技术领域
本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种四环二萜类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
目前全球癌症发病形势严峻，发病率与死亡率呈持续上升趋势，已经成为严重危害人类健康、导致现代人类死亡的第一大恶疾和顽症。世界卫生组织于2014年2月发布报告,预测全球癌症病例将逐年呈现迅猛增长态势，由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人。该组织统计数据还显示，中国每年新增癌症病例约350万，约有250万人因此死亡。因此寻找有效的抗癌药物已成为当务之急。在抗癌药物研究中，化疗药物的研究和临床应用已取得很大进展。化学合成的抗癌药物如金属配合物铂络合物、有机锗化合物等，虽然具有强抗癌性，但存在毒副作用，水溶性差等缺陷。近年来，中外研究人员逐渐将目光投向资源丰富、纯天然的中草药、民族药，希望从中寻找新的抗癌药物。目前从中草药、民族药中发现了紫杉醇、喜树碱、三尖杉酯碱类、长春新碱、鬼臼毒素、榄香烯乳等一系列天然抗癌药物，并且每年都有多只新品上市。这些天然药物均表现了良好的抗癌活性并在临床上得到了广泛的应用，也日益证明从天然产物中筛选抗肿瘤药物是一个很有前景的方向。
黑果土当归(AraliadumetorumHand.-Mazz)系五加科(Araliaceae)楤木属植物，在云南称“牛角七”，“白九股牛”，“蜜油参”。民间以根入药，入脾、胃二经。中草药，2001，32(9):847-850报道，该植物有补中益气、托毒外出、消炎的功效，用于淋巴腺炎、慢性化脓性骨髓炎和疖痈等症。该属植物化学成分主要含二萜、三萜皂苷、香豆素、黄酮、木脂素及甾醇。该属植物中的二萜类化合物有抗肿瘤、抗炎等活性。本发明试图对黑果土当归中二萜类化合物的抗肿瘤作用做进一步深入研究，以期发现其中的细胞毒活性天然产物，为筛选高效、低毒的抗肿瘤药物提供依据。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种四环二萜类化合物；第二目的在于提供所述四环二萜类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述四环二萜类化合物的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的四环二萜类化合物是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C20H30O3，命名为dumetorumaneB，具有下述结构式：
。
本发明的第二目的是这样实现的，是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将黑果土当归根晾干粉碎得到0.05~0.15cm粒径大小的颗粒，加入黑果土当归根重量比4~8倍的体积百分浓度80~95%乙醇溶液于65~74℃下回流提取3~5次，每次1~3h，合并提取液，提取液过滤，减压浓缩提取液至比重为1.1~1.3得到浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比2~4倍量的水，依次用与水等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂进行萃取，每种溶剂萃取4~6次，蒸去溶剂分别得到石油醚萃取物b、乙酸乙酯萃取物c和正丁醇萃取物d；
C、硅胶柱层析：
1）将乙酸乙酯萃取物c上硅胶柱，装柱硅胶为100~200目，用量为萃取物c重量6~8倍量；用体积比为30:1~0:1的氯仿-甲醇有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
2）将1）中以15:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液e上硅胶柱，装柱硅胶为200~300目，用量为洗脱液e体积6~8倍量；用体积比25:1~5:1的氯仿甲醇有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC检测，合并相同的部分；
D、高效液相色谱分离：将C步骤2）中以20:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液采用半制备高效液相色谱仪分离纯化，即得所述的四环二萜类化合物dumetorumaneB。
本发明四环二萜类化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和其他波谱技术测定方法确定为四环二萜类化合物，并表征其具体结构为：
