蛇床子总香豆素作为治疗银屑病药物中的应用 【技术领域】
本发明涉及一种蛇床子提取物及其用途，尤其是涉及一种蛇床子总香豆素及其作为治疗银屑病的新用途。背景技术
银屑病，俗称牛皮癣，是一种常见、多发的慢性皮肤疾病，以患部表面覆盖银白色鳞屑为主征，好发于头皮、躯干及四肢伸侧，得此病者异常痛苦，严重影响正常的工作学习和生活。近年来该病的发病较以往有明显增高，病情亦趋向顽固，是世界卫生组织及皮肤研究领域重点研究和防治的疾病之一。该病病因至今尚未完全清楚。一般认为与遗传、感染、免疫、代谢、内分泌、精神等多种因素有关。目前，银屑病的治疗主要以药物为主，治疗的方法虽多，但大多只能达到近期临床效果，复发难以抑制。西药多采用皮质激素或细胞免疫抑制剂(参见《药学通报》1985·20(9)《外用皮质激素药物进展》)。这类药物虽有较好的近期疗效，但它们存在的最大缺点是长期使用能使皮肤的表皮和真皮变薄，并能引起毛细血管扩张及成瘾性等严重毒副反应，并发症多，适应范围小，且价格也比较昂贵，不是治疗银屑病的方向。
中药蛇床子在古代不少医著中都有记载，临床应用较多的是取其燥湿祛风和杀虫作用而运用于外科、妇科、皮肤科及五官科，用以治疗疮疡癣疥，阴囊湿痒等疾患，但尚未见用蛇床子之提取物——总香豆素用于治疗银屑病的报道。发明内容
本发明的目的在于提供一种从蛇床子中提取的蛇床子总香豆素及其作为制备治疗银屑病地药中的应用，它具有疗效好、副作用小的特点。
本发明涉及的蛇床子总香豆素是从伞形科蛇床属植物蛇床(Cnidium monnieri(L.)cusson)的果实中提取出来的有效部位，主要化学成分为香豆素，在提取物中占85％以上，含6种香豆素成分，其中以蛇床子素(VI)含量最高，一般占总香豆素的90％以上，它是蛇床子有效部位中的主要活性成分，其他5种香豆素均为呋喃骈香豆素，它们分别是花椒毒酚(I)、花椒毒素(II)、异虎耳草素(III)、佛手柑内酯(IV)和欧芹属素乙(V)。
本发明所述的总香豆素中的各种香豆素在高效液相色谱法中可得到分离并与各单体的保留时间一致。6种香豆素精制品的紫外吸收图谱见图1，6种香豆素精制品的紫外吸收系数见表1，其中，蛇床子素的最大吸收λmax在322nm(1gε＝3.9)，而呋喃骈香豆素的花椒毒酚的λmax在250nm(1gε＝4.25)，花椒毒素的λmax在248nm(1gε＝4.4)，异虎耳草素的λmax在268nm(1gε＝4.26)，佛手柑内酯的λmax在249nm(1gε＝4.38)，欧芹属素乙的λmax在249nm(1gε＝3.65)。
本发明所述的总香豆素的紫外吸收光谱是根据紫外吸收光谱的可加和性原理由所述6种香豆素的紫外吸收光谱的总和而来，受各组分及其相对含量的影响，测定蛇床子总香豆素在乙醇溶液中的吸收光谱见图1。本发明研究过程中测定了11个批号的蛇床子总香豆素，结果显示，各个不同批号的紫外吸收光谱基本一致，在322nm(319～326nm)左右有最大吸收，吸收峰较为平坦，其他在250nm、255nm、265nm也分别有吸收峰。
本发明涉及蛇床子总香豆素作为制备治疗银屑病的药中的应用。
本发明涉及治疗银屑病的药系单味中药，其特征在于该中药中含有5～35％(重量)的蛇床子总香豆素和可药用载体和/或赋形剂。
本发明涉及的蛇床子总香豆素的制备方法如下：将蛇床子果实粉碎后，用80～95％乙醇，在60～80℃下温度提取两小时，滤出滤液，药渣再加80～95％％乙醇，再提取两次，过滤，合并三次滤液，常温放置至少16小时以上，滤出经放置后析出的绿色絮状物和无定形结晶，滤液浓缩成小体积，溶液常温放置16小时以上后即析出绿色沉淀物，滤出干燥即得。
