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1、(10)授权公告号 CN 101603093 B (45)授权公告日 2012.05.09 CN 101603093 B *CN101603093B* (21)申请号 200910158234.8 (22)申请日 2009.07.23 C12Q 1/68(2006.01) C12R 1/90(2006.01) (73)专利权人 中国农业科学院蜜蜂研究所 地址 100093 北京市海淀区香山北沟 1 号 (72)发明人 李继莲 彭文君 吴杰 陈文锋 安建东 黄家兴 罗术东 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王加岭 CN 101313667 A,2008.1。
2、2.03, 全文 . 李继莲等.熊蜂 （Bombus lucorum)微孢子虫 的初步研究 .蜂蜜杂志 .2004,( 第 1 期 ),3-4. 李继莲等 . 熊蜂微孢子虫对熊蜂的危害 . 蜜 蜂杂志 .2007,( 第 9 期 ),5-8. (54) 发明名称 感染熊蜂的微孢子虫的分子检测技术 (57) 摘要 感染熊蜂的微孢子虫的分子检测技术。属于 动物检验检疫技术领域， 具体地说涉及一种准确、 快速的检测进出口熊蜂上的微孢子虫的分子检 验技术领域。本发明的特征是 ： 采用 Chelex-100 法提取 DNA， 用特异性引物进行一次 PCR， 扩增出 540bp的微孢子虫SSUrRNA基因。
3、片段， 然后用限制 性内切酶 Afa I 对 PCR 产物进行酶切， 利用 2.0 琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物， 直接根据酶切产 物片断的长度， 即可检测出寄生在熊蜂身上的微 孢子虫的种类， 本发明可应用于国内外进出口熊 蜂的病原物微孢子虫的检验检疫。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 黄丽君 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 3 页 CN 101603093 B1/1 页 2 1. 一种检验检疫熊蜂的病原微孢子虫的分子检测方法， 其特征在于 ： 1) 采用 Chelex-100 法 提 取 DNA ； 2) 用 。
4、特 异 引 物 SSUrRNA-fl ： 5 -CACCAGGTTGATTCTGCCT-3和 SSUrRNA-r1b ： 5 -TGTTCGTCCAGTCAGGGTCGTCA-3 PCR 扩 增 微 孢 子 虫 540bp 的 SSUrRNA 基因片段 ； 3) 用限制性内切酶 Afa I 酶切 PCR 产物， 利用 2.0琼脂糖凝胶电泳检测酶 切产物， 根据酶切产物片断的长度， 判断微孢子虫种类， 所述微孢子虫为中蜂微孢子虫 (Nosema ceranae)、 熊蜂微孢子虫 (Nosema bombi) 和 / 或鳞翅目卷蛾科微孢子虫 (Nosema thomsoni)。 权 利 要 求 书。
5、 CN 101603093 B1/3 页 3 感染熊蜂的微孢子虫的分子检测技术 技术领域 0001 本发明涉及一种动物检验检疫技术领域， 特别是涉及一种准确、 快速的检验进出 口熊蜂上的微孢子虫分子检验技术领域。 背景技术 0002 微孢子虫是普遍分布于自然界， 种群数量庞大的专性细胞内寄生的原虫类寄生 物， 有极为广泛的寄主， 包括脊椎动物与无脊椎动物， 是经济昆虫、 鱼类、 兔类、 产毛动物、 啮 齿类及灵长类的致病病原。熊蜂是一类重要的经济授粉昆虫， 也受到微孢子虫的危害， 因 此， 微孢子虫成为熊蜂进出口检验检疫的重要病原物之一。 0003 熊蜂微孢子虫检验通常采用镜检法和常规的分子检。
6、验法。 镜检法是将被检样品研 磨后， 滴加蒸馏水， 取 1-2 滴在载玻片上， 于光学显微镜下观察， 极易漏检。常规分子检验法 是采用酚氯仿提取 DNA， 设计特异性引物进行 PCR 扩增反应， 克隆测序。这种方法比镜检法 更灵敏准确， 不易漏检， 但是酚氯仿提取 DNA 需要 5 个小时， 操作步骤多， 易污染， 所用有机 试剂大部分对人有害， 而且克隆测序耗时、 费用较高。 0004 Klee 等 (Klee J.， Besana A.M.， Genersch E.， et al.Widespread dispersal of themicrosporidian Nosema cerana。
7、e， an emergent pathogen of western honey bee， Apismellifera.J.Invertebr.Pathol.， 2007， 96(1) ： 1 10.) 采 用 聚 合 酶 链 式 反 应 - 限制性片段长度多态 (PCR-RFLP) 分析技术来鉴定微孢子虫种类， 用 Nde I 和 Msp I、 Pac I 三种限制性内切酶对意大利蜜蜂 (N.apis)、 中华蜜蜂 (N.ceranae) 和熊蜂微孢子虫 (N.bombi) 的部分 SSUrRNA 基因片段 ( 引物 ： SSU-res-f1 ： 5 -GCCTGACGTAGACGCTATT。
