本发明涉及粘膜(例如口服或鼻腔)疫苗的开发、组合物和制备。 更特别地，本发明涉及一种用于将抗原输送至和通过粘膜表面的蛋白 质复合物，以及所述复合物在宿主细胞例如植物中的制备。
口服接种被当作是注射疫苗的一种吸引人的替代方式，因为一般 而言口服疫苗易于应用并且相对便宜和安全。更重要的是，它可以诱 发粘膜水平的保护，也就是在许多病原体进入的部位诱发保护。在粘 膜部位施用疫苗，例如通过口服或鼻腔输送，甚至可能是制备抗某些 目前没有可利用的疫苗的病原体(例如呼吸道合胞病毒，甚至可能是 HIE)的先决条件。此外，口服接种使得可以通过食物或饮用水进行 大量的接种。
但是，口服接种通常表现出不是非常有效。免疫应答持续时间短， 且典型地需要大剂量的抗原引发所需要效果，甚至当使用活的微生物 时也是如此。这部分归因于抗原的低效率摄入(Lavell et al.Adv Drug Delivery Rev 1995；18：5-22)。结果，已经研究了各种用于经粘膜途径 有效输送抗原的策略(参见例如O′Hagan，J Pharm Pharmacol(1997)49： 1-10；Husband，Vaccine(1193)11：107-112)。被成功地输送通过覆盖在 粘膜管上的上皮细胞屏障的抗原刺激潜在的与粘膜相关的淋巴组织 (MALT)的感应部位。在MALT中被致敏的抗原特异性淋巴细胞移 动通过循环系统停留在远处的粘膜部位。因此，粘膜免疫可以提供局 部及全身保护。
开发粘膜疫苗的一种策略是应用细菌肠毒素，例如来自霍乱弧菌 (Vibrio cholera)的霍乱毒素(CT)和相关的大肠杆菌热不稳定性肠 毒素(LT)，当其经粘膜输送时具有高免疫原性且其能够作为载体分 子和加强对非相关抗原的应答的佐剂，后者当作为全毒素而使用时尤 其如此。
口服使用时，产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli) 的热不稳定性肠毒素(LT)和来自霍乱弧菌的相关霍乱毒素(CT) 是非常有效的免疫原和粘膜佐剂(参见Spangler，1992和Williams et al.，1999)。两种毒素都包含A亚单位和相同的B亚单位的五聚环。A 亚单位是该嵌合分子的有毒部分，并引起Gsα激活的腺苷酸环化酶的 ADP-核糖基化导致环状AMP水平的升高。这最终导致水分损失在肠 腔中，特征是水泻。包含五聚B亚单位的强非共价结合的复合物的主 要功能是介导受体相互作用，这导致有毒的A亚单位的内在化和摄 入。B亚单位的环的主要受体是单唾液酰神经节苷脂 GM1[Gal(β1-3)GalNAcβ(1-4)(NeuAc(α2-3))Galβ(1-4)Glc(β1-1)神经酰 胺]，其是哺乳动物细胞包括小肠的细胞表面无所不在的一种鞘糖脂 (Holmgren，1973；Holmgren et al.，1973，1975)。这一独特的特征使得 B亚单位对于触发与佐剂活性相关的关键免疫调节活动是至关重要 的。它也将该B亚单位变成有效的所谓的粘膜载体分子。粘膜载体分 子是一种这样的分子，其例如通过受体与定位在粘膜(例如小肠的肠 上皮的粘膜)的表面的免疫活性细胞相互作用。
在与多种抗原的翻译融合中，B亚单位LT(LTB)和(CTB)都 已经被成功地用作粘膜载体分子，以通过受体介导的摄入穿梭通过肠 粘膜上皮细胞(例如Dertzbaugh and Elson，1993；Jagusztyn-Krynica et al.，1993)。据推测，抗原与载体分子的融合增强了输送到MALT感 应部位的抗原的量以及随后对抗原特异性B-和T-淋巴细胞的刺激。 抗原也可以被化学连接到LTB上(O’Dowd et al.Vaccine(1999) 17：1442-1453；Green et al.Vaccine(1996)14：949-958)。此外，当和抗 原一起协同施用时，LTB和CTB在口服摄入后也都提高了免疫应答 (Bowen et al.，1994；Wilson et al.，1993)。
Rigano et al.(2003，Vaccine 21：809-811)公开了LTB-ESAT6抗原 融合复合物在转基因拟南芥中的制备。该融合蛋白的表达产生了同型 -五聚体(LTB-ESAT6)5复合物。ESAT6是一种非常小的抗原，相应地 当其与LTB融合时不影响LTB五聚体的形成。Kim et al.(2003；Plant Cell Reports Vol.21，no.9，pp.884-890)报道了CTB-NSP175融合蛋白 质在马铃薯中的表达，这使得产生了同型五聚体复合物。尽管在某些 情况下已经成功地进行了抗原或表位与LTB或CTB的遗传融合，异 种表位与B亚单位的翻译融合表现出可以影响LTB或CTB融合蛋白 质的结构、分泌、GM1-结合和免疫原性，例如Sandkvist et al.(J Bacteriol 1987 169：4570)、Schodel et al.(Gene 1991；99：255)和 Dertzbaugh et al.(Infect Immun 1993；61：384)所报道的那样。
显然，对于能够附着到LTB或CTB上的抗原的大小和类型是有 限制的，以使得保留了五聚化以及GM1结合。对于基于LTB或CTB 的疫苗的开发，这一限制尤其相关，因为绝大多数功能性疫苗是由大 结构蛋白质组成。此外，许多保护性抗原(病毒抗原、细菌抗原等) 是由多聚体复合物组成，该复合物是同聚多聚体或异聚多聚体，且当 等量输送时仅诱导保护性免疫应答。例如，基于经典猪瘟(CSFV) E2糖蛋白的疫苗含有CSFV-E2同型二聚体。不同保护性抗原的多聚 特性大大地减少了利用这些类型的抗原的传统遗传融合而将LTB和/ 或CTB用作载体分子，因为这样形成了5个相同的融合蛋白质的复 合物。
对于商业化和市场化导入，需要大规模制备融合蛋白质，且产物 必须是安全的和几乎纯的。在细菌和酵母中基于LTB和CTB的融合 蛋白质以及抗原制备这种疫苗需要大规模发酵技术和严格的纯化方 案以获得足够量的重组蛋白质用于口服输送。转基因植物，尤其是可 食用的植物部分，是用于口服输送的疫苗的安全的表达系统(参见 Langridge，2000；Mason and Arntzen，1995；Sala，2003)。最近，在不同 的植物种(包括烟草、马铃薯和玉米)中成功地制备了LTB和CTB， (Arakawa et al.，1997；Haq et al.，1995；Hein et al.，1995；Lauterslager et al.，2001；Streatfield et al.，2001)。令人惊讶地，与大肠杆菌和霍乱 弧菌相似，植物也显示出能够制备B亚单位的五聚体。
几个团队已经报道了通过饲喂蓄积了LTB或CTB的龙舌兰、马 铃薯块茎或玉米对小鼠进行口服接种导致了血清IgG和分泌型sIgA 应答(Arakawa et al.，1998；Haq et al.，1995；Lauterslager et al.，2001； Mason et al.，1998；Streatfield et al.，2001)。WO 991825A描述了用与植 物中产生的SEKDEL序列融合的CTB亚单位对小鼠进行口服接种。
给人类志愿者饲喂50-100g的量的蓄积了LTB的转基因块茎进行 的临床前试验也导致了特异性的血清IgG和分泌型sIgA应答(Tacket et al.，1998)。相应地，转基因宿主细胞系统在本质上对于粘膜载体分 子(例如LTB或CTB融合蛋白质)的(大规模)制备是有利的。然 而，已经证明了随着融合蛋白质的大小和复杂性的增加，融合蛋白的 表达水平显著降低。例如，与CSFV-E2糖蛋白融合的编码LTB的基 因构建体(大约35kDa和以约70kDa的二聚体给予保护)在马铃薯 块茎中的表达低于编码约15kDa的LTB亚单位的基因在马铃薯块茎 中的表达超过100倍(Lauterslager，2002；PhD thesis University of Utrecht)。可能，大的LTB-或CTB-融合蛋白质的低表达水平从根本 上反映出大的五聚体蛋白质复合物的不稳定性，因为常常观察到单体 较组合的多聚体结构更倾于(酶)降解。这与Arakawa et al.(1999； Transgenics，Harwood Academic Publishers，Basel，Vol.3，no.l，pp.51-60) 所报道的CTB-GAD融合蛋白质在马铃薯中蓄积的结果相一致。GAD (人谷氨酸脱羧酶)是一种65kDa的自身抗原。CTB-GAD的定量揭 示其表达水平仅为总可溶解蛋白质的0.001％，这清楚地指出了当尝 试蓄积显著水平的这种高分子量复合物时可能遇到的问题。然而，当 在一段延长的时期内用大量新鲜的转基因马铃薯材料饲喂小鼠时，低 量的活性同型五聚体复合物显示出具有免疫原性。
因此，本发明的一个目的是提供功能性载体复合物，其能够将相 对较大的抗原输送到感兴趣的部位而不损害该复合物的表达水平，例 如在重组宿主细胞中的表达水平。
本发明提出这样一种观点，即如果不是全部而仅是其中一些亚单 位与抗原或其它感兴趣的分子融合，则多亚单位载体分子的装配、功 能性和稳定性可被增强。本发明提供了一种蛋白质复合物，其包含至 少两个(优选相同的)亚单位，其中至少一个亚单位是未改变的，至 少一个亚单位与第一个感兴趣的分子融合，且其中该蛋白质复合物能 够与细胞表面受体结合。
在一个优选的实施方式中，所述蛋白质复合物是一种载体分子， 其能够被用以携带或转运感兴趣的分子。例如，本发明的蛋白质复合 物是一种用于将感兴趣的分子输送到感兴趣的部位的载体复合物或 载体分子，例如输送至和/或通过粘膜表面。根据本发明，感兴趣的 分子可以包含多种不同种类的蛋白质或多肽或其片段(stretches)，利 用该复合物的载体特性可以将其释放在、分散在、转运至或保留在机 体的某一部位。尤其是指当尝试将其附着于所述载体的全部亚单位 时，将通过例如空间位阻影响载体分子的稳定的和功能性多聚体结构 的形成的融合或添加到亚单位上的部分。例如，所述融合到亚单位上 的感兴趣的分子的大小是亚单位自身大小的1/4、1/3、1/2、1、2、3 或甚至4倍。
本申请所用术语“未改变的”指没有与感兴趣的分子融合的亚单 位或单体。但是其不限于天然的亚单位或单体；例如是一种重组蛋白 质，其中在天然亚单位中进行了一个或多个氨基酸的缺失、取代或添 加。可以进行这样的改变以调节所述重组蛋白质在(真核)宿主细胞 中的稳定性和/或制备过程，例如表达或分泌。例如，未改变的亚单 位可以包含用于滞留在内质网(ER)上的具有信号肽的亚单位或C 末端的(SE)KDEL序列。术语“未改变的亚单位”实质上是指天然 的亚单位或其略经修饰的形式，其中所述修饰不影响多聚化。
WO9612801A公开了与SEKDEL序列融合的LTA亚单位和LTB 亚单位的协同表达，它们一起表达后形成CT全毒素蛋白质复合物。 这样的蛋白质复合物与本发明的蛋白质复合物截然不同，因为其不包 含本发明的与感兴趣的分子融合的亚单位。SEKDEL六肽不被认为是 一种感兴趣的分子。相反地，如上面所提及的那样，LTB-SEKDEL 亚单位被认为是一种“未改变的”亚单位。因此，根据本发明的术语， WO9612801A的复合物与本申请所提供的蛋白质复合物是截然不同 的，因为它仅包含有未改变的亚单位。
US 6,103,243记载了口服疫苗以及提高免疫原的摄入的方法，例 如通过使用粘膜载体复合物如LTB。通过化学联结或通过遗传融合， LTB亚单位具有感兴趣的抗原。这产生了同型五聚体复合物，其中所 有亚单位与一种类型的感兴趣的分子融合。因此，与本发明不同， US 6,103,243的复合物不包含至少一种未改变的亚单位和至少一种与 感兴趣的分子融合的亚单位。