1、对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响
取雌性昆明种小鼠60只，体重27±2g，先给小鼠腹腔注射乙烯雌酚，每次0.2mg，每日一次，连续3天，使所有小鼠均处于雌激素期，第4天开始将小鼠随机分为4组，分别灌胃给予蛇床子总香豆素150mg/kg和75mg/kg，蒽啉15mg/kg，生理水15ml/kg，每天一次，连续3天，排除细胞有丝分裂的日夜节律对实验结果的影响，最后一次给药统一于上午8时进行，上午9时分别于各鼠注射秋水仙碱2ml/kg，使纺锤体无法形成，有丝分裂停止于M期的中期而便于计数。下午2时处死小鼠，取阴道标本以10％福尔马林液固定，并进行组织切片，随后用光学显微镜观察有丝分裂，计数300个基底细胞中的有丝分裂数，最后计算出每100个基底细胞的有丝分裂数，即为有丝分裂指数。
试验结果见表1，它显示蛇床子总香豆素具有明显的抑制小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的作用。
表1 组 别给药量(ml/kg)动物数(只) 有丝分裂指数蛇床子总香豆素 150 15 11.3±2.0*蛇床子总香豆素 75 15 19.8±2.8**蒽啉 15 15 13.4±2.1*生理盐水 15ml 15 22.2±2.4
注：与生理盐水组比较，*P＜0.01，**P＜0.0 5
2、由蛇床子总香豆素制成的软膏对大鼠尾部鳞片表皮颗粒层
形成的影响
取体重为180±15g的SD大鼠40只，随机分为4组，分别于大鼠尾部涂抹蛇床子总香豆素软膏0.3g/鼠，一组每天一次，另一组每天二次；蒽啉软膏0.3g/鼠，每天二次；蛇床子总香豆素软膏空白基质0.3g/鼠，每天二次。连续涂药20天后处死动物，取距根部约1.5cm处尾部背面皮肤一长条，作常规组织切片，于光学显微镜下进行观察，凡鳞片表皮有连续成行的颗粒细胞者，车为有颗粒层形成的鳞片，计数并算出每只大鼠尾部每100个鳞片中有颗粒层形成的鳞片数，并比较组间差异。结果见表2，它显示蛇床子总香豆素软膏能明显增加大鼠尾部皮肤鳞片中有颗粒层形成的鳞片数。
表2 组 别 给药量 (g/鼠) 动物数 (只) 每100个鳞片中有 颗粒层形成的鳞片 数(X±SD)蛇床子总香豆素软膏 0.3 10 25.36±9.28*蛇床子总香豆素软膏*** 0.3 10 18.45±8.78**蒽啉 0.3 10 21.76±8.51*蛇床子总香豆素软膏空白基质 0.3 10 10.87±5.64
注：***每天涂药一次；*P＜0.01，**P＜0.05
3、对大鼠被动皮肤过敏反应(PCA)的影响
取SD大鼠40只，体重180±10g，先将各鼠背部脱毛，然后于皮内注射按1∶10稀释的抗血清0.1ml/点，每鼠注射二点。注射后将动物随机分为4组，分别灌服蛇床子总香豆素75ml/kg，150ml/kg；蒽啉15ml/kg；蒸馏水15ml/kg；每日一次，连续3次，注射抗血清48小时后，进行抗原攻击分别于各鼠尾静脉注射0.5％伊文思蓝溶液1ml，20分钟后处死动物，翻转背部皮肤，并剪下蓝斑皮片，以5ml丙酮生理盐水溶液(7∶3v/v)浸泡，24小时后离心，取上清夜，以590m测定光密度，按以下公式计算抑制百分率。结果见表3，它表明蛇床子总香豆素对大鼠被动皮肤过敏反应具有较强的抑制作用。
表3 组 别 给药量 (ml/kg) 动物数 (只) 光 密 度 (O.D) 抑制率 (％)蛇床子总香豆素 150 15 0.029±0.018* 67.42蛇床子总香豆素 75 15 0.045±0.027** 49.44蒽啉 15 15 0.043±0.25* 51.69生理盐水 15ml 15 0.089±0.41