化合物dumetorumaneB，为白色无定型粉末(溶剂为氯仿)，=+43.5°(c0.45,CHCl3);IR(KBr)谱在3345,2969,1711,1652,1123,1067cm-1有吸收，表明分子中存在羧基、羟基和双键。HRESI-MS(附图1)显示其准分子离子峰m/z317.2131[M-H]-(calcd.317.2116)，结合NMR谱确定其分子式为C20H30O3，不饱和度为6。1HNMR(附图2，数据归属见表1)显示分子中有3个甲基单峰，分别为δH1.25(3H,s),1.18(3H,s)及0.81(3H,s))，有1个连氧亚甲基峰（δH3.72(1H,dd,J=11.2,7.2Hz)；3.60(1H,dd,J=11.2,8.0Hz)）;13CNMR(附图3及附图4，数据归属见表1)显示分子中有20个碳，其中有6个季碳，3个次甲基，8个亚甲基，及3个甲基。结合HSQC相关谱(附图5)，并对比文献数据可证实,该化合物与已知化合物acasianeA结构相似,为含有1个三元小环的二萜类化合物,区别在于分子中多了1个羰基(δC182.7)和1个双键(δC127.8及135.5)，少了1个连氧亚甲基(δC63.8)和2个次甲基(δC56.3及37.1)；进一步经HMBC相关(附图6)证实C-18（羰基）与C-4位相连，C-8及C-9位为一双键。进一步经HMBC相关(附图6)、COSY相关(附图7)和ROESY(附图8)及与文献(LinA.S.,LinC.R.,DuY.C.,LübkenT.,ChiangM.Y.,ChenI.H.,WuC.C.,HwangT.L.,ChenS.L.,YenM.H.,ChangF.R.,WuY.C.AcasianeAandBandfarnesiraneAandB,diterpenederivativesfromtherootsofAcaciafarnesiana.PlantaMed2009,75:256-261.)对比证实，使化合物的结构最终得到确认，化合物具有下述结构式：
通过SCIFINDER数据库检索和文献查询证实该化合物为新化合物。
表1本发明化合物的1H-和13C-NMR(CDCl3)数据
本发明的第三目的是这样实现的，所述的四环二萜类化合物在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
所述的四环二萜类化合物在制备预防和/或治疗人肺腺癌、人急性早幼粒白血病或人乳腺癌药物中的应用。
本发明所述的四环二萜类化合物进行了细胞毒活性测试，实验结果显示出良好的抑制人肺腺癌、人急性早幼粒白血病及人乳腺癌细胞株活性，可为医用工业提供有应用价值的新化合物或先导化合物。
本发明的优点：
1、本发明中的四环二萜类化合物对人肺腺癌、人急性早幼粒白血病或人乳腺癌细胞株有显著的抑制作用，提示其具有良好的抗癌活性，可以作为抗癌活性成分或先导化合物。
2、本发明中的四环二萜类化合物可为天然存在的有机化合物，原料来源广泛，并且化合物制备操作流程简单，所获得的化合物纯度高，随后的工业化生产易实现。
附图说明
图1是本发明化合物高分辨质谱（HRESI-MS)；
图2是本发明化合物的核磁共振氢谱（1HNMR)；
图3是本发明化合物的核磁共振碳谱（13CNMR)；
图4为本发明化合物的DEPT谱；
图5是本发明化合物的HSQC相关谱；
图6是本发明化合物的HMBC相关谱；
图7是本发明化合物的COSY相关谱；
图8是本发明化合物的ROESY相关谱。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明所述的四环二萜类化合物，是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C20H30O3，命名为dumetorumaneB，具有下述结构式：
。
本发明所述的四环二萜类化合物的制备方法，是以黑果土当归根为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将黑果土当归根晾干粉碎得到0.05~0.15cm粒径大小的颗粒，加入黑果土当归根重量比4~8倍的体积百分浓度80~95%乙醇溶液于65~74℃下回流提取3~5次，每次1~3h，合并提取液，提取液过滤，减压浓缩提取液至比重为1.1~1.3得到浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比2~4倍量的水，依次用与水等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂进行萃取，每种溶剂萃取4~6次，蒸去溶剂分别得到石油醚萃取物b、乙酸乙酯萃取物c和正丁醇萃取物d；
C、硅胶柱层析：
1）将乙酸乙酯萃取物c上硅胶柱，装柱硅胶为100~200目，用量为萃取物c重量6~8倍量；用体积比为30:1~0:1的氯仿-甲醇有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
2）将1）中以15:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液e上硅胶柱，装柱硅胶为200~300目，用量为洗脱液e体积6~8倍量；用体积比25:1~5:1的氯仿甲醇有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC检测，合并相同的部分；
D、高效液相色谱分离：将C步骤2）中以20:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液采用半制备高效液相色谱仪分离纯化，即得所述的四环二萜类化合物dumetorumaneB。
A步骤所述的过滤是经80~120μm的滤纸进行过滤。
A步骤所述的减压浓缩是在50℃以下的温度条件下用旋转蒸发仪进行减压浓缩。
B步骤中所述的蒸去溶剂是采用旋转蒸发仪蒸去溶剂。
C步骤1）中所述的氯仿-甲醇有机溶剂的体积配比为30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1和0:1。
C步骤2）中所述的氯仿-甲醇有机溶剂的体积配比为25:1、20:1、15:1、10:1、8:1和5:1。