在本发明的一个优选的实施方式中，蛋白质复合物包含至少两个 相同的亚单位，例如LTB亚单位，其中至少一个亚单位被改变，且 至少一个亚单位与感兴趣的分子融合。在本发明的一个方面，蛋白质 复合物包含至少两个(优选相同的)亚单位，其特征是至少一个亚单 位是未改变的且至少一个亚单位与第一个感兴趣的分子融合，其中所 述第一个感兴趣的分子可以与第二个感兴趣的分子结合起来形成感 兴趣的多聚体，其中该蛋白质复合物能够通过所述亚单位与细胞表面 受体相互作用。优选地，所述第一个分子通过分子间共价键与所述第 二个分子结合或相互作用，例如通过一个或多个二硫键。根据本发明 的感兴趣的多聚体例如是多聚体保护性抗原，例如同型二聚体或异型 二聚体抗原。已知的多聚体保护性抗原包括CSFV-E2同型二聚体、 病毒性出血性败血症病毒(VHSV-G)的三聚体糖蛋白G(Lorenzen，N.， Lorenzen，E.，Einer-Jensen，K.，Heppell，J.，Wu，T.，Davis，H.(1998) Protective immunity to VHS in rainbow trout(Oncorhynchus mykiss， Walbaum)following DNA vaccination.Fish & Shellfish Immunology 8：261-270；Lorenzen，N.，Olesen，N.J.(1997)Immunisation with viral antigens：viral haemorrhagic septicaemia.In：Fish Vaccinology.Gudding， R.，Lillehaug，A.，Midlyng，P.J.，Brown，F.(eds).Dev.Biol.Stand.Basel， Karger，vol.90，p201-209)and trimeric glycoprotein G of Rabies virus (RVG)and vesicular stomatitis virus(VSVG)；the homotetrameric phosphoprotein P of Sendai virus(SeVP))。
根据本发明，第二个感兴趣的分子可以与亚单位融合。例如，在 本发明的一个实施方式中，蛋白质复合物包含三个亚单位，其中两个 亚单位与相同的单体(例如CSFV-E2)融合；和一个未改变的亚单位。 希望亚单位彼此间很接近以使得被融合的单体可以相互作用并能够 形成同型多聚体，例如抗原性(例如CSFV-E2)同型二聚体。未改变 的亚单位的存在增强了该蛋白质复合物的多亚单位结构的稳定性，并 确保该复合物的构象被保持以使得其可以通过所述亚单位与其受体 相互作用。显然，至少三个亚单位的蛋白质复合物也有可能包含两个 和更多个与不同单体融合的亚单位和至少一个未改变的单体，使得被 融合的单体可以形成异多聚体。
当然，为了与第一个感兴趣的分子相互作用并形成感兴趣的多聚 体，第二个感兴趣的分子无需与亚单位融合。此外，根据本发明，有 时例如根据空间位阻来设计包含感兴趣的多聚体的蛋白质复合物是 有利的，其中所述感兴趣的多聚体由不完全融合到亚单位上的感兴趣 的多种分子组成。例如，全部融合到亚单位上的感兴趣的分子间相互 作用的程度达到通过它们所融合的单个亚单位的相对定位所确定的 某一范围。相应地，通常能够彼此相互作用的分子(即以它们天然的、 非融合的构象存在)当与亚单位融合时可以变得在空间上受到限制， 这导致分子间的相互作用减弱或者甚至完全丧失。因此，根据本发明 的蛋白质复合物可以包含由多种感兴趣的分子组成的感兴趣的多聚 体，所述感兴趣的分子能够例如通过二硫键形成多聚体结构。优选地， 包含至少一个未改变的亚单位和至少一个与抗原融合的亚单位的本 发明的蛋白质复合物通常显示出一个或多个(多聚)抗原可更好地折 叠成一个抗原性部分。如上述，一个、一些或全部感兴趣的分子与亚 单位融合。基于亚单位和感兴趣的多聚体的四级结构和对称性，本领 域技术人员将能够选择出融合对非融合分子的最佳数目以获得包含 具有最佳构象(例如最佳抗原特性)的感兴趣的多聚体的蛋白质复合 物。
在一个实施方式中，蛋白质复合物能够与存在于肠道上皮细胞上 的表面受体结合，例如与神经节苷酯分子如GM1结合。这种包含感 兴趣的分子的蛋白质复合物被优选用作粘膜载体分子。
在一个优选的实施方式中，本发明的蛋白质复合物基本上是基于 大肠杆菌的热不稳定性肠毒素(LT)或基于霍乱弧菌的霍乱毒素 (CT)，优选基于其B亚单位。本发明的复合物例如是由LT或CT 的5个B亚单位组成的环结构，其中至少一个亚单位是未改变的且至 少一个亚单位与感兴趣的分子融合。本发明的这种嵌合的或异型五聚 体环结构包含一个、两个、三个或四个未改变的LTB或CTB单体和 四个、三个、两个或一个L/CTB-融合蛋白质。在一个优选的实施方 式中，感兴趣的分子与亚单位融合使得其被定位于分子中受体结合区 的对侧，或至少不影响所述亚单位的受体结合特性。例如，对于基于 五聚体LTB-或CTB-结构的本发明的复合物而言，这意味着感兴趣的 分子优选与B亚单位的C末端融合(Sixma et al.1991 Nature 351； 371-377)。遵循本发明的这一策略，获得了保留了其构象完整性的嵌 合五聚体。由于LTB亚单位和CTB亚单位是同源的，它们可以被用 于形成由嵌合的LTB/CTB-五聚体组成的蛋白质复合物，其中至少一 个亚单位(假设是LTB或CTB)与感兴趣的分子融合且至少一个亚 单位是未改变的。与其中全部5个亚单位都与感兴趣的分子融合的同 型五聚体结构相比，本发明的基于LTB和/或CTB的嵌合蛋白质复合 物显示出与GM1受体的结合提高和表达水平增加。
在另一个实施方式中，本发明的蛋白质复合物是基于辣根过氧化 物酶(HRP)。本发明的复合物例如是一种由HRP的6个亚单位组成 的结构，其中至少一个亚单位是未改变的且至少一个亚单位与感兴趣 的分子融合。本发明的这种嵌合的或异型-六聚体结构分别包含一个、 两个、三个、四个或五个未改变的HRP-亚单位(单体)和五个、四 个、三个、两个或一个HRP-融合蛋白质。
根据本发明的复合物使得多聚抗原的折叠和多聚抗原内的分子 间相互作用(例如通过二硫键)最佳，从而具有最佳的免疫原特性。
在一个实施方式中，感兴趣的分子能够影响或改变生物体的免疫 系统，所述生物体优选是哺乳动物，更优选是人。在一个优选的实施 方式中，感兴趣的分子是抗原。抗原是任何刺激免疫系统的物质。抗 原通常是外源微生物，例如侵害机体的细菌或病毒；或所述微生物的 组分，例如蛋白质或蛋白质片段。感兴趣的分子优选选自以下一组： 细菌抗原、病毒抗原、原生动物抗原、线虫抗原和真菌抗原。本发明 提供了用于输送各种抗原的蛋白质复合物，所述抗原例如是T细胞表 位和/或B细胞表位如线性B细胞表位CPV(犬细小病毒表位)和T 细胞特异性表位HA(流感病毒血凝素表位)；以及包含这种蛋白质 复合物的组合物。本发明的复合物也可以输送大抗原，例如病毒(糖) 蛋白如经典CSFV(猪瘟)病毒的E2蛋白。一个亚单位融合蛋白质 也可以与多个感兴趣的分子融合。例如，给蛋白质复合物提供至少一 个未改变的亚单位和至少一个与两个HA表位和两个细小病毒表位 翻译融合的亚单位(参见图1)。在本发明的一个实施方式中，蛋白 质复合物(例如基于LTB的复合物)包含至少一个未改变的亚单位 和至少一个(优选两个)与CSFV E2糖蛋白融合的亚单位。在另一 个实施方式中，本发明的蛋白质复合物包含至少一个未改变的亚单 位、至少一个与细小病毒表位融合的亚单位和至少一个与多个感兴趣 的分子融合的亚单位(含有与两个HA表位和两个细小病毒表位融合 的亚单位)。
在另一个实施方式中，本发明的蛋白质复合物包含至少一个未改 变的亚单位和至少一个与免疫调节分子(或其一部分)例如细胞因子 或热休克蛋白(HSP)融合的亚单位。细胞因子包括了参与免疫应答 过程中细胞间的信号传输的一大组分子。细胞因子是蛋白质或多肽， 一些附着有糖分子(糖蛋白)。不同类的细胞因子可以区别开：干扰 素(IFN-α、β、γ)、白细胞介素(IL-1至IL-15)、集落刺激因子(CSF) 和其他细胞因子例如肿瘤坏死因子(TNF)α和β或转化生长因子 (TGF)β。HSP具有卓越的免疫调节特性，该特性来自它们通过被 鉴定为CD91的受体与巨噬细胞和树枝条状细胞的相互作用。例如， HSP70-2是在应答炎症刺激时所诱导的一种重要的免疫调节蛋白质。 待包括在本发明的蛋白质复合物中的感兴趣的HSPs包括HSP-60、 HSP-70、HSP-90和Gp-96。根据所需免疫应答的类型(例如Th1/Th2、 抗体应答、抗炎症应答)，一个或多个(不同的)免疫调节蛋白或其 部分可以与本发明的蛋白质复合物的亚单位融合。例如，本发明的多 成分疫苗包含含有抗原和免疫调节分子(优选细胞因子)的指导抗体 应答(T、B细胞)的蛋白质复合物，。另一方面，为了治疗或预防例 如自身免疫病(例如糖尿病、多发性硬化)，使用多成分疫苗或包含 自身抗原和控制耐性的免疫调节蛋白的疫苗可能是有利的。
其它感兴趣的分子包含那些当其作为本发明的组合物的一部分 时，可以被用作“报道”分子以报道载体复合物在体内的定位的分子。 这有助于监测复合物与受体分子的体内结合以及该复合物(经受体介 导)转运通过粘膜上皮细胞，等等。感兴趣的报道分子例如是酶(氯 霉素乙酰基转移酶(CAT)、新霉素磷酸转移酶(neo)、β-葡糖醛酸糖 苷酶或萤火虫萤光素酶，等等)或荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP) 或其光谱变异体(spectral variant)。
在本发明的一个方面，蛋白质复合物包含至少三个亚单位，其中 至少两个亚单位带有感兴趣的分子。所述至少两个亚单位可以与相同 的感兴趣的分子或不同的感兴趣的分子翻译融合。优选具有至少两个 不同的感兴趣的分子的本发明的蛋白质复合物用作至少两种不同抗 原的载体分子，例如用于制备多成分疫苗。不同类型的感兴趣的分子 的其它组合，例如一个或多个抗原与一个或多个免疫调节(刺激或抑 制)蛋白的组合当然也是可能的。
Yu和Langridge(Nature，2001，vol.19：548)描述了基于霍乱毒素 的多成分疫苗，他们研究了与鼠轮状病毒肠毒素NSP4的22个氨基 酸的优势免疫表位融合的霍乱毒素B亚单位以及与CTA2亚单位融合 的ETEC菌毛定居因子CFA/I的表达。与本发明的复合物不同，所报 道的霍乱毒素复合物的全部亚单位(B和A2两者)都与抗原融合。 CTB表达或功能性CTB/A2复合物的形成这一特殊的情形中没有遇 到问题的事实可能和与B亚单位融合的NSP4表位的大小非常小(大 约5kDa)有关。如所述那样，功能性五聚体形成遇到的问题在很大 程度上是由于空间位阻，而与亚单位融合的这种小的表位不可能影响 五聚体的形成。根据本发明，现在也有可能制备(多成分)疫苗，其 中抗原比5kDa大得多。例如，本发明提供了一种蛋白质复合物，其 包含至少一个与感兴趣的分子融合的(CT/LT)B亚单位、至少一个 未改变的B亚单位和与不同的感兴趣的分子融合的A2亚单位。优选 地，所述与B亚单位融合的分子大于7kDa，更优选大于10kDa，甚 至更优选大于15或甚至25kDa。然而，在本发明的另一个实施方式 中，同一载体复合物的(LT/CT)B亚单位和(LT/CT)A2亚单位 与相同的抗原融合，其中所述抗原是具有免疫保护特性的多聚体(二 聚体、三聚体、四聚体)蛋白质复合物的一部分。
本发明进一步提供了一种用于制备本发明的蛋白质复合物的方 法，所述方法包括：a)提供一种宿主细胞，其具有编码未改变的亚 单位的第一个核苷酸序列和编码与感兴趣的分子融合的亚单位的第 二个核苷酸序列；b)培养所述细胞从而使得所述第一个和第二个核 苷酸序列表达并装配成蛋白质复合物；c)分离所述复合物；和d) 测定所述复合物与细胞表面受体的结合。
术语“宿主细胞”指任何能够复制和/或转录和/或翻译异源基因 的细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是植物细胞，噬菌体或细菌。 在一个优选的实施方式中，本发明的宿主细胞是一种可食用的宿主细 胞，当其被食用时不会引起任何有害的影响。优选的例子是马铃薯、 番茄、烟草、玉米和乳酸菌)。因此，宿主细胞是指任何位于体外或 体内的真核或原核细胞(例如细菌细胞如大肠杆菌、酵母细胞如毕赤 酵母(Pichia pastoris)、哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞、禽类细 胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞、真菌细胞如Agaricus bisporis 和昆虫细胞如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))。例如，宿主细胞可 以位于转基因植物中。
如上述，在特定的实施方式中，可以将植物用于本发明的方法中。 所述植物宿主可能是单子叶植物(例如玉蜀黍(Zea mays)、小麦 (Triticum aestivum)、稻(Oryza sativa)或浮萍(Lemna spp))或双 子叶植物(例如与烟草属(Nicotiana)相关的植物如普通烟草 (N.tabacum)、番茄属(Lycopersicon)如番茄、豆科(Leguminosae) 包括苜蓿属(Medicago)或苔藓如展叶剑叶藓暖地亚种(Physcomitrella patens))。在一个优选的实施方式中，所述宿主细胞是马铃薯(Solanum tuberosum)。