注：与生理盐水组比较，*P＜0.01，**P＜0.05
4、蛇床子总香豆素软膏对巴豆油所致小鼠耳肿胀的影响
取昆明种小鼠80只，体重27±2g，随机分为4组，分别于各鼠双侧耳廓涂搽巴豆油合剂50ul，该合剂由2％的巴豆油、5％的水、20％的乙醇和73％的乙醚组成。0.5小时后，于各鼠左侧耳廓分别涂敷蛇床子总香豆素软膏0.15g/耳和0.3g/耳，蛇床子总香豆素软膏空白基质0.3g/耳，蒽啉软膏0.3g/耳。4小时后处死所有动物，用直径为9mm的打孔器沿耳朵边缘取耳片一块称重，以各鼠左右耳片重量差为肿胀度，并比较组间差异。结果见表4，它表明蛇床子总香豆素软膏对由巴豆油所致的大鼠耳肿胀具有较强的抑制作用。
表4 组 别给药量(g/耳)动物数(只)耳片重量差(mg)蛇床子总香豆素软膏 0.3 20 1.52±0.76*蛇床子总香豆素软膏 0.15 20 0.93±0.68**蒽啉 0.3 20 0.95±0.71**蛇床子总香豆素软膏空白基质 0.3 20 0.49±0.25
注：与基质(对照)组比较；*P＜0.01，**P＜0.05
5、蛇床子总香豆素软膏对鸡蛋清所致大鼠足肿胀的影响
取SD大鼠50只，体重150±10g，随机分为5组，分别为蛇床子总香豆素软膏(含10％的蛇床子总香豆)2组，按0.15g/足和0.3g/足涂药，蛇床子总香豆素软膏空白基质1组，按0.3g/足涂敷，蒽啉软膏1组，按0.3g/足涂药；对照1组，不涂任何药物。4小时后处死所有动物，用直径为9mm的打孔器沿耳朵边缘取耳片一块称重，以各鼠左右耳片重量差为肿胀度，并比较组间差异。
将大鼠分组后分别测定同侧足体积，随后于足跖；注射10％鸡蛋清0.2ml/足，注射后立即涂敷上述药物，半小时后再重复涂药一次，然后分别于1、2、4、6小时测定各鼠足体重，并计算肿胀度，进行组间比较，结果见表5，它表明蛇床子总香豆素软膏对由鸡蛋清所致的大鼠足肿胀具有较强的抑制作用。
表5 组 别 给药量 (g/耳) 动物数 (只) 肿 胀 度 1h 2h 4h 6h蛇床子总香豆素软膏 0.15 10 0.401±0.210* 0.386±0183* 0.371±0167* 0.354±0152*蛇床子总香豆素软膏 0.3 10 0.324±0.181** 0.308±0.168** 0.290±0.146** 0.290±0.146**蒽啉 0.3 10 0.408±0.210* 0.391±0.209* 0.375±0.189** 0.351±0.165蛇床子总香豆素软膏基质 0.3 10 0.584±0.205 0.579±0.198 0.554±0.186 0.528±0.181对照 / 10 0.612±0.207 0.608±0.214 0.591±0.195 0.486±0.104
注：与对照组比较：**P＜0.01，*P＜0.05
6、蛇床子总香豆素软膏止痒作用观察
选用体重250±15g豚鼠50只，随机分为5组，分别为蛇床子总香豆素软膏(含10％的蛇床子总香豆)2组，按0.15g/足和0.3g/足涂药，蛇床子总香豆素软膏基质1组，按0.3g/足涂敷，蒽啉软膏1组，按0.3g/足涂药；对照1组，不涂任何药物。
