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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710128586.3 (22)申请日 2017.03.06 (71)申请人 刘富岗 地址 450000 河南省郑州市金水区岗杜街 181号楼27号 (72)发明人 刘富岗 (74)专利代理机构 北京华仲龙腾专利代理事务 所(普通合伙) 11548 代理人 黄玉珏 (51)Int.Cl. C08B 37/00(2006.01) A61K 31/715(2006.01) A61K 31/702(2006.01) A61K 8/73(2006.01) A61K 8/60(200。
2、6.01) A61Q 19/08(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A61P 37/04(2006.01) (54)发明名称 一种千金子多糖及低聚糖的制备方法及应 用 (57)摘要 本发明涉及一种千金子多糖及低聚糖的制 备方法及应用， 将机械压榨法与超声提取法联合 用于千金子多糖及低聚糖的一体化制备工艺， 可 有效解决千金子多糖及低聚糖的制备； 本发明可 有效解决千金子多糖I和千金子多糖在制备增 强免疫力的药物和保健品中的应用问题， 千金子 低聚糖在制备抗氧化的药物、 保健品及化妆品中 的应用问题。 权利要求书3页 说明书9页 CN 106883305 A 2017.0。
3、6.23 CN 106883305 A 1.一种千金子多糖及低聚糖的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： (1)取千金子药材， 去种皮， 所得千金子种皮A备用， 种仁61机械压榨法去油， 得千金 子霜B； 将千金子种皮A和千金子霜B加入千金子药材重量6.8-7.9倍量的石油醚， 静置4.2h， 闪式提取2.2min， 室温条件下超声提取31min， 过滤， 得千金子药渣C， 将千金子药渣C挥发去 石油醚， 晾干， 加千金子药材重量7.1-15.6倍的体积浓度为73-77的乙醇， 浸泡7.3h， 35 -51回流提取38min-64min， 过滤， 得提取液和千金子药渣D， 千金子药渣D备用。
4、， 提取液 43-56减压回收乙醇， 59减压浓缩至比重为1.07-1.10的浸膏， 依次经过硅藻土柱、 大 孔吸附树脂柱、 活性炭柱、 反相硅胶柱， 得洗脱液， 最后将所得洗脱液减压浓缩， 冷冻干燥即 得千金子低聚糖； (2)在步骤(1)中的千金子药渣D中加入千金子药材重量7-12倍量的水， 86超声提取 67min， 过滤， 得第一滤液和千金子药渣E； 在千金子药渣E中加入千金子药材重量5-9倍量的 水， 83超声提取56min， 过滤， 得第二滤液， 合并第一滤液和第二滤液， 减压浓缩至比重为 1.06-1.15的浸膏， 用硅藻土过滤， 滤液依次用sevage法脱蛋白， 过氧化氢法脱色，。
5、 得千金子 多糖溶液， 千金子多糖溶液依次通过纤维素层析柱、 凝胶柱， 得洗脱流份千金子多糖I和千 金子多糖， 冷冻干燥， 即得千金子多糖I和千金子多糖； 所述的大孔吸附树脂为HPD-600 型大孔吸附树脂或SP-825型大孔吸附树脂， 反相硅胶为十八烷基硅烷键合硅胶或辛烷基硅 烷键合硅胶， 纤维素为DEAE-52纤维素， 凝胶为Sephacry1 S-200凝胶。 2.根据权利要求1所述的千金子多糖及低聚糖的制备方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： (1)取千金子药材， 去种皮， 所得千金子种皮A备用， 种仁61机械压榨法去油， 得千金 子霜B； 将千金子种皮A和千金子霜B加入千金子药材重。
6、量7.9倍量的石油醚， 静置4.2h， 闪式 提取2.2min， 室温条件下超声提取31min， 过滤， 得千金子药渣C， 将千金子药渣C挥发去石油 醚， 晾干， 加千金子药材重量15.6倍的体积浓度为77的乙醇， 浸泡7.3h， 51回流提取 64min， 过滤， 得提取液和千金子药渣D， 千金子药渣D备用， 提取液56减压回收乙醇， 59 减压浓缩至比重为1.10的浸膏， 依次经过硅藻土柱、 HPD-600型大孔吸附树脂柱、 活性炭柱、 十八烷基硅烷键合硅胶柱， 得洗脱液， 最后将所得洗脱液减压浓缩， 冷冻干燥即得千金子低 聚糖； (2)在步骤(1)中的千金子药渣D中加入千金子药材重量12。