根据本发明，给宿主细胞提供至少两个不同的核苷酸序列：一个 编码未改变的亚单位(未与感兴趣的抗原融合)的核苷酸序列和一个 编码与感兴趣的分子翻译融合的亚单位的核苷酸序列。例如，用编码 未改变的LTB亚单位的第一个核苷酸构建体和编码与感兴趣的抗原 融合的LTB亚单位的第二个构建体转染(植物)宿主细胞。编码与 感兴趣的分子融合的亚单位的核苷酸序列在所述亚单位与所述感兴 趣的分子间还可以包括接头或铰链区以提高所得融合蛋白质的柔性。 在转染并在合适的条件下培养后，所述细胞将表达这两种多肽以装配 功能性的、基于LTB的、加载了抗原的嵌合蛋白质复合物。为了制 备具有至少两个不同的感兴趣的分子的本发明的蛋白质复合物，宿主 细胞自然具有至少三个不同的核苷酸序列。可以通过所述宿主细胞与 不同载体的共转染(例如通过T-DNA)将这些不同的核酸序列导入 宿主细胞中，每个载体携带有不同的核苷酸序列。或者，可以通过杂 交或通过在双元载体上使用两个或多个表达盒将两个或多个不同的 基因构建体导入一个宿主细胞中。此外，一个已经建立起来的宿主细 胞系可以利用再转化而具有额外的核酸序列，所述细胞系已经包含本 发明的蛋白质复合物的一个(或多个)成分。或在另一个实施方式中， 表达至少两个不同的核酸序列的宿主细胞是通过一个序列在稳定表 达另一个序列的宿主细胞中的瞬时(病毒介导的)表达而获得。
可以在这样的事实中寻求到使用不同的载体的优势，即其允许宿 主细胞以变动比率具有不同的核酸构建体。因此，有可能滴定未改变 的、“游离”亚单位的量相对于宿主细胞表达的融合亚单位的量，并 优化所得多聚体蛋白质复合物的组成。例如，如果想要得到含有超优 融合亚单位的复合物，则需要用构建体A(未改变的亚单位)和构建 体B(融合亚单位)共转染或共转化宿主细胞，其中所述构建体B的 量超过构建体A的量(例如A∶B＝1∶3或1∶5，甚至1∶10)。相反，构 建体A的量超过构建体B的量被优选用以增加装配好的蛋白质复合 物的变化，所述蛋白质复合物含有相对少量的融合亚单位。如果希望 将融合亚单位对本发明的功能性蛋白质复合物的装配的负面空间位 阻或影响减到最少，当然优选后者。
在另一个实施方式中，用编码与感兴趣的分子(例如LTB-CSFV E2)融合的亚单位的核酸构建体转化宿主细胞，其中所述构建体在编 码所述亚单位的核酸序列与编码所述感兴趣的分子的核酸序列之间 含有蛋白酶剪切位点。这样的融合蛋白质经蛋白酶在体内部分剪切 后，宿主细胞将含有未改变的亚单位以及与感兴趣的分子融合的亚单 位，它们可以形成本发明的嵌合蛋白质复合物。
可以利用本领域中已知的各种方法提供具有重组的或分离的核 酸(DNA或RNA)的宿主细胞。这包括转化、转染(例如利用磷酸 钙沉淀或阳离子脂质体试剂)、电穿孔、离子轰击和农杆菌介导的 T-DNA转移。根据宿主细胞的类型，本领域技术人员将能意识到应 该选择何种方法。
给宿主细胞提供所述外源核苷酸后，对宿主细胞进行培养使得所 述第一个和第二个核苷酸序列共表达并使得所得到的多肽装配成本 发明的蛋白质复合物。在一些情况下，尤其是当转化或转染方法相对 而言不是那么有效的情况下，选择那些确实获得了所述核苷酸的宿主 细胞并仅培养那些选择的宿主细胞是有利的。转化或转染(或其它给 宿主细胞提供分离的核酸的方法)后的宿主细胞选择可以根据标准方 法进行。例如，绝大多数用于将感兴趣的DNA序列输送给宿主的普 通载体也包含编码一种蛋白质(例如酶)的核酸序列，在有效输送至 宿主细胞并被宿主细胞有效表达的基础上，所述蛋白质赋予了所述宿 主细胞对选择试剂的抗性。常用的选择试剂是抗生素，例如新霉素、 卡拉霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素等。
在本发明的一个方法中，具有至少两种不同的核酸的(选择)宿 主细胞(假设使用双元载体或不同的载体)将表达至少两种不同的多 肽，例如未改变的(非融合的)亚单位X和融合亚单位Y。
在本发明的另一个实施方式中，第一个宿主细胞，例如微生物宿 主细胞，提供了未改变的亚单位X；第二个宿主细胞提供了包含感兴 趣的分子(例如抗原)的融合亚单位Y。任选地，第三个宿主细胞能 够生产包含第二个感兴趣的分子(例如第二种抗原或免疫调节分子如 细胞因子)的融合亚单位Z。在分离分别制备到的X和Y(以及任选 地Z)亚单位后，可以在适于形成包含至少一个X亚单位和至少一个 Y亚单位的蛋白质复合物的条件下将它们相互接触。这一在体外重建 了本发明的嵌合蛋白质复合物方法使得可以通过以某一比率将未改 变的亚单位与融合亚单位相互接触来滴定同一复合物中未改变的亚 单位相对与融合亚单位的数目。与使用单一的制备未改变的以及融合 亚单位的宿主细胞形成对比，根据上述重建方法制备嵌合蛋白质复合 物不依赖于亚单位的相对表达水平。当然，可以控制相互接触的未改 变与融合亚单位之间的比率(也参见实施例9)。因此，本发明提供 了用于制备本发明的蛋白质复合物的方法，包括：a)给第一个宿主 细胞提供编码未改变的亚单位的核苷酸序列和给第二个宿主细胞提 供编码感兴趣的分子的核苷酸序列，其中至少一个感兴趣的分子与亚 单位融合；b)培养所述宿主细胞从而使得所述核苷酸序列表达；c)分 离所述核苷酸所编码的蛋白质；d)在允许装配所述蛋白质复合物的 条件下接触所述分离的蛋白质；e)分离所述复合物；f)测定该复合 物与细胞表面受体或模拟细胞表面受体的分子的结合。如所述，在步 骤d)中，可以以特定的比率混合所述蛋白质以适于具有一定亚单位组 成的蛋白质复合物的形成。
将所述至少两种多肽装配成多聚体复合物可以产生多种分别具 有不同的亚单位组成的复合物。理论上，可以形成两种类型的复合物： 仅包含未改变的X亚单位或仅包含融合Y亚单位的同聚复合物；和 包含X和Y亚单位的混合的异聚或嵌合复合物。根据在复合物种存 在的X和Y亚单位的数目，有可能得到多种类型的嵌合复合物。例 如，三聚体复合物可以包含两个X亚单位和一个Y亚单位，反之亦 然；四聚体复合物可以分别包含三个、两个或仅一个X亚单位和一 个、两个或三个Y亚单位；等等。将理解到，本发明的蛋白质复合 物涉及到后一种(嵌合)蛋白质复合物；同聚X复合物缺少感兴趣 的分子，同聚Y复合物(如果其装配的话)可能不能与受体结合， 因为大量的(大的)感兴趣的融合分子存在空间位阻。此外，其中所 有亚单位都与抗原和融合的同聚蛋白质复合物可能不能作为用于多 聚体抗原的有用的载体分子，这是由于就免疫原性特性而言，各抗原 单体的定位/构造不理想。因此，在本发明的一个实施方式中，本发 明所提供的嵌合蛋白质复合物分离自嵌合复合物和同聚复合物的混 合物。但是，应当理解嵌合蛋白质复合物不总是需要分离自同聚复合 物。在一个实施方式中，包含嵌合以及同聚复合物的组合物被适当地 用作疫苗。但是，优选地，嵌合复合物较同聚复合物的量更大。例如， 嵌合蛋白质复合物占蛋白质复合物的总数的至少50％，优选至少60 ％，更优选至少70％。
可以基于嵌合蛋白质复合物和同聚蛋白质复合物的大小将它们 相互分离开。因为，从定义上讲融合的亚单位比未改变的亚单位大， 具有不同的亚单位组成的复合物将具有不同的大小。这一区别使得可 以根据复合物的大小从同聚和嵌合蛋白质复合物的混合物中分离出 所需的嵌合复合物。在一个优选的实施方式中，利用凝胶过滤色谱分 离本发明的蛋白质复合物。凝胶过滤层析(也称作大小排阻层析或分 子筛层析)可被用于根据其大小分离蛋白质。可以在本领域中所使用 的手册中获得关于蛋白层析的标准信息，例如RK Scopes的“Protein Purification：Principles and Practice”(Springer-Verlag 3rd edition， January 1994；ISBN 0387940723)。
简而言之，在凝胶过滤的过程中，溶液中的蛋白质(的混合物) 穿过包有半透性多孔树脂的柱。该半透性树脂的孔径有一个范围，其 决定了可以用该柱进行分离的蛋白质的大小。这被称为该树脂的分级 范围或排阻范围。大于该树脂的排阻范围的蛋白质不能进入孔中并在 树脂间的空隙处快速穿过柱。这就是众所周知的柱的外水体积。在该 树脂的排阻范围以下的小蛋白质和其它低分子量物质进入到该树脂 中的全部孔中，且它们移动通过柱的速度很慢，因为它们必须穿过该 柱的整个容积。其大小落入柱的排阻范围内的蛋白质讲仅进入一部分 孔中。根据它们的大小，这些蛋白质的移动将会很慢；越小的蛋白质 通过的时间越长，因为它们所必须通过的容积更大。为了通过凝胶过 滤层析分离蛋白质样本，必须首先用所需缓冲液对柱进行平衡。通过 简单地将几个柱体积的缓冲液通过所述柱完成平衡。平衡是一个很重 要的步骤，因为所述蛋白质样本将在该平衡缓冲液中洗脱。然后，将 所述样本加载到所述柱上并使其进入所述树脂中。然后更多的平衡缓 冲液通过所述柱以分离样本并将其从柱上洗脱下来。当样本从柱上洗 脱下来时收集级分。较大的蛋白质洗脱在较早的级分中，较小的蛋白 质洗脱在随后的级分中。
理想地，凝胶过滤应该在寒冷温度下进行，因为除了减少蛋白质 复合物的降解外，还有助于减少跑样过程中的扩散，这提高了分辨率。 通过使用更长的柱加强了蛋白质的分离，但更长的运行时间会增加所 述蛋白质的降解。
层析介质的选择在凝胶过滤层析中是重要的考虑因素。一些普通 的凝胶过滤层析介质有：Sephadex G-50(适用于1-30kD范围内的蛋 白质的分级)、Sephadex G-75、Sephadex G-100(4-150kD)、Sephadex G-200(5-600kD)、Bio-Gel P-10(1.5-20kD)、Bio-Gel P-30(2.4-40kD)、 Bio-Gel P-100(5-100kD)和Bio-Gel P-300(60-400kD)。Sephadex 是Pharmacia的商标。Bio-Gel是Bio-Rad的商标。在约0.6柱体积洗 脱的分子发生最佳分离，但是典型地峰变得更宽，随后消失。在一个 实施方式中，宽分级范围材料被用于提供最初的截断值，去除大很多 和小很多的蛋白质，随后更窄范围的材料被用于最佳分离。可以使用 已知分子量标准(蛋白质)对凝胶过滤柱进行校准。可以绘制标准曲 线以logMW(分子量的对数)函数来表示保留时间。在本发明的一 个方法中，优选将同聚蛋白质复合物用于表示异聚复合物将从柱上洗 脱下来的范围。这将在以下实施例中进行进一步阐述，其详细描述了 以上所提及的其中一个例子。提供了表达亚单位X和Y的宿主细胞 (称作“XY”)，两个亚单位都能与其自身和/或相互间形成四聚体。 此外，提供了仅表达亚单位X(未改变的亚单位)的宿主细胞“X” 和仅表达亚单位Y(与感兴趣的分子融合的亚单位)的宿主细胞“Y”。 根据同聚X和Y复合物(分别是亚单位X和Y的大小的四倍)的预 测大小选择适当的凝胶过滤介质。从定义上而言，本发明的嵌合蛋白 质复合物的大小将大于X同聚体，且小于Y同聚体。相应地，全部 嵌合蛋白质复合物(XYYY、XXYY和XXXY)的洗脱体积将大于Y 同型四聚体(最大的复合物)的洗脱体积但小于X同型四聚体(最 小的复合物)的洗脱体积。将仅含有Y同型四聚体的宿主细胞“Y” 的蛋白质样本和仅含有X同型四聚体的宿主细胞“X”的蛋白质样本 用于凝胶过滤柱能够容易地揭示由宿主细胞“XY”所产生的嵌合蛋 白质的洗脱体积的“范围”。例如，收集柱级分，并用于通过SDS-PAGE 继以使用特殊试剂(例如抗体)进行Western印迹来分析X或Y亚 单位的存在。如果需要，可以将条件(柱大小、柱直径、流速等)调 整至使X四聚体与Y四聚体的分辨率最佳。当然，X和Y之间的大 小差异越大(即感兴趣的分子越大)，越容易将不同的四聚体复合物 相互分辨开。但是，本发明特别涉及解决由大的大小差异(例如具有 大抗原的复合物)所引起的问题。因此，根据本发明的复合物的分离 不会引起大问题。一旦测定了嵌合复合物的洗脱体积，宿主细胞“XY” 的蛋白质样本可以被应用于所述柱并在与用于用同型四聚体校准的 条件所相同的条件下从所述柱上进行洗脱。收集柱级分并如上述用于 分析X和/或Y亚单位的存在。可以进行非加热的蛋白质级分的 SDS-PAGE以分析最初的蛋白质复合物的大小。含有本发明的嵌合复 合物级分而同时缺少同聚复合物的级分被保留用于进一步的用途。可 以将级分集中在一起得到本发明的蛋白质复合物的混合物。也可以将 级分分开保留以得到例如单独的分离的复合物的形式的复合物 XYYY、XXYY和XXXY。
传统的凝胶过滤层析可以是一个耗时的过程。如果降低层析介质 或树脂的颗粒大小且柱做得更小则可以显著地加速该过程。这需要利 用更高压力的特殊设备来得到流过所述柱的液体。在一个优选的实施 方式中，利用高压液相层析(HPLC)或高效液相层析(FPLC)分离 本发明的蛋白质复合物。
