻 转录因子 Os01g64730 基因融合构建得到组成型 转录因子， 并转化到农作物如水稻中， 从而提前转 基因水稻的抽穗期、 缩短生育期。 对于详细阐明水 稻抽穗调控的分子机理， 具有重要的理论价值， 并 且可以通过转基因手段， 缩短水稻生育期， 改善水 稻对不同生态区的适应能力， 因此在生产实践中 同样具有重要意义。 (51)Int.Cl. (56)对比文。
4、件 审查员 潘天耀 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 13 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 序列表13页 附图2页 (10)授权公告号 CN 103265634 B CN 103265634 B 1/1 页 2 1. 一种融合蛋白， 其特征在于， 该融合蛋白为 Os01g64730-Linker-EAR ； 其中， Linker 的序列为 GGGGG ； EAR 为来自植物转录因子的一段具有转录抑制功能的蛋 白基序， 其氨基酸序列如Seq ID No.2所示 ； Os01g64730为水稻转录因子Os01g6473。
5、0， 其氨 基酸序列如 Seq ID No.1 所示。 2. 编码权利要求 1 所述融合蛋白的基因。 3. 含有权利要求 2 所述基因的载体。 4. 含有权利要求 2 所述基因的工程菌。 5. 权利要求 2 所述的基因在提前水稻抽穗、 缩短生育期中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103265634 B 2 1/4 页 3 水稻转录因子 Os01g64730 基因的应用 技术领域 0001 本发明涉及基因工程领域， 具体地说， 涉及水稻转录因子 Os01g64730 基因的应 用。 背景技术 0002 在长日照植物 （LDP） 拟南芥 (Baurle and Dean,2006;Imaizu。
6、mi and Kay,2006) 和短日照植物 （SDP）水稻 (Izawa,2007;Tuji 等 ,2008) 中， 开花信号途径已得到了广泛 的研究。GI-CO-FT 是控制水稻开花的保守途径 (Yano 等 ,2000;Kojima 等 ,2002;Hayama 等 ,2002)。Hd3a 是水稻中 FT 的同源基因， 它受到一个 B 型响应调控子 Ehd1 的诱导， 该途 径在短日照条件下独立于 Hd1 基因 (Doi 等 ,2004)。OsMADS51 受 OsGI 的调控， 该作用位于 Ehd1 的上游 (Kim 等 ,2007)。相反， 在长日照条件下， Hd1 抑制 Hd3a。
7、 的表达而推迟水稻开花 (Hayama 等 ,2003)。最新研究表明， Hd3a 与 14-3-3 蛋白形成复合体后转入细胞核内， 与转 录因子 FD1 结合形成三聚体 FAC(florigen activation complex)， 诱导 OsMADS15 的转录， 从而使水稻开花。 0003 转录因子在体内的作用大体上可以分成两种 ： 一种为转录增强子， 另一种为转录 抑制子。当转录因子和 EAR 功能域基序融合之后， 它就会抑制转录因子的功能， 从而在转基 因植株中出现更明显的表型变化。 发明内容 0004 本发明的目的是提供水稻转录因子 Os01g64730 基因的应用。 0005。
8、 为 了 实 现 本 发 明 目 的， 本 发 明 首 先 提 供 一 种 融 合 蛋 白， 该 融 合 蛋 白 为 Os01g64730-Linker-EAR 或 EAR-Linker-Os01g64730。其中， Linker 由 1 20 个柔性氨基 酸串联而成 （例如， GGGGG、 GPPPG 或 Gatway 载体重组位点编码的氨基酸序列 DPAFLYKVVPR 等） 。 0006 EAR 为来自植物转录因子的一段具有转录抑制功能的蛋白基序， 其氨基酸序列如 Seq ID No.2 所示， 或该序列经替换、 缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的 氨基酸序列， 0007 O。
9、s01g64730 为水稻转录因子 Os01g64730， 其氨基酸序列如 Seq ID No.1 所示， 或 该序列经替换、 缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。 0008 优选地， 前述融合蛋白为 Os01g64730-Linker-EAR。 0009 本发明还提供编码所述融合蛋白的基因， 以及在严格条件下， 可与该基因的核苷 酸序列杂交的核苷酸序列 ； 其中， 所述严格条件为65， 在0.1SSPE或0.1SSC、 0.1%SDS 的溶液中杂交并洗膜。 0010 本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的载体。 所述载体为任一种可引导外 源基因在宿主中表达的载体。 优。