D步骤所述的采用半制备高效液相色谱仪分离纯化，具体为将C步骤2）中以20:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液经半制备高效液相色谱仪分离纯化，以体积配比为60:40的乙腈-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集35~37min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到所述的四环二萜类化合物dumetorumaneB；
本发明的应用为所述的四环二萜类化合物在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
本发明的应用为所述的四环二萜类化合物在制备预防和/或治疗人肺腺癌、人急性早幼粒白血病或人乳腺癌药物中的应用。
下面以具体实施例对本发明做进一步说明：
实施例1化合物的制备
材料来源：黑果土当归采于云南昆明，经云南民族大学民族医药学院杨青松副教授鉴定为AraliadumetorumHand.-Mazz，标本保存于云南民族大学民族医药学院标本馆。
采用以下步骤：
a.粉碎：将10Kg黑果土当归根晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，备用；
b.回流提取：将步骤a中制得的黑果土当归粉在65℃的温度下回流提取4次，每次2小时，每次用60Kg80%浓度的乙醇提取，合并乙醇提取液，备用；
c、浓缩：将步骤b制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1380g，备用；
d、萃取：将1380g浸膏混悬于4500ml水中，依次用4500ml石油醚、4500ml乙酸乙酯以及4500ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物390g、112g、405g。
e.分离:将步骤d中制得的乙酸乙酯萃取物经100-200目硅胶柱色谱，用体积比30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为8.8g，Fr.2为8.1g，Fr.3为3.2g，Fr.4为15.7g，Fr.5为34.3g，Fr.6为6.2g，Fr.7为5.1g，Fr.8为21.5g，Fr.4经200-300目硅胶柱层析，以体积比25:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1的氯仿：甲醇梯度洗脱，得到组分Fr.4A-Fr.4F共6个组分，Fr.4A为1.0g，Fr.4B为1.9g，Fr.4C为0.6g，Fr.4D为3.6g，Fr.4E为1.5g，Fr.4F为3.1g。Fr.4B经半制备高效液相色谱仪，以乙腈-水(体积比60:40)作为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集35~37min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到白色无定型粉末式目标化合物dumetorumaneB（12mg）。
实施例2化合物的制备
采用以下步骤：
a.粉碎：将10Kg黑果土当归根晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，备用；
b.回流提取：将步骤a中制得的黑果土当归粉在67℃的温度下回流提取3次，每次2.5小时，每次用60Kg84%浓度的乙醇提取，合并乙醇提取液，备用；
c、浓缩：将步骤b制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1340g，备用；
d、萃取：将1340g浸膏混悬于4000ml水中，依次用4000ml石油醚、4000ml乙酸乙酯以及4000ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取4次，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物372g、103g、396g。
e.分离:将步骤d中制得的乙酸乙酯萃取物经100-200目硅胶柱色谱，用体积比30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为7.6g，Fr.2为6.8g，Fr.3为3.0g，Fr.4为14.5g，Fr.5为32.4g，Fr.6为5.3g，Fr.7为4.8g，Fr.8为18.7g，Fr.4经200-300目硅胶柱层析，以体积比25:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1的氯仿：甲醇梯度洗脱，得到组分Fr.4A-Fr.4F共6个组分，Fr.4A为0.9g，Fr.4B为1.7g，Fr.4C为0.5g，Fr.4D为3.4g，Fr.4E为1.4g，Fr.4F为3.0g。Fr.4B经半制备高效液相色谱仪，以乙腈-水(体积比60:40)作为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集35~37min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到白色无定型粉末式目标化合物dumetorumaneB（14mg）。
实施例3化合物的制备
采用以下步骤：
a.粉碎：将10Kg黑果土当归根晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，备用；
b.回流提取：将步骤a中制得的黑果土当归粉在69℃的温度下回流提取5次，每次2小时，每次用60Kg88%浓度的乙醇提取，合并乙醇提取液，备用；