8、C-3 ， SSU-res-r1 ： 5 -GTATTACCGCGGCTGCTGG-3 ) 进行酶切， 用 Nde I、 Msp I 酶切 N.apis， Msp I 酶切 N.bombi， Pac I、 Msp I 酶切 N.ceranae， 利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物， 根据产 物片断的长度来鉴定种类。 但是此方法需用三种酶， 费用高， 而且双酶切时其中一种酶的酶 切效率会降低， 造成部分酶切不完全。 其次， 用此方法不能鉴定出感染熊蜂的另外一种微孢 子虫 N.thomsoni。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种准确、 灵敏、 快速的检验检疫进出口熊蜂 上的微孢子。
9、虫的方法， 而且费用较适中， 使用的大部分检测试剂对人无害。 0006 为了解决上述技术问题， 本发明在比较了感染熊蜂的三种微孢子虫 N.ceranae、 N.bombi、 N.thomsoni 的 SSUrRNA 基因序列后， 建立了一种基于单一限制性内切酶分析三种 微孢子虫 SSUrRNA 基因片段的快速检验鉴定感染熊蜂的微孢子虫种类的方法。 0007 首 先 采 用 Chelex-100 法 提 取 DNA，用 特 异 性 引 物 (SSUrRNA-f1 ： 5 -CACCAGGTTGATTCTGCCT-3 ； SSUrRNA-r1b ： 5 -TGTTCGTCCAGTCAGGGTCGT。
10、CA-3 ) 扩 增 出 540bp 的微孢子虫 SSUrRNA 基因片段， 然后用限制性内切酶 Afa I 对 PCR 产物进行酶切， 利 用 2.0琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物， 直接根据酶切产物片断的长度和条带数来检验鉴 说 明 书 CN 101603093 B2/3 页 4 定种类。 0008 按照本发明， AfaI 对 PCR 产物酶切的结果如下 ： 0009 N.ceranae 在 500bp、 50bp 附近产生两条带。 0010 N.bombi 在 350bp、 150bp、 50bp 附近产生三条带。 0011 N.thomsoni 在 350bp、 100bp、 50bp 附。
11、近产生三条带。 0012 N.ceranae 和 N.bombi 在 500bp、 350bp、 150bp、 50bp 附近产生四条带。 0013 N.ceranae 和 N.thomsoni 在 500bp、 350bp、 100bp、 50bp 附近产生四条带。 0014 N.bombi 和 N.thomsoni 在 350bp、 150bp、 100bp、 50bp 附近产生四条带。 0015 本发明技术使用 Chelex-100 法提取 DNA 简便快速， 只需 30min 左右， 并且提取过 程始终在同一试管中进行， 减少DNA的损失， 避免污染， 而且Chelex-100是一种以。
12、亚氨二乙 酸为吸附因子的苯乙烯和苯二乙烯共聚物， 对人无害。 只用一种限制性内切酶酶切， 琼脂糖 凝胶电泳检测酶切产物， 直接根据产物片断的长度和条带数就可以检验出熊蜂是否感染了 微孢子虫， 感染了几种微孢子虫， 并可以鉴定出微孢子虫的种类， 费用低， 简单， 准确， 快速。 附图说明 0016 通过以下实例结合附图所作的详细描述， 可以更清楚地理解本发明的目的、 优点 及特征。实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。 0017 图 1 微孢子虫 SSUrRNA 基因片段的 Afa I 酶切位点 ： 不同微孢子虫用引物 SSUrRNA-f1/SSUrRNA-r1b 扩增出 540bp 的。
13、 SSUrRNA 基因片段， 扩增产物的 Afa I 酶切位点 分析。其中括号内为微孢子虫 SSUrRNA 基因的 GenBank 登录号。 0018 图 2 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳条带 ： 不同微孢子虫用引物 SSUrRNA-f1/ SSUrRNA-r1b 扩增产物的 2琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中 M ： DNA Marker ； N ： 阴性对 照 ( 未感染微孢子虫的熊蜂基因组 DNA) ； 泳道 1 ： N.ceranae ； 泳道 2 ： N.bombi ； 泳道 3 ： N.thomsoni ； 泳道 4 ： N.ceranae 和 N.bombi ； 泳道 5 ： N.c。
14、eranae 和 N.thomsoni ； 泳道 6 ： N.bombi 和 N.thomsoni。 0019 图 3 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳条带 ： 不同微孢子虫用引物 SSUrRNA-f1/ SSUrRNA-r1b 扩增的产物的 Afa I 酶切产物的 2琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中 M ： DNAMarker ； N ： 阴性对照 ( 未感染微孢子虫的熊蜂基因组 DNA) ； 泳道 1-6 表示同图 3 ； 泳道 7 ： PCR 产物。 0020 图 4 不同熊蜂寄主来源的微孢子虫 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳条带 ： 不同熊蜂 寄主来源的微孢子虫用引物 SSUrRNA-f1/SSUr。