先将各鼠右足脱毛，随后分别涂药一次，次日将各鼠脱毛处用1砂纸擦伤至有渗液但不出血为止，然后再涂药一次，10分钟后，开始在创面处滴0.01％磷酸组织胺0.05ml/足，此后每隔3分钟依0.01％、0.02％、0.03％……递增浓度，每次均滴0.05ml/足，直至出现豚鼠回头舔创伤处，并以最后出现豚鼠回头舔足时所给予的磷酸组织胺总量为致痒阈，记录并比较各组的致痒阈。结果见表6，由表可见蛇床子总香豆素软膏能显著提高由磷酸组织胺对豚鼠的致痒阈，表明其具有明显的止痒作用。
表6 组 别给药量(g/足)动物数(只) 致痒阈蛇床子总香豆素软膏 0.15 10 142.75±120.15*蛇床子总香豆素软膏 0.3 10 206.25±111.60**蒽啉软膏 0.3 10 158.50±131.48*蛇床子总香豆素软膏基质 0.3 10 38.75±20.14对照 / 10 37.50±25.00
注：与对照组比较：**P＜0.01，*P＜0.05
7、临床疗效观察
观察方法：采用同体对比法，一侧肢体涂敷总香豆素含量为10％的蛇床子总香豆素软膏，另一侧涂敷蒽啉软膏(阳性对照)，每日涂药1～2次，连续用药30天，在使用上述药物期间，一律停用与本病治疗有关的其它药物。
疗效评定标准：根据卫生部有关皮肤病临床疗效评定标准，采用四级评分评定治疗效果。
治疗结果：经连续用药30天后，临床治愈率达60％，总有效率达96.7％，详见表7。
表7 药 物病例数 痊愈 显效 有效 无效 总有效率蛇床子总香豆素软膏 30 18 9 2 1 96.7％蒽啉软膏 30 12 16 2 0 100％
8、小鼠的急性毒性试验
内服试验：选用昆明种小鼠，体重19±1g，雌雄各半，禁食16小时后，随机分为10组，每组10只，以1∶0.75组间比确定各组动物给药量，然后按各鼠体重一次灌胃给药，每鼠给药容积为0.8ml，给药后连续观察14天，记录动物一般状况，毒性反应及死亡数，用Bliss法计算出LD50值及95％可信限，其中雄性小鼠的LD50＝463.90mg/kg，95％可信限为406.16～529.86mg/kg；雌性小鼠的LD50＝409.85mg/kg，95％可信限为357.02～470.50mg/kg，存活动物一般状况良好、食欲正常，体重均有不同程度的增长。
外用试验：
(1)蛇床子软膏家兔破损皮肤急性毒性试验
取家兔16只，分别于躯干背部脱毛150cm2，脱毛24小时后，在确认脱毛处无异常变化后，用1#铁砂纸直接在脱毛处轻轻摩擦，使其造成擦伤，直至组织液渗出，但以不出血为度。破损皮肤制备后，将动物随机分为四组(雌雄各半)，三组分别涂敷含10％、20％、30％蛇床子总香豆素的软膏3g/兔，另一组涂敷蛇床子软膏的空白基质5g/兔，各兔涂药后用油纸及纱布固定，24小时后除去受试物，并每日观察动物反应，记录动物死亡数及出现的各种反应，连续观察7天，死亡动物及时进行尸检，发现异常者进行组织形态学镜检。
结果显示，四组动物无一死亡，涂药后动物一般状况良好，活动及行为无明显异常变化，食欲正常，粪便无异常。
(2)蛇床子软膏家兔完整皮肤急性毒性试验
取家兔16只，被试药物及实验方法同破损皮肤急生毒性试验(除不制备破损皮肤外)。
结果显示，四组动物无一死亡，涂药后动物一般状况良好，活动及行为无明显异常变化，食欲正常，粪便无异常。
小结
蛇床子软膏经家兔完整皮肤和破损皮肤用10％、20％和30％浓度涂敷后，未出现动物死亡及毒性反应。
9、大鼠的长期毒性试验
①大鼠长期毒性试验：分高(250mg/kg)、中(158mg/kg)、低(100mg/kg)三个剂量组及空白组，连续给药90天，结果，除高剂量组给药组动物平均体重增长较其它三组缓慢，先后出现2只动物死亡外，其作动物一般状况良好，血液常规，生化指标检测均未见异常，主要脏器系统及组织形态学镜亦未见异常变化。