c、浓缩：将步骤b制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1410g，备用；
d、萃取：将1410g浸膏混悬于4500ml水中，依次用4500ml石油醚、4500ml乙酸乙酯以及4500ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物395g、117g、411g。
e.分离:将步骤d中制得的乙酸乙酯萃取物经100-200目硅胶柱色谱，用体积比30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为9.1g，Fr.2为8.4g，Fr.3为3.4g，Fr.4为15.9g，Fr.5为35.6g，Fr.6为6.4g，Fr.7为5.3g，Fr.8为22.6g，Fr.4经200-300目硅胶柱层析，以体积比25:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1的氯仿：甲醇梯度洗脱，得到组分Fr.4A-Fr.4F共6个组分，Fr.4A为1.1g，Fr.4B为2.1g，Fr.4C为0.7g，Fr.4D为3.7g，Fr.4E为1.6g，Fr.4F为3.9g。Fr.4B经半制备高效液相色谱仪，以乙腈-水(体积比60:40)作为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集35~37min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到白色无定型粉末式目标化合物dumetorumaneB（15mg）。
实施例4化合物的制备
采用以下步骤：
a.粉碎：将10Kg黑果土当归根晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，备用；
b.回流提取：将步骤a中制得的黑果土当归粉在71℃的温度下回流提取4次，每次2小时，每次用60Kg92%浓度的乙醇提取，合并乙醇提取液，备用；
c、浓缩：将步骤b制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1480g，备用；
d、萃取：将1480g浸膏混悬于5000ml水中，依次用5000ml石油醚、5000ml乙酸乙酯以及5000ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取6次，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物387g、111g、408g。
e.分离:将步骤d中制得的乙酸乙酯萃取物经100-200目硅胶柱色谱，用体积比30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为8.2g，Fr.2为7.5g，Fr.3为3.0g，Fr.4为16.2g，Fr.5为34.4g，Fr.6为6.1g，Fr.7为5.0g，Fr.8为22.3g，Fr.4经200-300目硅胶柱层析，以体积比25:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1的氯仿：甲醇梯度洗脱，得到组分Fr.4A-Fr.4F共6个组分，Fr.4A为1.1g，Fr.4B为2.2g，Fr.4C为0.7g，Fr.4D为3.9g，Fr.4E为1.8g，Fr.4F为3.6g。Fr.4B经半制备高效液相色谱仪，以乙腈-水(体积比60:40)作为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集35~37min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到白色无定型粉末式目标化合物dumetorumaneB（17mg）。
实施例5化合物的制备
采用以下步骤：
a.粉碎：将10Kg黑果土当归根晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，备用；
b.回流提取：将步骤a中制得的黑果土当归粉在74℃的温度下回流提取5次，每次2小时，每次用60Kg95%浓度的乙醇提取，合并乙醇提取液，备用；
c、浓缩：将步骤b制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1520g，备用；
d、萃取：将1520g浸膏混悬于4500ml水中，依次用4500ml石油醚、4500ml乙酸乙酯以及4500ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取6次，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物420g、130g、450g。
e.分离:将步骤d中制得的乙酸乙酯萃取物经100-200目硅胶柱色谱，用体积比30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为10.5g，Fr.2为8.8g，Fr.3为3.5g，Fr.4为17.0g，Fr.5为38.5g，Fr.6为7.0g，Fr.7为5.6g，Fr.8为25.3g，Fr.4经200-300目硅胶柱层析，以体积比25:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1的氯仿：甲醇梯度洗脱，得到组分Fr.4A-Fr.4F共6个组分，Fr.4A为1.2g，Fr.4B为2.4g，Fr.4C为0.8g，Fr.4D为4.1g，Fr.4E为1.9g，Fr.4F为3.8g。Fr.4B经半制备高效液相色谱仪，以乙腈-水(体积比60:40)作为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集35~37min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到白色无定型粉末式目标化合物dumetorumaneB（19mg）。