7、倍量的水， 86超声提取 67min， 过滤， 得第一滤液和千金子药渣E； 在千金子药渣E中加入千金子药材重量9倍量的 水， 83超声提取56min， 过滤， 得第二滤液， 合并第一滤液和第二滤液， 减压浓缩至比重为 1.15的浸膏， 用硅藻土过滤， 滤液依次用sevage法脱蛋白， 过氧化氢法脱色， 得千金子多糖 溶液， 千金子多糖溶液依次通过DEAE-52纤维素层析柱、 Sephacry1 S-200凝胶柱， 得洗脱流 份千金子多糖I和千金子多糖， 冷冻干燥， 即得千金子多糖I和千金子多糖。 3.根据权利要求1所述的千金子多糖及低聚糖的制备方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： (1)取千。
8、金子药材， 去种皮， 所得千金子种皮A备用， 种仁61机械压榨法去油， 得千金 子霜B； 将千金子种皮A和千金子霜B加入千金子药材重量6.8倍量的石油醚， 静置4.2h， 闪式 提取2.2min， 室温条件下超声提取31min， 过滤， 得千金子药渣C， 将千金子药渣C挥发去石油 醚， 晾干， 加千金子药材重量7.1倍的体积浓度为73的乙醇， 浸泡7.3h， 35回流提取 权利要求书 1/3 页 2 CN 106883305 A 2 38min， 过滤， 得提取液和千金子药渣D， 千金子药渣D备用， 提取液43减压回收乙醇， 59 减压浓缩至比重为1.07的浸膏， 依次经过硅藻土柱、 SP-8。
9、25型大孔吸附树脂柱、 活性炭柱、 辛烷基硅烷键合硅胶柱， 得洗脱液， 最后将所得洗脱液减压浓缩， 冷冻干燥即得千金子低聚 糖； (2)在步骤(1)中的千金子药渣D中加入千金子药材重量7倍量的水， 86超声提取 67min， 过滤， 得第一滤液和千金子药渣E； 在千金子药渣E中加入千金子药材重量5倍量的 水， 83超声提取56min， 过滤， 得第二滤液， 合并第一滤液和第二滤液， 减压浓缩至比重为 1.06的浸膏， 用硅藻土过滤， 滤液依次用sevage法脱蛋白， 过氧化氢法脱色， 得千金子多糖 溶液， 千金子多糖溶液依次通过DEAE-52纤维素层析柱、 Sephacry1 S-200凝胶柱。
10、， 得洗脱流 份千金子多糖I和千金子多糖， 冷冻干燥， 即得千金子多糖I和千金子多糖。 4.根据权利要求1所述的千金子多糖及低聚糖的制备方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： (1)取千金子药材， 去种皮， 所得千金子种皮A备用， 种仁61机械压榨法去油， 得千金 子霜B； 将千金子种皮A和千金子霜B加入千金子药材重量7.3倍量的石油醚， 静置4.2h， 闪式 提取2.2min， 室温条件下超声提取31min， 过滤， 得千金子药渣C， 将千金子药渣C挥发去石油 醚， 晾干， 加千金子药材重量12.4倍的体积浓度为75的乙醇， 浸泡7.3h， 43回流提取 51min， 过滤， 得提取液和千金。
11、子药渣D， 千金子药渣D备用， 提取液50减压回收乙醇， 59 减压浓缩至比重为1.09的浸膏， 依次经过硅藻土柱、 SP-825型大孔吸附树脂柱、 活性炭柱、 反相硅胶为十八烷基硅烷键合硅胶柱， 得洗脱液， 最后将所得洗脱液减压浓缩， 冷冻干燥即 得千金子低聚糖； (2)在步骤(1)中的千金子药渣D中加入千金子药材重量10倍量的水， 86超声提取 67min， 过滤， 得第一滤液和千金子药渣E； 在千金子药渣E中加入千金子药材重量7倍量的 水， 83超声提取56min， 过滤， 得第二滤液， 合并第一滤液和第二滤液， 减压浓缩至比重为 1.11的浸膏， 用硅藻土过滤， 滤液依次用sevage。
12、法脱蛋白， 过氧化氢法脱色， 得千金子多糖 溶液， 千金子多糖溶液依次通过DEAE-52纤维素层析柱、 Sephacry1 S-200凝胶柱， 得洗脱流 份千金子多糖I和千金子多糖， 冷冻干燥， 即得千金子多糖I和千金子多糖。 5.根据权利要求1所述的千金子多糖及低聚糖的制备方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： (1)取千金子药材， 去种皮， 所得千金子种皮A备用， 种仁61机械压榨法去油， 得千金 子霜B； 将千金子种皮A和千金子霜B加入千金子药材重量6.8倍量的石油醚， 静置4.2h， 闪式 提取2.2min， 室温条件下超声提取31min， 过滤， 得千金子药渣C， 将千金子药渣C挥发。
13、去石油 醚， 晾干， 加千金子药材重量15.6倍的体积浓度为75的乙醇， 浸泡7.3h， 35回流提取 51min， 过滤， 得提取液和千金子药渣D， 千金子药渣D备用， 提取液56减压回收乙醇， 59 减压浓缩至比重为1.09的浸膏， 依次经过硅藻土柱、 HPD-600型大孔吸附树脂柱、 活性炭柱、 辛烷基硅烷键合硅胶， 得洗脱液， 最后将所得洗脱液减压浓缩， 冷冻干燥即得千金子低聚 糖； (2)在步骤(1)中的千金子药渣D中加入千金子药材重量7倍量的水， 86超声提取 67min， 过滤， 得第一滤液和千金子药渣E； 在千金子药渣E中加入千金子药材重量5倍量的 水， 83超声提取56min。