在本发明的方法中，分离的蛋白质复合物被进一步表征以测定其 与细胞表面受体或模拟受体结合部分的分子相结合的能力，例如模拟 GM1受体的D-半乳糖可用以表征(或纯化)本发明的基于LTB或 CTB的蛋白质复合物。在一个优选的实施方式中，结合包括永久结 合，因为其比瞬时结合更易于检测。可以使用分离的或纯化的受体， 但是也可以使用表达受体的细胞或衍生自这些细胞的膜材料。在适于 本发明的蛋白质复合物与其受体结合的条件下，用受体接触本发明的 蛋白质复合物。可能影响受体结合的条件包括离子强度(pH、盐) 和温度。之后，测定结合的复合物的量。在一个优选的实施方式中， 通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或基本上基于ELISA的方法进行本 发明的分离的蛋白质复合物与细胞表面受体的结合。ELISA的基本 原理是使用酶检测抗原(Ag)与抗体(Ab)的结合。所述酶将无色 底物(色原)转化成有色产物，表明存在Ag:Ab结合。在本发明的 一个特定的实施方式中，蛋白质复合物是基于大肠杆菌的热不稳定性 肠毒素(LT)的B亚单位。在体内，B亚单位的五聚化以及该五聚 体与其天然受体CM1的结合是导致所述毒素被摄入并最终触发与粘 膜免疫相关的免疫调节活动的关键事件。如本申请所举例说明的那 样，基于LTB亚单位的本发明的蛋白质复合物的结合是利用如De Hann et al(Vaccine 1996；1：777-783)所描述的GM1-ELISA容易地 进行测定。通过使用这一类型的测定，将清楚本发明的基于LTB亚 单位的蛋白质复合物保留了其天然的五聚体结构，所述蛋白质复合物 包含至少一个未改变的LTB亚单位和至少一个LTB融合蛋白质。
在本发明的另一方面，提供了包含本发明的蛋白质复合物的宿主 细胞。宿主细胞例如是微生物细胞，其具有一个或多个编码本发明的 复合物的成分的核酸构建体。在一个实施方式中，所述宿主细胞是细 菌细胞，例如转化的大肠杆菌细胞。如上述，细胞优选是可食用的细 胞，其包含能够将一个或多个抗原输送至并通过粘膜表面的蛋白质复 合物。可食用的细胞的实例有可食用植物例如马铃薯的细胞。这样的 复合物被优先用作粘膜载体分子。相应地，包含本发明的粘膜载体分 子的可食用的细胞或其提取物可用于口服接种，例如通过食物或饮用 水。
如前面所述的那样，载体分子的传统应用基本上局限于输送相对 小的抗原。但是，由于本发明的嵌合复合物保留了其与细胞表面受体 结合的能力，现在有可能利用载体分子输送相对大的感兴趣的分子 (抗原等)而几乎不用考虑融合蛋白质的大小。众所周知，一旦抗原 被输送到体内的适当的部位，可以诱发免疫应答。例如，被成功地输 送通过覆盖在粘膜管上的上皮细胞屏障的抗原刺激潜在的与粘膜相 关的淋巴组织(MALT)的感应部位。本发明的蛋白质复合物可以具 有感兴趣的一个或多个抗原性分子，基本上不受限于感兴趣的分子的 大小和复杂性，并且重要的是不损失其输送所述复合物通过上皮细胞 屏障以刺激所述MALT的载体特性。因此，本发明的复合物优选用 以在对象体内诱导免疫应答，优选哺乳动物对象例如小鼠或人。在一 个实施方式中，包含感兴趣的抗原的本发明的嵌合蛋白质复合物被用 于疫苗中。本发明提供了一种包含具有特定抗原(或多种抗原的组合) 的本发明的复合物的疫苗，当将其施用给对象时能够诱发保护该对象 的免疫应答，例如保护该对象免于患上由所述抗原引起的疾病。所述 疫苗可以是一种治疗性疫苗，其可以在感染后施用，且其目的是减缓 或阻止疾病进程。优选地，其是一种预防性疫苗，能够预防对象的初 发感染。
此外，本发明提供了包含本发明的蛋白质复合物或包含所述复合 物的细胞的(基于植物的)疫苗，以及包含有效量的所述疫苗的药物 组合物。本发明的疫苗可以是一种多成分疫苗，其包含本发明的含有 至少不同的两个抗原的蛋白质复合物。
在本发明的另一方面，本发明提供了一种用于提高对象对特定病 原体的免疫应答的方法，该方法包括给对象施用(优选口服施用)至 少一剂有效量的本发明的蛋白质复合物，其中的感兴趣的分子是抗 原。该方法还为基于通过饲喂宿主(植物)细胞或植物细胞化合物口 服输送所述复合物将保护性抗原(包括大的(结构)抗原)输送至位 于肠道的免疫系统打开了一条通路。本发明还提供了一种用于粘膜 (鼻腔、直肠或阴道)免疫的方法，该方法包括经优选的免疫途径给 对象施用本发明的疫苗。本发明从而延伸了抗原性化合物的大小和种 类，所述化合物可以被掺入基于疫苗的载体分子。
附图说明
图1
表示的是含有不同的LTB和LTB亚单位疫苗基因构建体的双元 载体pLANTIGEN4、12、13和15的T-DNA部分。LB，左侧T-DNA 边界序列；PNOS胭脂碱合酶启动子；NPTII，新霉素磷酸转移酶II基 因，可选择的卡拉霉素抗性标记；TNOS，胭脂碱合酶终止序列；PPAT， I型patatin启动子；Gene，位于PPAT启动子控制下的用于表达的克 隆位点；RB，右侧T-DNA边界序列；SP，信号肽；LT-B，最适用于 在植物中表达的合成基因LTB；KDEL，内质网滞留信号；parvo，犬 细小病毒(CPV)表位；Ala，丙氨酸；influenza，HA流感病毒血凝 素表位；CSFVE2，缺少跨膜结构域的经典猪瘟病毒E2糖蛋白。
图2
利用LTB5构象性单克隆抗体VD12(A)和CSFVE2构象性 mAb V3(B)对块茎提取物(各25μg总蛋白质)进行的Western分析。 泳道1，pL(4+13)16；泳道2，蛋白质大小标记；泳道3，对照组提取 物；泳道4，pL13(31)；泳道5，pL13(17)和泳道6，pL4(17)。A中的 箭头是指含有五聚复合物的LTB5，B中的箭头是指含有复合物的 CSFV E2构象性表位。
图3
条件：A，用VD12(抗-LTB5)温育左侧印迹；和B，用V3(抗 -CSFV E2)温育右侧印迹。除样本pL(4+13)16(泳道4)和pL(4+13)46 (泳道7)加样25μg总块茎蛋白质外，其它样本各加样50μg总块茎 蛋白质。泳道1，野生型块茎提取物；泳道2，pL(4)21提取物；泳道 3，pL(13)17提取物；泳道4，pL(4+13)16提取物；泳道5，pL(4+13)31 提取物；泳道6，pL(4+13)39提取物；泳道7，pL(4+13)46提取物； 泳道8，pL(4+13)60提取物；泳道9，pL(4+13)64提取物和泳道10， pL(4+13)67提取物。泳道2左侧较低的箭头指出了同型五聚体 (LTB)5，上方的箭头指出了同型五聚体(LTB-CSFV E2)5。右侧的箭头 指出了本发明的嵌合复合物。分子量标记示于左侧。
图4
在半天然条件下，于12％的SDS-PAGE凝胶上对pL(4+12)植物 的块茎提取物(各25μg)进行Western印迹分析。A，用VD12(抗 -LTB5)温育左侧印迹；和B，用3C9(抗-parvo)温育右侧印迹。泳 道1，全范围彩虹分子量标记；泳道2，pL4(pL417)提取物；泳道3， pL12(pL(12)01)提取物；泳道4，pL4和pL12提取物的1∶1混合物 (pL(4)17和pL(12)02)；泳道5，V，PAT4载体阴性对照；泳道6-10， 分别为pL(4+12)16、pL(4+12)23、pL(4+12)51、pL(4+12)52和 pL(4+12)57的提取物。左侧箭头指出了LTB和LTB-parvo(LTB-P)， 右侧箭头指出了本发明的嵌合复合物。左侧的实心短条表示蛋白质标 记。泳道3中较LTB迁移得略高的较低的条带是基于加热加样缓冲 液中的样本衍生自LTB-P的降解产物。
图5
在半天然条件下于10％的SDS-PAGE凝胶(A)上，或在还原条 件下于15％的SDS-PAGE凝胶(B)上对pL(4+12+15)植物的块茎提 取物跑样进行Western印迹分析。A，用VD12(抗-LTB5)温育左侧 印迹和用3C9(抗-parvo)温育右侧印迹；和B，用3C9(抗-parvo) 温育印迹。每一泳道中加样各25μg总块茎蛋白质提取物。泳道1， mol.分子量标准；泳道2，野生型块茎提取物；泳道3，pL421提取物； 泳道4，pL1201提取物；泳道5，pL1516提取物；泳道6-10，pL(4+12+15) 块茎提取物：泳道6，pL(4+12+15)7；泳道7，pL(4+12+15)9；泳道8， pL(4+12+15)11；泳道9，pL(4+12+15)16和泳道10，pL(4+12+15)19 提取物。在A中，左侧较低的箭头指出了LTB5，中间的箭头指出了 (LTB-parvo)5，上部的箭头指出了(LTB-iipp)5。右侧的箭头指出了嵌合 复合物。在B中，左侧较低的箭头指出了LTB-细小病毒，上部的箭 头指出了LTB-iipp。
图6
通过亲和层析在固定化的D-半乳糖(Pierce)上纯化大肠杆菌 recLTB。用6体积的TEAN缓冲液充分洗涤柱后，将通过离心过滤 收集的来自超声处理的大肠杆菌细胞的上清液加样到安装在FPLC装 置上的5cm的D-半乳糖柱上。将溶解于添加了蛋白酶抑制剂混合物 (Roche)的47.5mL TEAN缓冲液中的来自大肠杆菌的粗蛋白质以 0.5mL/min的流速加样到柱上。用3体积(142.5mL)TEAN缓冲液 (50mM Tris-HCl，pH7.4；0.2M NaCl；1mM EDTA)以0.5mL/min的 流速进行洗涤。用添加了0.5M D-半乳糖的洗涤缓冲液以0.5mL/min 的流速进行洗脱。收集1mL的级分并在收集后立即置于冰上。将检 验器设定在0.1A.U.，记录速度为0.25cm/mL。
A.洗脱图。实心箭头描述的是添加了0.5M D-半乳糖的起始洗 脱TEAN缓冲液。记录下的实线表示级分编号16-22(主峰)。
B.GM1-ELISA池级分1-32(各1mL)。通过GM1 ELISA确定了 LTB5的量(ng/μl级分)。C.考马斯染色凝胶级分17-22。在还原条 件下用预制的10％SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad)跑样。泳道M，分子 大小标记；泳道E，10μl粗提取物(上柱前)；泳道17-22，各级分 10μl。在加样和跑样前在标准条件下将样本煮沸3min。用考马斯亮 蓝将凝胶染色过夜，并用0.3％Tween-20脱色。左侧的箭头描述了LTB 单体，大小分子量标记示于右侧(kDa)。
图7
通过亲和层析在固定化的D-半乳糖(Pierce)上纯化来自pL421 植物的30g鲜重块茎的recLTB。将块茎剥下并切成小片，添加70mL 冷却的提取缓冲液，在不锈钢搅拌器中进行研磨和提取。于4℃以 15300rmp离心含有粗蛋白提取物和recLTB的上清液5min，以除去微 粒和淀粉颗粒。重复该离心步骤直至上清液完全清澈，将剩余的47mL 粗提取物加载与所述柱上。以0.5mL/min进行加载并将所述柱于4℃ 进行冷却。加载后，用42mL的TEAN缓冲液以0.75mL/min进行洗 涤，并用添加了0.3M D-半乳糖(而不是0.5M；共26mL)的TEAN 缓冲液进行洗脱。收集级分。级分量为0.75mL，并在收集后立即将 级分置于冰上。将检验器设定在0.2A.U.，记录速度为0.25cm/mL。
A.洗脱图。实心箭头描述的是添加了0.3M D-半乳糖的起始洗脱 TEAN缓冲液。记录下的实线表示0.75mL的级分编号1-15。主峰位 于级分10-11。
B.GM1-ELISA级分1-21(各0.75mL)。通过GM1 ELISA确定 了LTB5的量(ng/级分)。
图8
通过亲和层析在固定化的D-半乳糖(Pierce)上纯化来自 pL(4+13)46植物的6.5g冻干块茎的嵌合蛋白质复合物pL(4+13)。在 提取前，向冻干的块茎材料添加26mL水，然后加入添加了蛋白酶抑 制剂混合物(Roche)的65mL提取缓冲液。在冰上持续振荡22min 进行提取，将提取物通过80μM的网眼布进行过滤，并于4℃以 15300rpm、10min离心两次以除去剩下的淀粉颗粒。将剩余的57mL 清澈的粗提取物加载与所述柱上。以0.5mL/min进行加载并将所述 柱于4℃进行冷却。加载后，用TEAN缓冲液以0.75mL/min洗涤所 述柱61min，并用添加了0.3M D-半乳糖的TEAN缓冲液进行洗脱。 收集级分。级分量为0.75mL，并在收集后立即将级分置于冰上。将 检验器设定在0.2A.U.，记录速度为0.25cm/mL。
A.洗脱图。实心箭头描述的是添加了0.3M D-半乳糖的起始洗 脱TEAN缓冲液。记录下的实线表示0.75mL的级分编号1-15。主峰 位于级分10-11。
B.标准GM1-ELISA级分5-19(各0.75mL)。通过GM1 ELISA 确定了LTB5的量(ng/级分)。
C.修饰的GM1-ELISA级分5-19。用特异于CSFV E2的V3mAb 和碱性磷酸酶标记的绵羊-抗-小鼠IgG(而不是VD12、抗-LTB5)对 结合进行检测。
实施例