实施例6本发明化合物的结构鉴定
取实施例1制备的化合物dumetorumaneB（黑果土当归二萜酸B），为白色无定型粉末（溶剂为氯仿）；测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。
=+43.5°(c0.45,CHCl3);IR(KBr)谱在3345,2969,1711,1652,1123,1067cm-1有吸收，表明分子中存在羧基、羟基和双键。HRESI-MS(附图1)显示其准分子离子峰m/z317.2131[M-H]-(calcd.317.2116)，结合NMR谱确定其分子式为C20H30O3，不饱和度为6。1HNMR(附图2，数据归属见表1)显示分子中有3个甲基单峰，分别为δH1.25(3H,s),1.18(3H,s)及0.81(3H,s))，有1个连氧亚甲基峰（δH3.72(1H,dd,J=11.2,7.2Hz)；3.60(1H,dd,J=11.2,8.0Hz)）;13CNMR(附图3及附图4，数据归属见表1)显示分子中有20个碳，其中有6个季碳，3个次甲基，8个亚甲基，及3个甲基。结合HSQC相关谱(附图5)，并对比文献数据可证实,该化合物与已知化合物acasianeA结构相似,为含有1个三元小环的二萜类化合物,区别在于分子中多了1个羰基(δC182.7)和1个双键(δC127.8及135.5)，少了1个连氧亚甲基(δC63.8)和2个次甲基(δC56.3及37.1)；进一步经HMBC相关(附图6)证实C-18（羰基）与C-4位相连，C-8及C-9位为一双键。进一步经HMBC相关(附图6)、COSY相关(附图7)和ROESY(附图8)及与文献(LinA.S.,LinC.R.,DuY.C.,LübkenT.,ChiangM.Y.,ChenI.H.,WuC.C.,HwangT.L.,ChenS.L.,YenM.H.,ChangF.R.,WuY.C.AcasianeAandBandfarnesiraneAandB,diterpenederivativesfromtherootsofAcaciafarnesiana.PlantaMed2009,75:256-261.)对比证实，使化合物的结构最终得到确认，命名为dumetorumaneB。
实施例7
取实施例2制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C20H30O3。确认实施例2制备的化合物为所述的四环二萜类化合物dumetorumaneB。
实施例8
取实施例3制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C20H30O3。确认实施例3制备的化合物为所述的四环二萜类化合物dumetorumaneB。
实施例9
取实施例4制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C20H30O3。确认实施例4制备的化合物为所述的四环二萜类化合物dumetorumaneB。
实施例10
取实施例5制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C20H30O3。确认实施例5制备的化合物为所述的四环二萜类化合物dumetorumaneB。
实施例11本发明化合物抗肿瘤活性检测
取实施例1~5所制备的任一四环二萜类化合物进行抗肿瘤活性检测试验，试验情况如下：
采用改良MTT法评价四环二萜类化合物对肿瘤细胞的增值抑制作用；
取备用的肿瘤细胞悬液接种于96孔培养板，90μL/孔，继续培养24h后加入不同浓度的受试样品，10μL/孔，使其终浓度为100、10、1、0.1、0.01μg/mL，每个浓度均设3个复孔。顺铂（DDP）为阳性对照，等体积RPMI1640培养基为阴性对照。同时设化合物100、10μg/mL时相应的DMSO浓度为溶媒对照，以消除DMSO对细胞生长的影响。加药后继续置于37℃，5%CO2培养箱培养72h，每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，继续培养4h，每孔加入三联液[10%SDS-5%异丁醇—0.012mol/LHCl（W/V/V）]100μL溶解甲臜。用酶标仪在570nm波长下测定各孔的OD值。
按下列公式计算细胞增值抑制率：
抑制率（%）=（OD值对照孔—OD值给药孔）/OD值对照孔×100%
数据统计分析：采用MicrosoftExcel2003计算抑制率，采用logit法，SPSS11.5软件包计算半数抑制浓度IC50。
计算半数抑制浓度IC50，对人肺腺癌细胞株(A549)、人急性早幼粒白血病细胞株(NB4)及人乳腺癌细胞株(MCF7)的半数抑制浓度(IC50)测定结果分别为6.7±0.5μM，4.2±0.3μM，5.3±0.6μM，表明本发明的化合物具有较好的抗肿瘤活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。