14、， 过滤， 得第二滤液， 合并第一滤液和第二滤液， 减压浓缩至比重为 权利要求书 2/3 页 3 CN 106883305 A 3 1.15的浸膏， 用硅藻土过滤， 滤液依次用sevage法脱蛋白， 过氧化氢法脱色， 得千金子多糖 溶液， 千金子多糖溶液依次通过DEAE-52纤维素层析柱、 Sephacry1 S-200凝胶柱， 得洗脱流 份千金子多糖I和千金子多糖， 冷冻干燥， 即得千金子多糖I和千金子多糖。 6.权利要求1或2-5中任意一项所述方法制备的千金子多糖I和千金子多糖在制备增 强免疫力的药物和保健品中的应用。 7.权利要求1或2-5中任意一项所述方法制备的千金子低聚糖在制备抗氧化。
15、的药物、 保 健品及化妆品中的应用。 权利要求书 3/3 页 4 CN 106883305 A 4 一种千金子多糖及低聚糖的制备方法及应用 技术领域 0001 本发明涉及医药领域， 特别是涉及一种千金子多糖及低聚糖的制备方法及应用。 背景技术 0002 千金子为大戟科植物续随子Euphorbia lathyris L.的干燥成熟种子， 具有泻下 逐水， 破血消癥的功效， 临床外用疗癣蚀疣， 还用于二便不通， 水肿， 痰饮， 积滞胀满， 血瘀经 闭， 外治顽癣， 赘疣。 现对其有效成分的研究主要涉及脂肪油、 二萜类、 挥发油、 香豆素、 甾类 等成分， 对其中多糖及低聚糖的研究尚未见报道， 尤其。
16、是如何解决一体化高效制备千金子 多糖及低聚糖也未见有公开报道。 发明内容 0003 针对上述情况， 为克服现有技术之缺陷， 本发明的目的就是提供一种千金子多糖 及低聚糖的制备方法， 可有效解决千金子多糖及低聚糖的制备及千金子多糖在制备增强免 疫力的药物和保健品中的应用和千金子低聚糖在制备抗氧化的药物、 保健品及化妆品中的 应用的问题。 0004 本发明解决的技术方案是， 一种千金子多糖及低聚糖的制备方法， 包括以下步骤： 0005 (1)取千金子药材， 去种皮， 所得千金子种皮A备用， 种仁61机械压榨法去油， 得 千金子霜B； 将千金子种皮A和千金子霜B加入千金子药材重量6.8-7.9倍量的。
17、石油醚， 静置 4.2h， 闪式提取2.2min， 室温条件下超声提取31min， 过滤， 得千金子药渣C， 将千金子药渣C 挥发去石油醚， 晾干， 加千金子药材重量7.1-15.6倍的体积浓度为73-77的乙醇， 浸泡 7.3h， 35-51回流提取38min-64min， 过滤， 得提取液和千金子药渣D， 千金子药渣D备用， 提取液43-56减压回收乙醇， 59减压浓缩至比重为1.07-1.10的浸膏， 依次经过硅藻 土柱、 大孔吸附树脂柱、 活性炭柱、 反相硅胶柱， 得洗脱液， 最后将所得洗脱液减压浓缩， 冷 冻干燥即得千金子低聚糖； 0006 (2)在步骤(1)中的千金子药渣D中加入千。
18、金子药材重量7-12倍量的水， 86超声 提取67min， 过滤， 得第一滤液和千金子药渣E； 在千金子药渣E中加入千金子药材重量5-9倍 量的水， 83超声提取56min， 过滤， 得第二滤液， 合并第一滤液和第二滤液， 减压浓缩至比 重为1.06-1.15的浸膏， 用硅藻土过滤， 滤液依次用sevage法脱蛋白， 过氧化氢法脱色， 得千 金子多糖溶液， 千金子多糖溶液依次通过纤维素层析柱、 凝胶柱， 得洗脱流份千金子多糖I 和千金子多糖， 冷冻干燥， 即得千金子多糖I和千金子多糖； 实现以本发明制备的千金 子多糖I和千金子多糖在制备增强免疫力的药物和保健品中的应用， 千金子低聚糖在制 备抗。
19、氧化的药物、 保健品及化妆品中的应用。 0007 所述的大孔吸附树脂为HPD-600型大孔吸附树脂或SP-825型大孔吸附树脂， 反相 硅胶为十八烷基硅烷键合硅胶或辛烷基硅烷键合硅胶， 纤维素为DEAE-52纤维素， 凝胶为 Sephacry1 S-200凝胶。 0008 本发明制备方法简单， 易操作， 原料丰富， 产品应用广泛， 以千金子为原料同时制 说明书 1/9 页 5 CN 106883305 A 5 备千金子多糖I、 千金子多糖及低聚糖， 开发了千金子药材的应用范围， 千金子多糖I和千 金子多糖可用于制备增强免疫力的药物和保健品， 千金子低聚糖可用于制备抗氧化的药 物、 保健品及化妆。