10、选地， 所述载体为植物双元表达载体 （例如， pCAMBIA1301） 。 在将本发明编码所述融合蛋白的基因构建到植物表达载体中时， 可在其转录起始核苷酸前 说 明 书 CN 103265634 B 3 2/4 页 4 添加任一种强启动子 （例如， 玉米强启动子 Ubiquitin） 或诱导型启动子。此外， 在将本发明 编码所述融合蛋白的基因构建到植物表达载体中时， 还可以使用增强子， 且这些增强子区 域必须与编码序列的阅读框相同， 以确保整条序列的翻译。 0011 本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的转基因细胞系。 0012 本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的工程菌。 0013 本。
11、发明还提供编码所述融合蛋白的基因在使水稻抽穗提前、 缩短生育期中的应 用。 0014 本发明进一步提供水稻转录因子 Os01g64730 基因的应用， 其是将水稻转录因子 Os01g64730基因的CDS序列 （完整翻译区） 构建到转录因子抑制基序EAR的上游， 转化水稻， 筛选并最终获得转基因水稻。 0015 前述的应用， 其是将水稻转录因子 Os01g64730 基因的 CDS 序列通过 Gateway 系统 构建到转录因子抑制基序 EAR 的上游， 转化水稻 （如水稻品种 kitaake ） ， 从而使转基因水 稻的抽穗期提前、 缩短生育期。其中， 水稻转录因子 Os01g64730 基。
12、因的 CDS 序列如 Seq ID No.3 所示， 转录因子抑制基序 EAR 的核苷酸序列如 Seq ID No.4 所示。 0016 携带有编码所述融合蛋白的基因的表达载体可通过使用 Ti 质粒、 植物 病毒载体、 直接 DNA 转化、 微注射、 电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中 （Weissbach,1998,Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463;Geiserson and Corey， 1998， Plant Molecular Biology， 2nd Edition）。
13、 。 0017 本发明首次利用转录因子抑制基序 EAR 与水稻转录因子 Os01g64730 基因融合构 建得到组成型转录因子， 并转化到农作物， 如水稻中， 从而使转基因水稻的抽穗期提前、 缩 短生育期。 对于详细阐明水稻抽穗调控的分子机理， 具有重要的理论价值， 并且可以通过转 基因手段， 缩短水稻生育期， 改善水稻对不同生态区的适应能力， 因此在生产中同样具有重 要意义。 附图说明 0018 图 1 为本发明实施例 1 中 cEAR-bar-asRED 载体图谱。 0019 图 2 为本发明实施例 1 中 ubi:Os01g64730-EAR 载体图谱。 0020 图 3 为本发明实施例。
14、 3 中实时荧光定量 PCR 检测转基因阳性水稻株系的结果 ； 其 中， WT 为野生型水稻 kitaake ， E17-1、 E17-2 和 E17-3 分别为 Os01g64730-EAR 转基因水 稻的 3 个株系。 0021 图 4 为本发明实施例 4 中 Os01g64730-EAR 转基因水稻株系的表型分析结果 ； 其 中， WT 为野生型水稻 kitaake ， E17-1、 E17-2 和 E17-3 分别为 Os01g64730-EAR 转基因水 稻的 3 个株系。 0022 图 5 为本发明实施例 4 中 Os01g64730-EAR 转基因水稻株系抽穗天数 ； 其中， W。
15、T 为 野生型水稻 kitaake ， E17-1、 E17-2 和 E17-3 分别为 Os01g64730-EAR 转基因水稻的 3 个 株系。 具体实施方式 0023 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 说 明 书 CN 103265634 B 4 3/4 页 5 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用原料均为市售商品。 0024 实施例 1 水稻转录因子 Os01g64730 基因的获得及植物表达载体的构建 0025 登录 http:/rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_loc。