实施例1：LTB亚单位疫苗表达盒的构建
双元植物表达载体pBINPLUS的T-DNA部分的概述(Van Engelen et al.，1995)和本申请所报道的所有pLANTIGEN疫苗构建体 的基因插入物示于图1中。全部基因都置于I型patatin启动子(Ppat) 的控制下用以仅在块茎中表达，并且还在各融合蛋白质的C末端具有 编码KDEL(Lys-Asn-Gln-Leu)的DNA序列用于在在内质网中的滞 留(Munro and Pelham，1987)。
pL4：以前已描述了LTB的合成基因(synLT-B)的设计和构建 以及双元植物表达载体pLANTIGEN4(pL4)(Lauterslager et al.， 2001)。pL4具有LTB的合成基因(synLT-B)，就在编码成熟的LTB 蛋白质的序列后，编码KDEL的序列之前该合成基因具有一个独特的 BamHI限制位点。所有的合成序列都以这种方式制得并在这一独特 的位点进行克隆，以使得这些序列都与LTB位于读码框内而KDEL 序列位于羧基末端。
pL12：在pLANTIGEN12(pL12)中克隆的编码犬细小病毒(CPV) 表位的片段的核心，其编码氨基酸序列SDGAVQPDGGQPAVRNERA T(Langeveld et al.，1994)。pLANTIGEN12是通过将编码犬细小病毒 (CPV)病毒蛋白VP2的氨基末端区域的合成BamHI/BglII片段克 隆到pL4的独特的BamHI位点而制得。该合成片段是通过连接衍生 自先前所描述的寡核苷酸的片段(Florack et al.，1994)而制得。寡核 苷酸来自Eurogentec(Belgium)。
pL13：在pLANTIGEN13(pL13)中，连接了编码缺少C末端 跨膜(TM)区域的CSFV E2糖蛋白的片段。在野生型CSFV中，E2 糖蛋白是跨膜结合的。pL13是通过将编码经典猪瘟病毒(CSFV)的 E2成熟蛋白质的BamHI片段克隆到pL4的独特的BamHI位点而构 建获得。用寡核苷酸5’-gttcatccttttcactgaattctgcg-3’和 5’-cgcagaattcagtgaaa aggatgaac-3’对pPRb2进行PCR获得了编码CSFV E2的片段(Hulst et al.，1993)。
pL15：在pLANTIGEN15(pL15)中，CPV序列与双HA表位序 列一起克隆两次，每一个均由用于间隔的两个丙氨酸残基分隔开。 HA表位编码十肽FERFEIFPKE并代表了PR8HA-1的氨基酸111-120 (Hackett et al.，1985)。CPV是一种线性B细胞表位，然而HA是T 细胞特异性的。pL15是通过将编码由流感病毒血凝素(HA)重链以 及双CPV表位组成的四聚体序列的合成片段克隆到pL4的独特的 BamHI位点而构建，所述CPV表位与在pL12中所克隆的相似。全 部四个表位序列都以这种方式进行克隆，以使得它们各自由两个丙氨 酸残基分隔开。
实施例2：宿主细胞转化、生长和蛋白质提取
前面，本申请已经描述了22种独立的转基因马铃薯植物的产生， 所述植物含有pL4基因构建体，所述构建体产生了16种块茎 (Lauterslager et al.，2001)。其后，进行了更多的转化实验，产生了 另外31种具有所述pL4基因构建体的独立块茎。
在本发明中，通过电穿孔将实施例1中所描述的双元表达载体及 其组合导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株Ag10中 (Lazo et al.，1991)，并用于马铃薯栽培种Désirée(Solanum tuberosum cultivar Désirée)的转化(De Z.P.C.，Leeuwarden，The Netherlands)。 转基因枝条的转化、生长、选择以及块茎生产在先前已经描述过 (Lauterslager et al.，2001)。用pL12转化马铃薯栽培种Désirée的茎 节间产生27种独立的转基因植物，其中22种在温室中长出块茎。用 pL13进行转化产生23株植物，其中20种形成块茎。用pL15进行转 化产生31株植物，其中20种长出块茎。
典型地，从温室生长2-4个月后的植物收获200-300g的块茎。 从约相同量的新收获的块茎材料制备提取物以降低由于储存或块茎 龄所带来的影响。为了分离由马铃薯宿主细胞所产生的蛋白质复合 物，使用了新收获的约5cm直径的块茎。在25mM磷酸钠(pH6.6)、 100mM NaCl、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、50mM抗坏血酸钠、1％ TritonX-100和20mM焦亚硫酸钠中对去皮的块茎切片进行提取。于 4℃以12000rpm离心组织匀浆5min，收集上清液并将其转移至一个 新试管中。通过使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准的Bradford方法 (Bradford，1976)对总的可溶蛋白质进行评估。通过GM1-ELISA对 LTB五聚体复合物的表达或蓄积进行确认(实施例3)。
实施例3：测定蛋白质复合物的受体结合
通过修饰的神经节苷脂GM1酶联免疫吸附测定(GM1-ELISA) 对分离自转基因马铃薯块茎的功能性嵌合蛋白质复合物的量进行评 估。在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中以5μg/mL的来自牛脑的单唾液神 经节苷脂GM1(Sigma Aldrich，St.Louis，USA)包被微量滴定板 (PolySorp Immunoplates，Nunc)。将固定量的(典型地为5μg)总可 溶、可提取的块茎蛋白质加载于被包被的板上；所述板通过用去离子 水洗涤3遍进行预处理，并在以100rpm持续振荡的条件下，用2％ 脱脂牛奶、0.1％牛血清白蛋白和于PBS中的0.1％Tween-20于室温封 闭1h。将大肠杆菌表达载体产生的重组LTB的一系列两倍稀释液加 至每一板，所述板带有等量的来自pBINPLUSPAT块茎的总蛋白质。 于4℃结合16h。用去离子水洗涤板3次后，于室温，用特异于LTB 五聚体的1∶1000稀释的单克隆抗体VD12温育所述板1h。用去离子 水漂洗3遍后，用AP-标记的绵羊-抗-小鼠抗体进一步温育所述板， 并用4-硝基苯磷酸盐(六水合二钠盐；Janssen Chimica)检测结合的 标记。使用Microplate Manager/PC version 4.0软件，在Bio-Rad Benchmark Microplate Reader(Bio Rad，Veenendaal，The Netherlands) 中，于405nm进行检测用于标准曲线分析、浓度和标准差的计算。 五聚体LTB的量通过包含分离的五聚体的样本的读数与来自标准曲 线的结果的相互比较进行估计。在各实验中，至少分析样本两次。为 了计算摩尔比，总蛋白质/g鲜重的块茎的量被设定在7mg/g。融合蛋 白质的摩尔重是从由各pLANTIGEN融合构建体所编码的成熟蛋白 质的已知氨基酸序列推论而得。在转基因块茎中生产的五聚体蛋白质 复合物的平均表达水平示于表1。这些数据表明，感兴趣的分子越大， 功能性(即GM1-结合)同型五聚体蛋白质复合物的表达水平越低。
实施例4：包含LTB和LTB-CSFV E2的嵌合蛋白质复合物
基本上如以前所述(Lauterslager et al.，2001)及上面所概述的那 样(实施例1)，通过利用根癌农杆菌介导的马铃薯栽培种Désirée (Solanum tuberosum cv.Désirée)的转化(De Z.P.C.，Leeuwarden，The Netherlands)的共转化，将编码未改变的亚单位双元表达载体pL4 (Lauterslager et al.，2001)和与亚单位融合的编码感兴趣的分子的 pL13(LTB-CSFV E2融合；参见实施例1)导入马铃薯中。为了使得 能够进行共转化，在感染茎节间之前，将带有pL4和pL13的两种重 组农杆菌以1∶1的比例(OD595＝1)混合。将混合的细菌悬浮液用 于转化实验和转化细胞的再生，转基因枝条的选择如前面所述。获得 了71种独立的转基因枝条，选择了其中53种并用于分析是否存在 pL4和/或pL13基因构建体以揭示共转化事件的发生，发生共转化的 被选择用于进一步分析。之后，通过将约5mm直径的叶片研磨在50μl 的尿素提取缓冲液(62％ureum、0.5M NaCl、70mM Tris-HCl pH8.0、 30mM EDTApH8.0、1.5％sarkosyl)中，从收集自各植物的叶子材料 分离基因组DNA。加入等量的苯酚/氯仿(1∶1)，混合样本并置于室 温下15min。混合后，将样本以3000rpm离心10min，将上清液转移 至新的试管中并加入10μl pH5.2的4.4M醋酸铵。为了沉淀基因组 DNA，加入了120μl异丙醇并进行混合。将样本以1000rpm离心3min 并除去上清。将剩余的小球干燥并悬浮于水或含有10mM pH8.0的 Tris-HCl和1mM EDTA的缓冲液中。使用特异性引物对微升量的基 因组DNA样本进行PCR，所述引物能够区分pL4和pL13基因构建 体，例如但不限于引物LTB 11(5′-ggtgatcatcacattcaagagcggtgaaacatttc aagtc-3′)和Tnosminus 50(5′-atgataatcatcgcaagaccg-3′)。扩增条件为： 40个循环，每一循环为94℃变性30秒，56℃退火45秒，继以68℃ 延长2分钟，在根据生产厂商的最佳条件下使用AccuTaq聚合酶 (Sigma-Aldrich)。将PCR反应混合物在0.5X TBE中进行1.2％琼脂 糖凝胶电泳，将凝胶用于扫描是否存在对应于pL4和/或pL13的扩增 的基因构建体的片段，pL4和pL13的预测大小是公知的并推导自它 们的已知基因序列和所使用的引物LTB11和Tnosminus50。22株植 物同时含有两种基因构建体，但仅有28株植物含有pL4，且引人注 意的是仅有3株植物具有pL13基因构建体。将这22株对pL4和pL13 基因构建体都为阳性的植物，例如植物编号8，在本申请中还被称作 pL(4+13)8或植物pL(4+13)16、pL(4+13)31、pL(4+13)39或pL(4+13)46 转移到温室中并生长至成熟以制备用以进一步分析嵌合蛋白质复合 物的蓄积的块茎材料。
收获块茎，如实施例2和3中所述评估GM1-结合LTB五聚体的 量。几株植物显示出显著地蓄积了GM1-结合LTB五聚体，例如植物 pL(4+13)15、pL(4+13)16、pL(4+13)39、pL(4+13)46、pL(4+13)60、 pL(4+13)64和pL(4+13)67(参见表2)。这些植物被进一步表征。所 选择的共转化的马铃薯植物的块茎材料蓄积了LTB五聚体，如从例 如pL(4+13)16和pL(4+13)46分别以约8和20μg/g鲜重(FW)块茎 与神经节苷脂GM1的结合所推导的那样(表2)。
通过Western印迹进一步评估嵌合植物pL(4+13)16。之后，将植 物的块茎提取物的总蛋白质的25μg加载于10％SDS-PAGE凝胶上， 并在半天然、非还原条件下跑样以分离蛋白质复合物。半天然 SDS-PAGE之后，使用标准技术将分离的蛋白质转印到于CAPS(于 10％的乙醇中的0.22％3-[环己氨基]-1-丙磺酸，pH11)缓冲液中的硝 化纤维上用于随后用特异性抗体进行Western分析；以1∶1000稀释的 抗-LTB5构象性单克隆抗体VD12(图2A)或抗-CSFV E2构象性单 克隆抗体(图2B)。用辣根过氧化物酶标记的二抗和LumiLight底物 显现出特异性抗体结合/识别，并在LumiImager(Roche，Boehringer， Germany)中显现出来。将都带有pL13基因构建体的pL1317和1331 用做对照。pL1317先前在20株独立的pL13转基因植物中被鉴定为 LTB-CSFV E2融合蛋白质的GM1-结合五聚体的最高表达子。此外， 使用了带有pL4基因构建体并蓄积了约17μg/g FW GM1-结合LTB五 聚体的pL417，以及用于GM1-结合五聚体的阴性对照。
图2A显示了使用构象性抗-LTB5单克隆抗体VD12对这些植物 的总蛋白质提取物的25μg的量进行分析的结果；和图2B基于用特 异于构象性CSFV E2的V3进行的分析。加样共转化的植物 pL(4+13)16(泳道1；用pL4和pL13共转化)、蛋白质分子量标记(泳 道2)、带有PAT4的对照组提取物、空表达盒载体(泳道3)、都仅 带有LTB-CSFV E2基因融合的pL1331(泳道4)和pL1317(泳道5) 的提取物和用pL4转化并仅蓄积未改变的rec-LTB亚单位的pL(4)17 (泳道6)。