从以上药效学研究的结果表明，本发明具有以下的优点：
(1)本发明具有显著的抑制小鼠阴道上皮细胞的有丝分裂的作用。
(2)本发明能明显增加大鼠尾部皮肤鳞片中有颗粒层形成的鳞片数；对大鼠被动皮肤过敏反应具有较强的抑制作用。
(3)本发明具有显著抑制由巴豆油引致的小鼠耳肿胀作用或由鸡蛋清引致的大鼠足肿胀作用。
(4)本发明能显著提高由磷酸组织胺对豚鼠的致痒阈，表明具有显著的止痒作用。
(5)上述研究结果证实蛇床子总香豆素具有促进角质还原、抗炎、抗过敏、抗变态反应和抑菌作用，同时还有显著的。
(6)本发明的蛇床子总香豆素安全无毒，药理作用强，成分清楚，但又非单一成分，既体现了现代医药的特点，又不失中医传统理论复合成分的特色，既可内服，也可外用。
(7)本发明针对银屑病病理生理特点作用，可以改变银屑病的病理变化，改善临床症状，经临床对寻常型银屑病患者治疗结果，未发现有毒副作用，起效快、疗效高、不良反应少，治愈率达60％，总有效率达96.7％，且同时具有对人体的整体调整作用。
(8)本发明物质来源丰富、廉价、成本低、作为原料药可以制成口服剂型(包括片剂、胶囊、口服液)、注射剂型、膏剂、霜剂、栓剂、酊剂等多种剂型。具体实施方式
以下具体试验及实施例将进一步说明本发明。
实施例1
将蛇床子1kg磨成粗粉后，置于提取器中，加6倍于蛇床子重量的85％乙醇，在80℃下温度提取两小时，滤出滤液，药渣再加3000ml的85％乙醇再提取两次，每次提取2小时，过滤，合并三次滤液，常温放置之度24小时，滤出析出的色素沉淀。滤液在80℃温度下减压浓缩回收乙醇至溶液的乙醇浓度为45％后，即停止浓缩，溶液常温放置24小进后即析出绿色沉淀物，滤出，于60℃温度干燥，即得，得率1.2％。
实施例2
将蛇床子1kg磨成粗粉后，置于提取器中，加5倍于蛇床子重量的95％乙醇，在60℃下温度提取两小时，滤出滤液，药渣再加3000ml的95％乙醇再提取两次，每次提取2小时，过滤，合并三次滤液，常温放置24小时，滤出析出的色素沉淀。滤液在80℃温度下减压浓缩回收乙醇至溶液乙醇浓度为45％后，即停止浓缩，溶液常温放置20小时后即析出绿色沉淀物，滤出，于80℃温度干燥，即得，得率1.2％。
实施例3
将用实施例1的制备方法所得的蛇床子总香豆素与适宜的基质制成膏状外用软膏剂，系水包油型制剂，配方为：蛇床子总香豆素100g，硬脂酸80g，单甘酯100g，白凡士林80g，甘油160g，吐温-80 60g，水280g，甘油+水(4∶10)加至1000g。其性状及外观应均匀、细腻，涂于皮肤上无不良刺激。
实施例4
将实施1的制备方法所得的蛇床子总香豆素100g，加适量淀粉稀释，以乙醇润湿，混匀后制软材，制颗粒，干燥，加适量润滑剂，压制成1000片，每片含0.1g蛇床子总香豆素。常规包衣，打光。
实施例5
将实施2制备方法所得的蛇床子总香豆素300g，加适量淀粉稀释，以乙醇润湿，混匀后制软材，制颗粒，干燥，加适量润滑剂，压制成1000片，每片含0.3g蛇床子总香豆素。常规包衣，打光。
实施例6
将实施2制备方法所得的蛇床子总香豆素250g，干燥后磨细粉，过筛，装入胶囊，共制胶囊1000粒，每粒含蛇床子总香豆素250mg。
实施例7
将实施1制备方法提到的蛇床子总香豆素10g，加苯甲醇10ml，吐温-80 10ml，加注射用水至2000ml，过滤，灌封，灭菌，分装成10mg/2ml注射液入药瓶。每ml含总香豆素5mg。
实施8
将实施2制备方法提到的蛇床子总香豆素20g，加丙二醇200ml，苯甲醇20ml，加注射用水至2000ml，过滤，灌封，灭菌，分装成20mg/2ml注射液。每ml含总香豆素10mg。