16、us.shtml 网 站， 找到水稻转录因子 Os01g64730 基因， 根据其序列设计 PCR 扩增引物 ： 0026 Os01g64730-F ： 5 -CAAAAAAGCAGGCTTCATGATGGCGTCGAGGGTG-3 0027 Os01g64730-R:5 -CAAGAAAGCTGGGTCCCACTCCATCGAGTTTGTTCTTC-3 0028 以水稻品种 日本晴叶片为材料， TRIzol 法提取总 RNA， 反转录得 cDNA， 反应步骤如下 ：（1）在冰上向不含核酸酶的 PCR 反应管中依次加入下列物质 ： 总 RNA 6l(0.1ng-5g)， Oligo(dT)18。
17、 引物 1l， 不含核酸酶的 ddH2O 5l， 置于 PCR 仪中 65 反应 5min ； (2) 然后再加入下列物质 ： 5 反应缓冲液 4l， RNase 抑制剂 1l， 10mM dNTP 2l， M-MlV 反转录酶 1l， 轻轻混匀， 在 PCR 仪中 45反应 60min ；（3） PCR 仪中， 70 5min， 终止反应。以总 cDNA 为模板， 进行 PCR 扩增， 扩增体系为 ： 反应缓冲液 25l， dNTP 4l， ddH2O 17.5l， Taq DNA 聚合酶 0.5l， 反应程序为热启动 98 10s， 57 5s， 72 1min， 30 个循环后， 72延。
18、伸 10min， 最后 25反应结束。 0029 获得水稻转录因子 Os01g64730 基因的 CDS 序列， 其核苷酸序列如 Seq ID No.3 所示。按照 PrimeSTAR 聚合酶扩增体系和反应程序进行 PCR。根据 Gateway 克隆技术的 要求， 此过程中包含两轮 PCR， 第一轮 PCR 的引物采用添加部分 adaptor attB 接头的引 物， 而第二轮的模板用第一轮的 PCR 产物， 并且引物采用完整的 adaptor attB 引物。将 PCR 产物克隆到 pDONR 克隆载体上， 经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。通过 LR 反应将 Os01g64730 基。
19、因构建到植物表达载体 cEAR-bar-asRED（图 1）上， 获得载体 ubi:Os01g64730-EAR（图 2， 载体全序列如 Seq ID No.5 所示） 。 0030 其 中，植 物 表 达 载 体 cEAR-bar-asRED 的 构 建 过 程 为 ： 以 双 元 表 达 载 体 pCAMBIA1300 左 右 边 界 包 含 的 序 列 为 骨 架 序 列，通 过 体 外 重 组，将 ubi promoter-Gateway-EAR 表达单元、 35S promoter-asRED 表达单元和 35S promoter-bar 表 达单元与之融合构建得到， 载体 cEAR。
20、-bar-asRED 的全序列如 Seq ID No.6 所示。 0031 实施例 2 转基因水稻植株的获得 0032 取水稻 kitaake 成熟种子， 人工或机械脱壳， 挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒 之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好， 生长力好的水稻愈伤组织为受体 材料， 采用农杆菌介导法将ubi:Os01g64730-EAR转入水稻愈伤组织中， 用含有100M的乙 酰丁香酮和OD=0.7的农杆菌的AAM转化液进行转化， 将转化液浸泡过的愈伤组织置于共培 养基上进行共培养， 25暗培养 3d 后置于筛选培养基上培养约 30d， 每 10d 继代 1 次。然后 将筛出的抗性。
21、愈伤转移到分化培养基上分化约 20d， 每 10d 继代 1 次。将分化出绿色小苗 的抗性愈伤转移到生根培养基上生根， 待约 7d 长出发达根系后炼苗， 并计算转化所获转基 因苗数。炼苗 7d 后转移至大田生长。用 Basta 筛选转基因水稻， 长出 4 片幼叶后开始喷洒 Basta(1:1000， v:v)， 隔 1 天喷 1 次， 共喷洒 3 次。共获得转基因水稻 42 株。 0033 其中， 诱导培养基配方为 ： N6 大量 +B5 微量 +NB 有机 + 铁盐 + 铜钴母液 +2.5mg/ L2,4D+0.6g/L 酸水解酪蛋白 +2.878g/L 脯氨酸 +0.5g/L 谷氨酰胺 +。
22、30g/L 蔗糖， 以水配制， 调 pH 至 5.8 5.9 后加入植物凝胶 4g/L。 0034 共培养基配方为 ： N6 大量 +B5 微量 +NB 有机 + 铁盐 +2.5mg/L2,4D+0.5g/L 谷氨酰 说 明 书 CN 103265634 B 5 4/4 页 6 胺 +0.6g/L 酸水解酪蛋白 +10g/L 葡萄糖 +30g/L 蔗糖， 以水配制， 调 pH 至 5.2 后加入植物 凝胶 4g/L。灭菌后， 50左右加入 AS（乙酰丁香酮） 100 200g/mL。 0035 筛选培养基配方为 ： N6 大量 +B5 微量 +NB 有机 + 铁盐 + 铜钴母液 +2.5mg/。