20、品， 开拓了千金子多糖及低聚糖的应用价值， 具有良好的经济效益和社会 效益， 是中药上的巨大创新。 具体实施方式 0009 以下结合实施例对本发明的具体情况作详细说明。 0010 本发明在具体实施中， 可由以下实施例给出： 0011 实施例1 0012 本发明在具体实施中， 包括以下步骤： 0013 (1)取千金子药材， 去种皮， 所得千金子种皮A备用， 种仁61机械压榨法去油， 得 千金子霜B； 将千金子种皮A和千金子霜B加入千金子药材重量7.9倍量的石油醚， 静置4.2h， 闪式提取2.2min， 室温条件下超声提取31min， 过滤， 得千金子药渣C， 将千金子药渣C挥发去 石油醚， 晾。
21、干， 加千金子药材重量15.6倍的体积浓度为77的乙醇， 浸泡7.3h， 51回流提 取64min， 过滤， 得提取液和千金子药渣D， 千金子药渣D备用， 提取液56减压回收乙醇， 59 减压浓缩至比重为1.10的浸膏， 依次经过硅藻土柱、 HPD-600型大孔吸附树脂柱、 活性炭 柱、 十八烷基硅烷键合硅胶柱， 得洗脱液， 最后将所得洗脱液减压浓缩， 冷冻干燥即得千金 子低聚糖； 0014 (2)在步骤(1)中的千金子药渣D中加入千金子药材重量12倍量的水， 86超声提 取67min， 过滤， 得第一滤液和千金子药渣E； 在千金子药渣E中加入千金子药材重量9倍量的 水， 83超声提取56mi。
22、n， 过滤， 得第二滤液， 合并第一滤液和第二滤液， 减压浓缩至比重为 1.15的浸膏， 用硅藻土过滤， 滤液依次用sevage法脱蛋白， 过氧化氢法脱色， 得千金子多糖 溶液， 千金子多糖溶液依次通过DEAE-52纤维素层析柱、 Sephacry1 S-200凝胶柱， 得洗脱流 份千金子多糖I和千金子多糖， 冷冻干燥， 即得千金子多糖I和千金子多糖。 0015 实施例2 0016 本发明在具体实施中， 包括以下步骤： 0017 (1)取千金子药材， 去种皮， 所得千金子种皮A备用， 种仁61机械压榨法去油， 得 千金子霜B； 将千金子种皮A和千金子霜B加入千金子药材重量6.8倍量的石油醚， 。
23、静置4.2h， 闪式提取2.2min， 室温条件下超声提取31min， 过滤， 得千金子药渣C， 将千金子药渣C挥发去 石油醚， 晾干， 加千金子药材重量7.1倍的体积浓度为73的乙醇， 浸泡7.3h， 35回流提取 38min， 过滤， 得提取液和千金子药渣D， 千金子药渣D备用， 提取液43减压回收乙醇， 59 减压浓缩至比重为1.07的浸膏， 依次经过硅藻土柱、 SP-825型大孔吸附树脂柱、 活性炭柱、 辛烷基硅烷键合硅胶柱， 得洗脱液， 最后将所得洗脱液减压浓缩， 冷冻干燥即得千金子低聚 糖； 0018 (2)在步骤(1)中的千金子药渣D中加入千金子药材重量7倍量的水， 86超声提取。
24、 67min， 过滤， 得第一滤液和千金子药渣E； 在千金子药渣E中加入千金子药材重量5倍量的 水， 83超声提取56min， 过滤， 得第二滤液， 合并第一滤液和第二滤液， 减压浓缩至比重为 1.06的浸膏， 用硅藻土过滤， 滤液依次用sevage法脱蛋白， 过氧化氢法脱色， 得千金子多糖 溶液， 千金子多糖溶液依次通过DEAE-52纤维素层析柱、 Sephacry1 S-200凝胶柱， 得洗脱流 说明书 2/9 页 6 CN 106883305 A 6 份千金子多糖I和千金子多糖， 冷冻干燥， 即得千金子多糖I和千金子多糖。 0019 实施例3 0020 本发明在具体实施中， 包括以下步骤。
25、： 0021 (1)取千金子药材， 去种皮， 所得千金子种皮A备用， 种仁61机械压榨法去油， 得 千金子霜B； 将千金子种皮A和千金子霜B加入千金子药材重量7.3倍量的石油醚， 静置4.2h， 闪式提取2.2min， 室温条件下超声提取31min， 过滤， 得千金子药渣C， 将千金子药渣C挥发去 石油醚， 晾干， 加千金子药材重量12.4倍的体积浓度为75的乙醇， 浸泡7.3h， 43回流提 取51min， 过滤， 得提取液和千金子药渣D， 千金子药渣D备用， 提取液50减压回收乙醇， 59 减压浓缩至比重为1.09的浸膏， 依次经过硅藻土柱、 SP-825型大孔吸附树脂柱、 活性炭 柱、 。
26、反相硅胶为十八烷基硅烷键合硅胶柱， 得洗脱液， 最后将所得洗脱液减压浓缩， 冷冻干 燥即得千金子低聚糖； 0022 (2)在步骤(1)中的千金子药渣D中加入千金子药材重量10倍量的水， 86超声提 取67min， 过滤， 得第一滤液和千金子药渣E； 在千金子药渣E中加入千金子药材重量7倍量的 水， 83超声提取56min， 过滤， 得第二滤液， 合并第一滤液和第二滤液， 减压浓缩至比重为 1.11的浸膏， 用硅藻土过滤， 滤液依次用sevage法脱蛋白， 过氧化氢法脱色， 得千金子多糖 溶液， 千金子多糖溶液依次通过DEAE-52纤维素层析柱、 Sephacry1 S-200凝胶柱， 得洗脱流。