从图2可以明显地看出，pL(4+13)16蓄积了显著量的蛋白质复合 物，所述复合物的量显著高于同型五聚体LTB5(比较泳道1和6)， 且所述复合物可以通过构象性特异性单克隆抗体VD12和V3两者识 别(比较泳道1中的A和B)。这证明了存在带有由VD12所识别的 五聚体LTB5结构以及由V3所识别的抗原性CSFV E2二聚体表位的 嵌合蛋白质复合物。重要的是，后面的抗原性CSFV E2二聚体表位 在pL13中几乎没有(泳道4和5)，其只包含LTB-CSFV E2融合蛋 白质和未改变的LTB亚单位。此外，在用VD12和V3进行分析后， 很难看到约300kD的同型五聚体LTB-CSFV E2复合物。令人信服的 是，这是由于如在以前所观察到的它非常低的表达水平。从图2和 GM1ELISA还可以明显看到，只有同时包含LTB(pL4)和LTB-CSFV E2(pL13)的嵌合复合物(如存在于植物pL(4+13)16(图2A和B，泳 道1)促进了同时具有GM1-结合特性和抗原性CSFV E2表位的蛋白 质复合物的显著量的蓄积(8μg/g FW块茎)。相反，仅表达LTB-CSFV E2基因融合例如植物pL1317的植物不形成能结合GM1细胞表面受 体的抗原性蛋白质复合物(比较图2A和B中的泳道1和4)。
根据GM1 ELISA全部蓄积显著量的功能性LTB5嵌合植物 pL(4+13)16、pL(4+13)31、pL(4+13)39、pL(4+13)46、pL(4+13)60、 pL(4+13)64和pL(4+13)67(图2)通过所述的Western印迹进行进一 步评估。图3A显示了用VD12进行温育后的结果，并指出在 pL(4+13)16-pL(4+13)67的提取物中存在包含LTB5的多嵌合复合物， 这从其迁移至介于仅含有LTB5的pL4(21)的迁移位置(泳道2)和含 有(LTB-CSFV E2)5的pL13(17)的迁移位置(泳道3)之间的位置这一 点上是很显然的。如所期望的那样，这些嵌合复合物也与特异于CSFV E2的V3mAb反应(板B，图3)。从图3B还可以清楚地看出，尽管 相对于pL13(17)(泳道2)加载了相似量的总蛋白质，来自嵌合植物 的提取物(泳道6-10)与V3mAb的反应更强烈，进一步加强了功能 性CSFV E2二聚体在GM1-结合LTB5复合物上的蓄积。
实施例5：包含LTB和LTB-parvo的嵌合蛋白质复合物
基本上如在实施例4中所述的那样，通过利用根癌农杆菌介导的 马铃薯栽培种Désirée的转化的共转化，将双元表达载体pL4(LTB) 和pL12(LTB-CPV parvo；参见图1和实施例1)都导入马铃薯中。在 感染茎节间前，以1∶1的比率混合带有pL4或pL12的重组农杆菌， OD595＝1，将混合的细菌悬浮液用于转化实验以使得发生共转化。 选择超过45种独立的转基因枝条并用于分析是否存在pL4和/或pL12 基因构建体以揭示共转化事件的发生，发生共转化的被选择用于进一 步分析。20株转基因植物显示出同时含有两种基因构建体，然而其 中19株植物仅具有pL4，6株植物仅具有pL12。将全部20株双转化 体生长在温室中以形成块茎，收获块茎并确定GM1-结合LTB五聚体 的量。选择的pL(4+12)植物概述于表3中。
使用特异于犬细小病毒的VD12和3C9 mAb的Western印迹(图 4)表明几种植物，例如pL(4+12)19、pL(4+12)20、pL(4+12)23、 pL(4+12)31、pL(4+12)41、pL(4+12)46、pL(4+12)51、pL(4+12)52、 pL(4+12)57、pL(4+12)62和pL(4+12)65含有在SDS-PAGE凝胶上 迁移到LTB5(pL4，泳道2)和LTB-CPV5(pL12，泳道3)之间的嵌 合蛋白质复合物。从图4A和B可以明显看出，一些植物例如pL(4 +12)31、pL(4+12)57和pL(4+12)62的蛋白质提取物呈现出多个条 带，所述条带可以通过VD12(抗-LTB5)以及3C9(抗parvo)识别， 这表面存在嵌合复合物，例如含有4个未改变的LTB亚单位和1个 LTB-CPV融合亚单位，或含有3个LTB和2个LTB-CPV，或含有2 个LTB和3个LTB-CPV，或1个LTB和4个LTB-CPV(图4A和B)。 尤其在pL(4+12)57的提取物中，可以清楚地看出除同型五聚体LTB5 和同型五聚体(LTB-parvo)5外，还存在4种嵌合复合物。
实施例6：包含LTB、LTB-parvo和LTB-iipp的嵌合蛋白质复合物
基本上如上述那样，通过利用根癌农杆菌介导的马铃薯栽培种 Désirée的转化的共转化，将双元表达载体pL4(LTB)、pL12(LTB-CPV parvo)和pL15(LTB-iipp，iipp＝流感-流感-细小病毒-细小病毒，参见 实施例1)导入马铃薯中。选择29种独立的转基因枝条并用于分析是 否存在pL4、pL12和pL15基因构建体以揭示共转化事件的发生。这 些植物被选择用于进一步分析。5株转基因植物显示出含有全部三种 基因构建体；然而其中10株植物含有两种基因构建体，pL(4+12)、 pL(4+15)或pL(12+15))。剩下的14株植物仅含有一种基因构建体。 将所有带有超过一个基因构建体的植物转移至温室中并生长至成熟。 通过GM1 ELISA和利用VD12和3C9 mAb的Western印迹分析了 全部5株三重转化体，pL(4+12+15)7、pL(4+12+15)9、pL(4+12+15)11、 pL(4+12+15)16和pL(4+12+15)19(图5)。
从图5A左侧板可以明显地看出所述5株含有全部3种基因构建 体的植物(泳道6-10)含有迁移到pL(4)21(泳道3)与pL(12)01 (泳道4)之间，或pL(12)01(泳道4)与pL(15)16(泳道5)之间 的复合物，表明存在LTB、LTB-parvo和/或LTB-iipp的各种组合。从 图5A右侧板可以明显地看出这些复合物与mAb 3C9反应呈阳性，表 明存在至少一种parvo表位。从图5B右侧板可以明显地看出尤其是 pL(4+12+15)7(泳道6)和pL(4+12+15)11(泳道8)含有LTB-parvo 和LTB-iipp两者。因此，在这些植物中产生了在一种复合物中同时含 有LTB、LTB-parvo和LTB-iipp的嵌合GM1结合蛋白质复合物。
实施例7：大肠杆菌LTB亚单位表达盒的构建
可以在各种重组宿主细胞中制备根据本发明的蛋白质复合物。实 施例7和8描述了包含至少一个未改变的亚单位和至少一个与感兴趣 的分子融合的LTB亚单位的嵌合蛋白质复合物在微生物大肠杆菌中 的制备，其中报道分子为GFP。
为了在大肠杆菌和其它原核原核生物中进行表达，使用了 LTB(EtxB)的原始野生型大肠杆菌序列。LTB编码序列克隆自 pYA3047(Jagusztyn-Krynicka et al.，1993)，其与最初分离自猪大肠杆菌 菌株的核苷酸序列ECELTBP(SWISS-PROT P32890)非常类似(Dallas and Falkow，1980；Leong et al.，1985)。利用引物LTBbpi (5’-GTGACGAAGACAACATGAATAAAGTAAAATGTTATGTT-3’) 和LTBbameco(5’-GTGACGAATTCTATGGATCCCCTGGAGCGTAG TTTTTCATACTGATTGCC-3’)，以包含野生型EtxB序列的载体为模 板进行PCR扩增到一个片段。将所得的BpiI/EcoRI克隆到用 NcoI/EcoRI消化过的pET21d载体中(Novagen)产生pET-wiLTB1。 在对核苷酸序列进行鉴定后，将所得到的克隆转化到TOP10F’细胞 (Invitrogen)中用于表达研究。利用引物GFPbam (5′-GTGACGGATCCGGCTTCCAAGG-3′)和LTBGFPbam (5′-GTGACGAAGACAAGATCTTACTTGTACAACTCATCCA-3′)进 行PCR将BamHI/BpiI位点导入GFP序列的两末端，并克隆到用 BamHI消化的pET-wiLTB中。在对核苷酸序列进行鉴定后，将所得 到的克隆pET-wiLTB-GFP2转化到TOP10F’细胞中用于表达研究(实 施例8)。
实施例8：大肠杆菌细胞的转化、生长以及蛋白质提取
将两个选择的克隆，pET-wiLTB1和pET-wiLTB-GFP2，转化到大 肠杆菌Rosetta菌株中(Novagen)，并于37℃在LB培养基中生长过 夜，所述培养基添加了50mg/L氨苄青霉素和34mg/L氯霉素。将2mL 的o/n培养物稀释到50mL新鲜培养基中，并20℃持续振荡生长直 至OD595达0.2。通过添加IPEG至终浓度为1mM诱导表达，并将 培养液进一步进行培养直至OD595＝0.5。于4℃，以14000rpm离心 10min收集细胞，将小球重悬在BugBuster(Novagen)提取试剂中并 添加溶菌酶至终浓度1μg/μl。将样本在室温下温育5min，加入 Benzonase并于室温下再温育15min。随后将样本于4℃，以14000rpm 离心5min。将pET-wiLTB的上清液加载到固定化的D-半乳糖柱上用 于LTB5的纯化(也参见实施例10)。洗脱图谱描述于图6中。从图 6A可以明显地看出，可以在各级分中即对洗脱缓冲液蛋白质进行测 定。从图6B可以明显地看出，这些级分含有GM1-结合LTB5复合物， 这与GM1 ELISA的结果相似。RecLTB-GFP显示出蓄积在包含体中。 基本上如Sambrook et al.(1989)所述，并根据Khoury和Meinersmann (A genetic hybrid of the Campylobacter jejuni flaA gene with Escherichia coli and assessment of the efficacy of the hybrid as an oral vaccine.Avian disease 39(1995)812-820)略作修饰后，对所得到的含 有包含体的小球进行进一步处理。使用标准技术分离包含体并用8M 尿素进行提取。用0.1M Tris(pH7.4)对可溶于尿素的级分进行透析， 并以10000g离心过滤10min除去沉淀的级分。通过亲和层析在D- 半乳糖上对含有GM1-结合复合物的上清液进一步纯化以获得纯化的 recLTB-GFP。
实施例9：LTB和LTB-GFP嵌合复合物的制备
制备本发明的嵌合复合物的一种替代的方法包括至少一种未改 变的LTB亚单位和至少一种LTB-GFP融合亚单位参与提供包含所述 未改变的亚单位的第一种组合物，和包含所述融合亚单位的第二种组 合物；然后以1∶4、2∶3、3∶2或4∶1的莫尔比混合这两种混合物。之后， 在诱导五聚体形成的条件下，对两种类型(即未改变的和改变的)亚 单位的混合物进行变性和复性。例如，将如实施例7和8中所描述的 在两个重组大肠杆菌菌株中制备到的，并通过亲和层析在D-半乳糖 柱上纯化的recLTB和recLTB-GFP溶解在8M尿素中。或者，可以将 纯化的recLTB添加到含有recLTB-GFP的包含体中，并如上述进行 进一步处理。可以用0.1M Tris(pH7.4)对可溶于尿素的级分进行透 析，通过在4℃以10000g离心过滤10min将不可溶的材料除去。或 者，可以向该Tris缓冲液中添加0.3M D-半乳糖以促进五聚化。含有 五聚体复合物的上清液可以通过亲和层析(例如在固定化的D-半乳 糖上)进行进一步纯化，所述五聚体复合物含有嵌合的LTB和 LTB-GFP分子。可以通过如上述的半天然SDS-PAGE和Western印迹 对该蛋白质复合物的嵌合亚单位组成进行确认。如上述，可以利用 GMA-ELISA测定GM1-结合。
实施例10：LTB亚单位载体复合物的纯化
根据Uesaka et al.(Uesaka et al.(1994)Simple method of purification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin and cholera toxin using immobilized galactose.Microbial Pathogenesis 16：71-76)，在固定 化的D-半乳糖琼脂糖(Pierce，cat.no.20372)上通过亲和层析纯化同 型五聚体RecLTB5和LTB-亚单位载体复合物。