23、 L2,4D+0.6g/L 酸水解酪蛋白 +2.878g/L 脯氨酸 +0.5g/L 谷氨酰胺 +30g/L 蔗糖， 以水配制， 调 pH 至 5.8 5.9 后加入植物凝胶 4g/L。灭菌后加入 35mg/L 潮霉素 （购自上海纽津生物 技术有限公司） 或 5mg/L Bialaphos（购自北京拜尔迪生物技术公司） 。 0036 分化培养基配方为 ： MS 无机 +MS-B5 微量 +MS 有机 + 铁盐 +MS- 铜钴母液 +0.05mg/ L NAA+2.0mg/L Kinetin（激动素） +30g/L 山梨醇 +2g/L 水解酪蛋白 +30g/L 蔗糖， 以水配 制， 调 pH 至。
24、 5.8 5.9 后加入植物凝胶 4g/L。 0037 实施例 3 实时荧光定量 PCR 检测转基因水稻中 Os01g64730-EAR 的表达 0038 为了检测 Os01g64730-EAR 在 T2 代转基因水稻中的过表达情况， 利用实时荧光定 量 PCR 对其在转录水平上进行鉴定， 经过 PCR 定量检测， 结果表明转基因植株 Os01g64730 的表达量明显高于野生型 （图 3） 。 0039 具体的实时荧光定量 PCR 实验流程如下 ： 0040 取适量转基因材料及野生型水稻叶片， 按照实施例 1 中的方法提取 RNA 并反转 录为 cDNA。以此为模板进行 PCR 反应， 反应。
25、程序为 ： 预变性 95 30s ； 95变性 5s， 60 退火延伸 20s， 40 个循环。融解曲线的标准程序 ： 95， 15 秒 ； 60， 1 分钟 ； 95， 15 秒 ； 0.5 / 循环。按照公式 ： 相对表达量 （RQ） =2- CT的方法计算相对表达量。反应体系为 ： SYBR Premix Ex Taq(2)10.0l， PCR 正向引物 （10M） 0.4l， PCR 反向引物 （10M） ， 0.4l， ROX 参比染料 （ROX Reference Dye， 50） 0.4l， cDNA 模板 1.0l， ddH2O（灭菌 蒸馏水） 7.8l， 总体积为 20.0l。
26、。 0041 实时荧光定量 PCR 所用引物序列为 ： bzip17-QF:5 -GGAGGAGAACGCCAAGATG T-3 ； bzip17-QR:5 -GATCTCGTGCTGACGTTTTCC-3。 0042 实施例 4 转基因水稻表型分析 0043 与野生型水稻 kitaake 相比， Os01g64730-EAR 转基因水稻株系 （E17-1、 E17-2 和 E17-3） 的抽穗期明显提前， 野生型虽未抽穗， 但转基因株系已基本完成抽穗 （图 4 和图 5） 。 0044 以上提供的实施例是将水稻转录因子 Os01g64730 基因的 CDS 序列通过 Gateway 系统构建。
27、到转录因子抑制基序 EAR 的上游， 转化水稻品种 kitaake ， 从而使转基因水稻 的抽穗期提前、 缩短生育期。同样地， 将水稻转录因子 Os01g64730 基因的 CDS 序列通过 Gateway 系统构建到转录因子抑制基序 EAR 的下游， 转化水稻品种， 也能够达到提前转基因 水稻的抽穗期、 缩短生育期的效果。 0045 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN。
28、 103265634 B 6 1/13 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 103265634 B 7 2/13 页 8 0003 序 列 表 CN 103265634 B 8 3/13 页 9 0004 序 列 表 CN 103265634 B 9 4/13 页 10 0005 序 列 表 CN 103265634 B 10 5/13 页 11 0006 序 列 表 CN 103265634 B 11 6/13 页 12 0007 序 列 表 CN 103265634 B 12 7/13 页 13 0008 序 列 表 CN 103265634 B 13 8/13 页 14 000。
29、9 序 列 表 CN 103265634 B 14 9/13 页 15 0010 序 列 表 CN 103265634 B 15 10/13 页 16 0011 序 列 表 CN 103265634 B 16 11/13 页 17 0012 序 列 表 CN 103265634 B 17 12/13 页 18 0013 序 列 表 CN 103265634 B 18 13/13 页 19 序 列 表 CN 103265634 B 19 1/2 页 20 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103265634 B 20 2/2 页 21 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103265634 B 21 。