27、 份千金子多糖I和千金子多糖， 冷冻干燥， 即得千金子多糖I和千金子多糖。 0023 实施例4 0024 本发明在具体实施中， 包括以下步骤： 0025 (1)取千金子药材， 去种皮， 所得千金子种皮A备用， 种仁61机械压榨法去油， 得 千金子霜B； 将千金子种皮A和千金子霜B加入千金子药材重量6.8倍量的石油醚， 静置4.2h， 闪式提取2.2min， 室温条件下超声提取31min， 过滤， 得千金子药渣C， 将千金子药渣C挥发去 石油醚， 晾干， 加千金子药材重量15.6倍的体积浓度为75的乙醇， 浸泡7.3h， 35回流提 取51min， 过滤， 得提取液和千金子药渣D， 千金子药渣D。
28、备用， 提取液56减压回收乙醇， 59 减压浓缩至比重为1.09的浸膏， 依次经过硅藻土柱、 HPD-600型大孔吸附树脂柱、 活性炭 柱、 辛烷基硅烷键合硅胶， 得洗脱液， 最后将所得洗脱液减压浓缩， 冷冻干燥即得千金子低 聚糖； 0026 (2)在步骤(1)中的千金子药渣D中加入千金子药材重量7倍量的水， 86超声提取 67min， 过滤， 得第一滤液和千金子药渣E； 在千金子药渣E中加入千金子药材重量5倍量的 水， 83超声提取56min， 过滤， 得第二滤液， 合并第一滤液和第二滤液， 减压浓缩至比重为 1.15的浸膏， 用硅藻土过滤， 滤液依次用sevage法脱蛋白， 过氧化氢法脱色。
29、， 得千金子多糖 溶液， 千金子多糖溶液依次通过DEAE-52纤维素层析柱、 Sephacry1 S-200凝胶柱， 得洗脱流 份千金子多糖I和千金子多糖， 冷冻干燥， 即得千金子多糖I和千金子多糖。 0027 上述制备的千金子低聚糖、 千金子多糖I和千金子多糖经蒽酮-硫酸法(常规测 定方法， 是公知技术)测定， 其糖含量均不低于83。 经HPGPC法(公知技术)测定， 千金子低 聚糖分子量均在300-2000之间。 0028 上述仅是给出的几个实施例， 在研制中， 发明人经反复多次实验， 均取得了相同或 相近似的结果， 方法科学有效， 具有较好的实际应用价值。 0029 千金子多糖的免疫活性。
30、实验 说明书 3/9 页 7 CN 106883305 A 7 0030 一.试验材料 0031 1.试验动物： 18.522.5g昆明种清洁剂小鼠， 雌雄各半。 由郑州大学实验动物中 心提供。 0032 2.实验试药： 本发明方法制备的千金子多糖I和千金子多糖多糖含量分别为 89.14、 85.47， 瑞士染液， 香菇多糖(湖北广仁药业有限公司)， 环磷酰胺(江苏恒瑞医药 股份有限公司)等。 0033 二.试验方法 0034 1.千金子多糖对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 0035 取小鼠80只， 体重18.522.5g， 雌雄各半， 随机均匀分为8组。 分别灌服小、 中、 大 剂量的千。
31、金子多糖I和千金子多糖水溶液(10mg/ml， 20mg/ml， 40mg/ml； 0.2ml/10g)， 香菇 多糖混悬液(5mg/ml； 0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。 每天给药1次， 连续给 药7天。 于第7天早上各组小鼠均腹腔注射5鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml。 于第7天灌胃 给药后2h， 注射5鸡红细胞4h后， 脱颈椎处死小鼠， 腹腔注入汉氏液2.5ml， 轻揉小鼠腹部； 然后剪开小鼠腹部皮肤， 在腹膜上剪一小孔， 用吸管吸取腹腔液2ml置于试管中， 混匀； 吸取 少许腹腔液滴于载玻片上， 液点大小约为1.5cm2cm。 将载玻片放在铺有湿纱布的糖。
32、瓷盘 中， 37孵育30min， 生理盐水冲去附着的细胞， 瑞氏染液染色， 自来水冲洗晾干； 显微镜下 观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况， 并计算吞噬百分率和吞噬指数。 0036 0037 0038表1 腹腔巨噬细胞吞噬功能结果 0039 0040 *表示与空白组比P0.01， *表示与空白组比P0.05； I组表示千金子多糖I组， 组表示千金子多糖组 0041 从表1可以看出， 与空白对照组比， 中剂量I组、 大剂量I组、 中剂量组、 大剂量 组均可极显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率(P0.01)和腹腔巨噬细胞 说明书 4/9 页 8 CN 106883305 A 8 的吞噬指数。