15、RNA-r1b 扩增产物的 2琼脂糖凝胶电泳 检测结果。其中 M ： DNA Marker ； N ： 阴性对照 ( 未感染微孢子虫的熊蜂基因组 DNA) ； 泳道 1 ： Bombusfriseanus ； 泳道 2 ： Bombus ladakhensis ； 泳道 3-7 ： Bombus terrestris ； 泳道 8-10 ： Bombus festivus。 0021 图 5 不同熊蜂寄主来源的微孢子虫酶切产物的琼脂糖凝胶电泳条带 ： 不同熊蜂寄 主来源的微孢子虫用引物SSUrRNA-f1/SSUrRNA-r1b扩增产物经Afa I酶切的2琼脂糖凝 胶电泳检测结果。M、 N、 。
16、泳道 1-10 表示同图 4， 11 ： PCR 产物。 具体实施方式 说 明 书 CN 101603093 B3/3 页 5 0022 实施例 1 0023 三种微孢子虫检验及种类鉴定 0024 以 纯 化 的 N.ceranae、 N.bombi、 N.thomsoni 三 种 微 孢 子 虫 及 两 两 混 合 为 样 本， 采 用 本 发 明 的 Chelex-100 法 分 别 提 取 DNA， 用 特 异 性 引 物 (SSUrRNA-f1 ： 5 -CACCAGGTTGATTCTGCCT-3 ， SSUrRNA-r1b ： 5 -TGTTCGTCCAGTCAGGGTCGTCA-3。
17、 ) 进行扩 增， 扩增产物再经 Afa I 酶切， 酶切产物用 2琼脂糖凝胶电泳检测结果。 0025 PCR 反应体系 ： 0026 25l 反 应 体 系 中 加 入 5l 的 5GoTaq Buffer、 1.5 l 的 MgCl2(25mM) (Promega)， 2.0l 的 dNTPs(200M)(TaKaRa)， SSUrRNA-f1、 SSUrRNA-r1b 引物各 1l(10M)， 0.625U/ 管的 GoTaq DNA 聚合酶， 5l 的模板 DNA( 约 5ng/l)， 9.375l 的 ddH2O。95预变性 4min 后进入循环 ： 95变性 1min， 64退火 。
18、1min， 72延伸 1min， 40 个 循环， 最后72延伸10min。 取5l扩增产物经2琼脂糖凝胶电泳检测， 扩增结果见说明 书附图中的图 2PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳条带。 0027 PCR 产物酶切反应体系 ： 0028 在 20l 反应体系中加入 1l Afa I(TaKaRa)， 2l 10T Buffer， 2l 0.1 BSA， 15l 的 PCR 产物， 37酶切 3h ： 0029 酶切结果与本发明内容中所述的酶切结果一致， 见说明书附图中的图 3 酶切 产物的琼脂糖凝胶电泳条带。表明使用本发明可用于检验并鉴定 N.ceranae、 N.bombi、 N.thomso。
19、ni 三种微孢子虫。 0030 实施例 2 0031 国内外熊蜂的微孢子虫的检验及种类鉴定 0032 采用本发明方法， 对来自瑞士的 5 只熊蜂 Bombus terrestris 和国内的 1 只熊蜂 Bombusladakhensis、 3只Bombus festivus、 1只Bombus friseanus进行微孢子虫的检验及 微孢子虫的种类鉴定。 0033 PCR 反应体系及 PCR 产物酶切反应体系同实例 1， PCR 扩增产物和酶切产物均采用 2琼脂糖凝胶电泳检测， 见说明书附图中的图4不同熊蜂寄主来源的微孢子虫PCR产物的 琼脂糖凝胶电泳条带。 0034 酶切产物经 2琼脂糖凝。
20、胶电泳检测发现来自瑞士的 5 只熊蜂和国内的 5 只熊 蜂都感染了微孢子虫， 各自酶切产物电泳产生的条带如下 ： 1 ： 500bp、 50bp 附近产生两条 带 ； 2 ： 350bp、 100bp、 50bp 附近产生三条带 ； 3-9 ： 350bp、 150bp、 50bp 附近产生三条带 ； 10 ： 500bp、 50bp 附近产生两条带。见说明书附图中的图 5 不同熊蜂寄主来源的微孢子虫酶切 产物的琼脂糖凝胶电泳条带。据此判断微孢子虫的种类为 ： 1 ： N.ceranae ； 2 ： N.thomsoni ； 3-9 ： N.bombi ； 10 ： N.ceranae。 说 明 书 CN 101603093 B1/3 页 6 图 1 微孢子虫 SSUrRNA 基因片段的 AfaI 酶切位点 图 2 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳条带 说 明 书 附 图 CN 101603093 B2/3 页 7 图 3 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳条带 图 4 不同熊蜂寄主来源的微孢子虫 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳条带 说 明 书 附 图 CN 101603093 B3/3 页 8 图 5 不同熊蜂寄主来源的微孢子虫 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳条带 说 明 书 附 图 。