如实施例7中所描述的具有微生物LTB表达盒的大肠杆菌细胞 如实施例8中所述进行生长，通过在4℃以6500g离心过滤30min进 行收集，超声波降解，并如所述那样(Uesaka et al.，1994)进行进一 步处理。来自超声波降解的大肠杆菌的上清液被校准至50mM Tris-HCl pH7.4、0.2M NaCl、1mM EDTA和20mM焦亚硫酸钠 (JEAN)，并加载于安装在FPLC(BioRad，Veenendaal，The Netherlands)上的D-半乳糖柱上。根据本领域技术人员已知的标准程 序，用含有0.3M D-半乳糖或0.5M D-半乳糖的TEAN缓冲液洗涤所 述柱3遍。图6表示从大肠杆菌纯化recLTB的结果。收集级分，如 实施例3中所述通过GM1-ELISA测定GM1-结合LTB的存在。图6A 中所示的来自大肠杆菌的纯化的recLTB的结果示于图6B中。全部级 分对包含在GM1-结合复合物中的蛋白质都呈阳性，与GM1-ELISA 的结果相类似。在固定化的D-半乳糖上自大肠杆菌纯化recLTB的洗 脱图谱，以及通过GM1 ELISA分析在相应的级分中是否存在GM1- 结合活性的结果示于图6中。
然后，通过D-半乳糖层析，从来自P14(21)的块茎提取物的上清 液纯化蛋白质复合物(图7)。从图7A和B可以明显地看出也可以自 块茎纯化这种复合物。
然后，自P1(4+13)植物纯化嵌合蛋白质复合物。如在实施例2中 所述那样，通过将块茎材料研磨在提取缓冲液中，从P1(4+13)46块茎 材料制备提取物；将提取物于4℃以6500g离心30min以除去不可溶 的材料和淀粉颗粒(图8)。将上清液校准至TENA缓冲液条件并加 载于D-半乳糖柱上，并如上述进行进一步处理。从图8可以清楚地 看出，自级分5开始，蛋白质从所述柱上洗脱下来，在级分10-11具 有最大的吸光率。从GM1-ELISA也可以明显地看出，用VD12mAb 所检测的大多数LTB是处于级分5-15中，在级分10具有最大的吸光 率(图8B)。此外，这些级分对CSFV E2表位也呈阳性，这与修饰 的GM1 ELISA的结果相似，在该修饰的GM1 ELISA中的二抗是构 象性抗CSFV E2 mAb V3(图8C)，这表明在这种复合物中同时存在 LTB和LTB-CSFV E2，这与先前从Western印迹所获得的结果相一 致(图3)。
实施例11：LTB和LTB-VHSV G的嵌合复合物
按照如下制备LTB和来自病毒性出血性败血病病毒的尖钉糖蛋 白G来自病毒的遗传融合，所述尖钉糖蛋白与序列X66134(EMBL) 相似并由Lorenzen et al.(Molecular cloning and expression in Escherichia coli of the glycoprotein gene of VHS virus，and immunization of rainbow trout with the recombinant protein.J.Gen. Virol.74(1993)623-630)所发表公开：通过PCR扩增VHSV G序列和 引物VHSVGSmaI(5′-gatcgacccgggagatctaagtcatcagaccgtctgacttctggagaa ctgc-3′)和VHSVGBamHI(5′-tctggtggatccgcagatcactcaacgacctccgg-3′)引 入独特的BamHI位点。PCR条件为：96℃，30秒；60℃，30秒；72℃， 45秒；共30个循环，使用Pwo聚合酶。用BamHI和SamI剪切所得 的片段，并将其克隆到带有LTB合成基因的pLANTIGEN4的独特的 BamHI位点中。将所得的位于patatin启动子和胭脂碱合酶终止序列 控制下的基因序列命名为pLANTIGEN24(pL24)。用pL4和pL24对 马铃薯进行共转化，产生了众多的pL(4+24)植物。如上述，通过PCR 确认是否存在pL4和/或pL24基因构建体。对两种基因构建体都呈阳 性的植物能够形成块茎。收获块茎，并使用GM1-ELISA用于GM1- 结合复合物分析。VHSV G蛋白质在复合物中的存在通过用单克隆抗 体IP1H3、3F1H10和3F1A2温育进行确认(Lorenzen et al.，2000.Three monoclonal antibodies to the VHS virus glycoprotein：comparison of reactivity in relation to differences in immunoglobulin variable domain gene sequences.Fish & Shellfish immunology 10：129-142)。可以通过 半天然条件下在SDX-PAGE上跑样的块茎提取物的Western印迹并 使用抗LTB5 mAb VD12和1P1H3、3F1H10和3F1A对嵌合复合物进 行进一步表征。
实施例12：LTB和LTB-SVCV G的嵌合复合物
用寡核苷酸SVCVG1(5′-tctggtctcgagatccccatatttgttccatc-3′)和 SVCVG2(5′-gatcgaggatccaagtcatcaaactaaagaccgcatttcg-3′)扩增包含鲤春 病毒的完整的SVCV G基因(Genbank登录号：NC002803)的用于 与LTB遗传融合的BamHI/BglII片段。用BamHI和XhoI剪切所得的 片段，并将其克隆到编码LTB的pL4的BamHI/XhoI位点从而生成 (pL27)。将所得的位于块茎特异性patatin启动子的控制下的基因 (pLANTIGEN27)导入根癌农杆菌中用于马铃薯的转化。进行pL4 和pL27的共转化，如上述通过PCR评估转基因植物中是否存在两种 基因构建体。选择带有pL(4+27)基因构建体的转基因植物，并在温 室中生长至成熟。通过GM1-ELISA分析块茎对GM1-结合复合物的 蓄积，并利用特异性mAb分析块茎中是否存在SVCV G蛋白质。如 上述，进行半天然SDS-PAGE后，通过Western印迹显示出所述蛋 白质复合物的亚单位组成。
实施例13：嵌合复合物LTB和LTB-ClyIIA
将胸膜肺炎放线杆菌血清型9，参考菌株CV I13261，生长在含 有0.1％V-因子(NAD)的心脏灌注琼脂(Difco)中。通过蛋白酶 K/SDS裂解分离高分子量DNA，然后用苯酚/氯仿提取和沉淀所得基 因组DNA。来自胸膜肺炎放线杆菌血清型9的ClyIIA基因 (GenBank-EMBL登录号X61111)克隆自基因组DNA，所述基因组 DNA是通过使用寡核苷酸Cyto11(5′-gatccatggcaaaaatcactttgtcatc-3′)和 Cyto14(5′-atcggatccctattaagcggctctagctaattg-3′)进行PCR从血清型9菌 株分离到的。随后，也通过PCR将BamHI位点导入CIyIIA基因的 氨基末端，如所述用于在大肠杆菌中表达并生成pET-wiLTB-ClyIIA 那样，将BamHI剪切所得到的片段克隆到pET-wiLTB中。可以基于 IPEG的诱导，通过pET-wiLTB和pET-wiLTB-ClyIIA的共表达获得嵌 合复合物。或者，将基于pET-wiLTB-ClyIIA在大肠杆菌中的过表达 而获得的包含体与纯化的recLTB混合，用8M尿素溶解，并如所述 用Tris缓冲液进行透析以使得五聚体复合物复性。
实施例14：包含LTB、LTB-H5和LTB-N1的多价蛋白质复合物
制备了被优化用于在植物中表达的A型流感病毒亚型H5N1血凝 素(Genbank登录号AF028709)和神经氨酸酶(AF028708；Claas et al. (1998)Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus.Lancet 351(9101)，472-477)的合成基因。在H5 和N1序列的氨基和羧期末端引入了BamHI位点，通过将各个含有合 成的H5基因或N1基因的BamHI片段克隆到pLANTIGEN4基因构 建体的独特的BamHI位点进行遗传融合。如在实施例1中所描述的 那样，将所得的编码LTB-H5和LTB-N1融合蛋白质的基因克隆到 patatin启动子之后。进行LTB、LTB-H5和LTB-N1的共转化，并如 前所述通过PCR分析马铃薯植物是否存在各基因。可以分离对全部3 个表达盒而言都是转基因的植物，并使其在温室中进一步生长至成 熟。将块茎用于通过GM1-ELISA和利用VD12和H5和N1特异性 抗体的Western印迹来分析是否存在GM1-结合复合物。在另一个实 施方式中，制备了带有LTB-H5或LTB-N1的植物，并将其用于分析 各复合物的蓄积。可以自块茎纯化recLTB-H5和recLTB-N1，将其与 纯化的recLTB分别以1∶1∶3、1∶2∶2、1∶3∶1、2∶1∶2、2∶2∶1或3∶1∶1的比 例混合，用8M尿素溶解和变性并如在实施例9中所述那样进行进一 步处理以生成嵌合复合物。
表1
在转基因马铃薯块茎中产生的同型五聚体蛋白质复合物的摩尔 表达数据的平均值以及相应的标准差和协方差的比较，所述块茎带有 构建体pLANTIGEN4、12、13和15中的任一种(数据来自GM1 ELISA)。对数转化稳定变异数后，使用ANOVA分析构建体两两之 间的差异。表达水平以mM表示。最后一栏显示了标准差(Sd)。 构建体 平均表达(mM) Sd PL4 102.00 70.69 PL12 59.78 41.42 PL15 25.17 14.31 PL13 1.57 1.47
表2
带有嵌合蛋白质复合物的转基因马铃薯块茎的表达数据的比较， 所述复合物包含pL4以及pL13(数据来自GM1 ELISA)。按照实施 例4中所述，通过对分离自各植物的基因组DNA进行PCR来确定转 基因特性以及pL4和/或pL13基因构建体的存在(第2和3栏)。如所 述，比较使用VD12和V3mAb进行半天然Western印迹分析的结果 并如图2中所示筛选是否存在高分子量复合物(第4栏)来确定是否 存在嵌合体。当通过GM1-ELISA进行测定时，用每克鲜重块茎的 GM1-结合LTB5部分的微克数表示表达数据(第5栏)。为了进行比 较，仅包含pL4基因构建体的块茎含有平均10-15μg/g FW LTB5；而 pL13(17)，用于pL13基因构建体的最高表达子，具有少于1μg/g FW 块茎。
表2 植物 pL4 pL13 嵌合体 LTB5(μg/g FW) pL(4+13)8 + + 否 0.5 pL(4+13)15 + + 是 3.1 pL(4+13)16 + + 是 7.8 pL(4+13)19 + + 否 0.4 pL(4+13)39 + + 是 6.7 pL(4+13)46 + + 是 20.4 pL(4+13)60 + + 是 3.8 pL(4+13)64 + + 是 5.8
表3
带有嵌合蛋白质复合物的转基因马铃薯块茎的表达数据的比较， 所述复合物由pL4和pL12组成(数据来自GM1 ELISA)。按照实施 例5中所述，通过分离自各植物的基因组DNA的PCR来确定转基因 特性以及pL4和/或pL12基因构建体的存在(第2和3栏)。如所述， 比较使用VD12和3C9 mAb进行半天然Western印迹分析的结果并如 图2中所示筛选是否存在高分子量复合物来确定是否存在嵌合体。当 通过GM1-ELISA进行测定时，用每克鲜重块茎的GM1-结合部分的 微克数表示表达数据。
表3 植物 pL4 pL12 嵌合体 LTB5(μg/g FW) pL(4+12)19 + + 是 3.9 pL(4+12)20 + + 是 3.6 pL(4+12)23 + + 是 13.8 pL(4+12)25 + + 否 1.2 pL(4+12)31 + + 是 12.6 pL(4+12)32 + + 否 0.7 pL(4+12)41 + + 是 8.8 pL(4+12)42 + + 否 1.3 pL(4+12)46 + + 是 2.0 pL(4+12)51 + + 是 9.1 pL(4+12)52 + + 是 10.8 pL(4+12)57 + + 是 7.8 pL(4+12)62 + + 是 2.4 pL(4+12)65 + + 是 1.3
参考文献
Arakawa，T.，Chong，D.K.X.，Langridge，W.H.R.(1998)Efficacy of a food plant-based oral cholera toxin B subunit vaccine.Nature biotechnology 16：292-297.