33、(P0.01)； 小剂量I组、 小剂量组及香菇多糖组均能显著提高吞噬百分率及 吞噬指数(P0.05)， 其中尤以中剂量组作用为最强。 0042 2.千金子多糖对正常小鼠溶血素形成的影响 0043 取小鼠80只， 体重18.522.5g， 雌雄各半， 随机均匀分为8组。 分别灌服小、 中、 大 剂量的千金子多糖I和千金子多糖水溶液(10mg/ml， 20mg/ml， 40mg/ml； 0.2ml/10g)， 香菇 多糖混悬液(5mg/ml； 0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。 每天给药1次， 连续给 药7天。 同时， 给药第1天各组小鼠均腹腔注射5鸡红细胞生理盐水混悬。
34、液0.2ml/只， 进行 免疫， 于最后1次给药后2h， 小鼠眼眶取血， 离心， 分离血清。 用生理盐水1 100稀释后， 取1ml 稀释液与5鸡红细胞混悬液0.5ml、 10补体0.5ml(豚鼠血清， 用鸡红细胞预先饱和6h)混 匀， 37孵育30min， 冰水中终止反应。 另设不加补体的空白管作对照， 吸取各管上清液于 UV-T1901型分光光度计540nm处比色， 测定各组溶血素形成情况。 0044 3.千金子多糖对正常小鼠溶血空斑形成的影响 0045 取小鼠80只， 体重18.522.5g， 雌雄各半， 随机均匀分为8组。 分别灌服小、 中、 大 剂量的千金子多糖I和千金子多糖水溶液(。
35、10mg/ml， 20mg/ml， 40mg/ml； 0.2ml/10g)， 香菇 多糖混悬液(5mg/ml； 0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。 每天给药1次， 连续给 药7天。 同时， 给药第1天各组小鼠均腹腔注射5鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只， 进行 免疫， 于最后1次给药后2h， 脱颈椎处死并解剖小鼠， 取出脾脏， 同组两个小鼠脾脏为一例； 匀浆， 并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5106个/ml。 取脾细胞混悬液1.0ml， 与0.2鸡 红细胞混悬液0.5ml和1 10的豚鼠血清0.5ml混匀。 另设不加补体的空白管， 37孵育1h， 离 心， 取上。
36、清液于UV-T1901型分光光度计413nm处比色， 测各组溶血空斑形成情况。 0046表2 溶血素、 溶血空斑形成结果 0047 0048 *表示与空白组比P0.01， *表示与空白组比P0.05； I组表示千金子多糖I组， 组表示千金子多糖组 0049 从表2可以看出， 与空白对照组比， 小剂量I组、 大剂量I组、 小剂量组、 大剂量 组溶血空斑均有显著升高(P0.05)， 中剂量I组、 中剂量组和香菇多糖组溶血素和溶血 空斑均显著提高(P0.01)。 其中尤以中剂量组作用为最优。 说明书 5/9 页 9 CN 106883305 A 9 0050 4.千金子多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小。
37、鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 0051 取小鼠90只， 体重18.522.5g， 雌雄各半， 随机均匀分为9组。 除空白对照组外， 其 余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共8组(剂量为8mg/ml； 第1、 2、 3天连续腹腔注射)， 模型组建立完成后， 分别灌服小、 中、 大剂量的千金子多糖I和千金子多糖水溶液(5mg/ ml， 10mg/ml， 20mg/ml； 0.2ml/10g)， 香菇多糖混悬液(5mg/ml， 0.2ml/10g)及同体积的生理 盐水(0.2ml/10g)。 每天给药1次， 连续给药7天。 于给药最后一天早上各组小鼠均腹腔注射 5鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml， 。
38、灌胃给药后2h， 给鸡红细胞后4h， 脱颈椎处死小鼠。 腹 腔注入汉氏液2.5ml， 轻揉小鼠腹部， 然后剪开小鼠腹部皮肤， 在腹膜上剪一小孔， 用移液枪 吸取腹腔液2ml置于试管中， 混匀； 吸取少许腹腔液滴于载玻片上， 液点大小约为1.5cm 2cm。 将载玻片放在铺有湿纱布的糖瓷盘中， 37孵育30min， 生理盐水冲去附着的细胞， 瑞 氏染液染色， 自来水冲洗晾干， 显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况， 并计算吞噬百 分率和吞噬指数。 0052表3 腹腔巨噬细胞吞噬功能结果 0053 0054 *表示与模型组比P0.01； I组表示千金子多糖I组， 组表示千金子多糖组 0055 从。
39、表3可以看出， 与空白组相比， 模型组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数 和吞噬百分率显著降低(P0.01)， 说明造模成功。 与模型组相比， 大、 中、 小剂量千金子多 糖I组及组和香菇多糖组可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百 分率(P0.01)。 0056 5.千金子多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠溶血素形成的影响 0057 取小鼠90只， 体重18.522.5g， 雌雄各半， 随机均匀分为9组。 除空白对照组外， 其 余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共8组(剂量为8mg/ml； 第1、 2、 3天连续腹腔注射)； 模型组建立完成后， 各组小鼠(含空白组)均腹腔注射。
40、5鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/ 只， 进行免疫； 并开始分别灌服小、 中、 大剂量的千金子多糖I和千金子多糖水溶液(5mg/ ml， 10mg/ml， 20mg/ml； 0.2ml/10g)、 香菇多糖混悬液(5mg/ml， 0.2ml/10g)及同体积的生理 盐水(0.2ml/10g)， 每天给药1次， 连续给药7天。 最后1次给药后2h， 小鼠眼眶取血， 离心， 分 说明书 6/9 页 10 CN 106883305 A 10 离血清； 以生理盐水1 100稀释后， 取1ml稀释液与5鸡红细胞混悬液0.5ml、 10补体 0.5ml(豚鼠血清， 用鸡红细胞预先饱和6h)混匀； 37孵。
41、育30min， 冰水中终止反应， 另设不 加补体的空白管作对照； 吸取各管上清液于UV-T1901型分光光度计540nm处比色， 测定各组 溶血素形成情况， 结果见表4。 0058 6.千金子多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠溶血空斑形成的影响 0059 取小鼠90只， 体重18.522.5g， 雌雄各半， 随机均匀分为9组。 除空白对照组外， 其 余各组均建立环磷酰胺致免疫抑制模型共8组(剂量为8mg/ml； 第1、 2、 3天连续腹腔注射)； 模型组建立完成后， 各组小鼠(含空白组)均腹腔注射5鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/ 只， 进行免疫； 并开始分别灌服小、 中、 大剂量的千金子多糖。
42、I和千金子多糖水溶液(5mg/ ml， 10mg/ml， 20mg/ml； 0.2ml/10g)、 香菇多糖混悬液(5mg/ml， 0.2ml/10g)及同体积的生理 盐水(0.2ml/10g)， 每天给药1次， 连续给药7天。 于最后1次给药后2h， 脱颈椎处死并解剖小 鼠， 取出脾脏， 同组中两个小鼠脾脏为一例， 匀浆， 并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5 106个/ml。 取脾细胞混悬液1.0ml， 与0.2鸡红细胞混悬液0.5ml和1 10的豚鼠血清0.5ml 混匀。 另设不加补体的空白管， 37孵育1h， 离心， 取上清液于UV-T1901型分光光度计413nm 处比色， 测各组溶血空。
43、斑形成情况， 结果见表4。 0060表4 溶血素、 溶血空斑形成结果 0061 0062 *表示与模型组比P0.01 0063 从上表可看出， 与空白对照组比， 模型组溶血素和溶血空斑均显著降低(P 0.01)， 说明造免疫抑制模型成功。 与模型组比， 各个剂量千金子多糖I组、 组及香菇多糖 组均可显著促进小鼠溶血素和溶血空斑的形成(P0.01)。 其中， 尤以中剂量组千金子多 糖组为佳。 0064 千金子低聚糖抗氧化活性实验 0065 一、 实验材料 0066 1.实验动物 选用40只普通级昆明种小鼠， 鼠龄2个月， 体重(202)g， 雌雄各半。 由郑州大学医学院动物实验中心提供(合格证号。