Arakawa，T.，Chong，D.K.X.，Merrit，J.L.，Langridge，W.H.R.(1997) Expression of cholera toxin B subunit oligomers in transgenic potato plants.Transgenic Research 6：403-413.
Bakker，H.，Bardor，M.，Molthoff，J.W.，Gomord，V.，Elbers，I.，Stevens， L.H.，Jordi，W.，Lommen，A.，Faye，L.，Lerouge，P.，Bosch，D.(2001) Galactose-extended glycans of antibodies produced by transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 98： 2899-2904.
Bowen，J.C.，Nair，S.K.，Reddy，R.，Rouse，B.T.(1994)Cholera toxin acts as a potent adjuvant for the induction of cytotoxic T-lymphocyte responses with non-replicating antigens.Immunology 81：338-342.
Bradford，M.M.(1976)A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Analytical biochemistry72：248-254.
Dallas，W.S.，Falkow，S.(1980)Amino acid sequence homology between choleratoxin and Escherichia coli heat-labile toxin.Nature 288：499-501.
Dalsgaard，K.，Uttenthal，，Jones，T.D.，Xu，E.，Merryweather，A.， Hamilton，W.D.O.，Langeveld，J.P.M.，Boshuizen，R.S.，Kamstrup，S.， Lomonosoff，G.P.，Porta，C.，Vela，C.，Casal，J.I.，Meloen，R.H.，Rodgers， P.B.(1997)Plant-derived vaccine protects animals against a viral disease. Nature Biotechnology 15：248-252.
Dertzbaugh，M.T.，Elson，C.(1993)Comparative effectiveness of the cholera toxin B subunit and alkaline phosphatase as carriers for oral vaccines.Infection and Immunity 61：48-55.
Deen，N.D.，Van Holten，C.，Claassen，E.，Boersma，W.J.A.(1993) Peptide-induced memory(IgG)response，cross-reactive with native proteins，requires covalent linkage of a specific B cell epitope with a T cell epitope.European Journal Immunology 23：630-634.
Engelen，F.A.van，Molthoff，J.W.，Conner，A.J.，Nap，J.-P.，Pereira，A.， Stiekema，W.J.(1995)pBINPLUS：an improved plant transformation vector based on pBIN19.Transgenic Research 4：288-290.
Florack，D.E.A.，Dirkse，W.G.，Visser，B.，Heidekamp，F.，Stiekema，W.J. (1994)Expression of biologically active hordothionins in tobacco.Effects of pre- and pro-sequences at the amino and carboxyl termini of the hordothionin precursor on mature protein expression and sorting.Plant molecular Biology 24：83-96.
Hackett，C.J.，Dietzschold，B.，Gerhard，W，Ghrist，B.，Knorr，R.， Gillessen，D.，Melchers，F.(1983)The influenza virus site recognized by a murine helper T-cell specific for H1 strains：localization to nine amino acid sequence in the hemagglutinin molecule.Journal of Experimental Medicine 158：294-
Hackett，C.J.，Hurwitz，J.L.，Dietzschold，B.，Gerhard，W.(1985) Synthetic decapeptide of influenza virus hemagglutinin elicits helper T cells with the same fine recognition specificities as occur in response to whole virus.Journal of immunology 135：1391-1394.
Haq，T.A.，Mason，H.S.，Clements，J.D.，Arntzen，C.J.(1995)Oral immunization with a recombinant antigen produced in transgenic plants. Science 268：714-716.
Hein，M.B.，Yeo，T.-C.，Wang，F.，Sturtevant，A.(1995)Expression of cholera toxin subunits in plants.Annals of the New York Academy of Sciences 792：50-56.
Holmgren，J.(1973)Comparison of the tissue receptors for Vibrio cholera and Escherichia coli enterotoxins by means of gangliosides and natural cholera toxoid.Infection and Immunity 8：851-859.
Holmgren，J.，Lnnroth，I.，Svennerholm，L.(1973)Tissue receptor for cholera enterotoxin：postulated structures from studies with GM1 ganglioside and related glycolipids.Infection and Immunity 8：208-214. Holmgren，J.，Lnnroth，I.，Mánsson，J.，Svennerholm，L.(1975) Interaction of cholera toxin and membrane GM1 ganglioside of small intestine.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72：2520-2524.
Hulst，M.M.，Westra，D.F.，Wensvoort，G，Moormann，R.J.M.(1993) Glycoprotein E1 of hog cholera Virus expressed in insect cells protects Swine from hog cholera.Journal of Virology 67：5435-3542.
Jagusztyn-Krynicka，E.K.，Clark-Curtiss，J.E.，Curtiss III，R.(1993) Escherichia coli heat-labile toxin Subunit B fusions with Streptococcus sobrinus antigens expressed by Salmonella typhimurium oral vaccine strains：importance of the linker for antigenicity and biological activities of the hybrid protein.Infection and Immunity 61：1004-1015.
Kapusta，J.，Modelska，A.，Figlerowicz，M.，Pniewski，T.，Letellier，M.， Lisowa，O.，Yusibov，V.，Koprowski，H.，Plucienniczak，A.，Legocki，A.B. (1999)A plant-derived edible vaccine against hepatitis B virus.FASEB XX：1796-1799.
Langridge，W.H.R.(2000)Edible vaccines.Scientific American September，48-53.
Lauterslager，T.G.M.，Florack，D.E.A.，Van der Wal，T.J.，Molthoff,J.W.， Langeveld，J.P.M.，Bosch，D.，Boersma，W.J.A.，Hilgers，L.A.Th.(2001) Oral immunisation of and primed animals with trarisgenic potato tubers expressing LT-B.Vaccine 19：2749-2755.
Lazo，G.R.，Stein，P.A.，Ludwig，R.A.(1991)A DNA trartsformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. Biotechnology(NY)9：963-967.
Leong，J.，Vinal，A.C.，Dallas，W.S.(1985)Nucleotide sequence comparison between heat-labile toxin B-subunit cistrons from Escherichia coli of human and porcine origin.Infection and Immunity 48： 73-77.
Mason，H.S.，Arntzen，C.J.(1995)Transgenic plants as vaccine production systems.TIBTECH 13：388-392.
Mason，H.S.，Ball，J.M.，Shi，J.-J.，Jiang，X.，Estes，M.K.，Arntzen，C.J. (1996)Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 93：5335-5340.
Mason，H.S.，Haq，T.A.，clements，J.D.，Arntzen，C.J.(1998)Edible vaccine protects mice against Escherichia coli heat-labile enterotoxin (LT)：potatoes expressing a synthetic LT-B gene.Vaccine 16：1336-1343. Mason，H.S.，Lam，D.M.-K.，Arntzen，C.J.(1992)Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 89：11745-11749.
Mor，T.S.，Gómez-Lim，M.S.，Palmer，K.E.(1998)Perspective：edible vaccines，a concept coming of age.Trends in Microbiology 6：449-453. Munro，S.，Pelham，H.R.B.(1987)A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins.Cell 48：899-907.
Richter，L.，Kipp，P.B.(1999)Transgenic plants as edible vaccines. Current Topics in Microbiology and Immunology 240：159-176.
Sala，F.et al.(2003)Vaccine antigen production in transgenic plants： strategies，gene constructs and perspectives.Vaccine 21：803-808.
Sanger，F.，Nicklen，S.，Coulson，A.R.(1977)DNA sequencing with the chain-terminating inhibitors.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74：5463-5467.
Schouten，A.，Roosien，J.，Van Engelen，F.A.，De Jong，G.A.M.， Borst-Vrenssen，A.W.M.，Zilverentant，J.F.，Bosch，D.(1996)The C-terminal KDEl sequence increases the expression level of a single-chain antibody designed to be targeted to both the cytosol and the secretory pathway in transgenic tobacco.Plant Molecular Biology 30： 781-793.
Spangler，B.D.(1992)Structure and function of cholera toxin and the related Escherichia coli heat-labile enterotoxin.Microbiological Reviews 56：622-647.
Streatfield，S.J.，Jilka，J.M.，Hood，E.E.，Turner. D.D.，Bailey，M.R.， Mayor，J.M.，Woodard，S.L.，Beifuss，K.K.，Horn，M.E.，Delaney，D.E.， Tizard，I.R.，Howard，J.A.(2001)Plant-based vaccines：unique advantages.Vaccine 19：2742-2748.
Tacket，C.O.，Mason，H.S.(1999)A review of oral vaccination with transgenic vegetables.Microbes and Infection 1：777-783.
Tacket，C.O.，Mason，H.S.，Losonsky，G.，Clements，J.D.，Levine，M.M.， Arntzen，C.J.(1998)Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato.Nature Medicine 4： 607-609.
Thanavala，Y.，Yang，Y.-F.，Lyons，P.，Mason，H.S.，Arntzen，C.(1995) Immunogenicity of transgenic plant-derived hepatitis B surface antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 92： 3358-3361.
Towbin，H.，Staehelin，T.，Gordon，J.(1979)Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets：procedures and some applications.Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 76：4350-5354.