44、： SCXK(豫)2005-0001； 使用许可证号： SCXK (豫)2005-0012)。 说明书 7/9 页 11 CN 106883305 A 11 0067 2.实验试药 丙二醛(MDA)测定试剂盒， 生化试剂， 南京建成生物工程研究所； 超氧 化物岐化酶(SOD)测试盒， 南京建成生物工程研究所； 谷胱甘肽酶(GSH-PX)测试盒， 南京建 成生物工程研究所； 本发明制备的千金子低聚糖含量为89.92。 0068 二、 实验方法 0069 1.动物的喂养与取样 取体重(202)g的昆明种小鼠40只,适应性饲养1周后,随 机分成4组， 每组10只。 分别为空白组、 千金子低聚糖低剂量。
45、组(100mg/kg)、 千金子低聚糖中 剂量组(200mg/kg)、 千金子低聚糖高剂量组(400mg/kg)， 连续15天口服给药(空白对照组给 等量纯净水)， 每天小鼠给药体积为0.2mL/10g。 末次给药后24h， 处死动物， 分别取小鼠血清 及制备10肝组织匀浆， 待测。 0070 制备10小鼠肝组织匀浆： 取肝组织在冰冷的生理盐水中漂洗， 除去血液， 称 0.5g， 放入5mL-10mL的小烧杯内， 取总量(总量为4.5mL)2/3的生理盐水于烧杯中， 用眼科剪 尽快剪碎组织块， 将剪碎的组织倒入匀浆管中， 用剩余1/3的生理盐水用来冲洗残留在烧杯 中的碎组织块， 一起倒入匀浆管。
46、中， 进行匀浆， 使组织匀浆化， 将匀浆液离心(3000r/min， 10min)， 取适量上清液进行以下测定。 0071 血清制备： 摘眼球取出血样， 37水浴30min加速血液凝固。 血液凝固后用竹签沿 试管四周轻轻剥离血块使血清尽快自行析出， 然后2500r/min离心10min， 用吸管吸出上层 血清备用。 0072 2.检测方法 蛋白质含量测定： 采用考马斯亮兰法。 蛋白质分子具有-NH3+基团， 当 棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白标准液或样品中时， 考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋 白-NH3+基团结合， 致使溶液变蓝， 通过测定吸收度可计算出样品中蛋白质的含量； SOD测定： 采用。
47、黄嘌呤氧化酶法。 血清中SOD活力以每毫升反应液中SOD抑制率达50时所对应的SOD 量为一个亚硝酸盐单位(NU)， 即U/mL； 组织中SOD活力以每毫克组织蛋白在1mL反应液中SOD 抑制率达50时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐， 即U/mgprot； GSH-Px测定： 采用二硫对硝 基苯甲酸法测定， 具体操作详见试剂和说明书， 血清单位为U/mL， 组织单位为U/mgprot； MDA 测定： 采用硫代巴比妥酸法(TBA)测定， 过氧化脂质降解产物中MDA可与TBA缩合， 形成的红 色产物在523nm处有最大吸收峰， 因底物为TBA， 所以此法称TBA法。 血清单位为nmol/mL， 。
48、组 织单位为nmol/mgprot。 0073表5 千金子低聚糖对小鼠肝组织中SOD、 GSH-Px、 MDA的影响 0074 0075 *表示与空白组相比P0.05， *表示与空白组比P0.01 0076 从表5可以看出， 与空白组比较， 大剂量组小鼠肝组织中SOD和GSH-Px活性提高极 显著(P0.01)， MDA水平降低极显著(P0.01)； 中剂量组小鼠肝组织中SOD和GSH-Px活性 说明书 8/9 页 12 CN 106883305 A 12 显著增高(P0.05)， MDA水平降低极显著(P0.01)； 小剂量组肝组织中SOD活性显著提高 (P0.05)， MDA水平降低极显著。
49、(P0.01)， 但GSH-Px活性与空白组差异不显著(P0.05)。 0077表6 千金子低聚糖对小鼠血清中SOD、 GSH-Px的影响 0078 0079 *表示与空白组比P0.01 0080 从表6可见， 与空白组相比， 大、 中剂量组的小鼠血清中SOD和GSH-Px活性极显著提 高(P0.01)， 小剂量组小鼠血清中SOD和GSH-Px活性差异无显著性(P0.05)。 0081 从上述资料可以看出， 本发明提取的千金子多糖I和千金子多糖均具有很好的 增强机体免疫力的作用， 完全具备开发为增强免疫力的药物和保健品的潜力及实际推广应 用价值； 千金子低聚糖具有良好的抗氧化能力， 可作为抗氧化类药物、 保健品及化妆品开 发。 本发明对千金子药材多糖及低聚糖的开发不仅拓展了中药千金子应用的新前景， 而且 是中医药上的创新， 具有较高的实际应用价值和巨大的经济社会效益。 说明书 9/9 页 13 CN 106883305 A 13 。