技术领域
本发明涉及一种金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C204及其筛选方法和应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌肠毒素是由金黄色葡萄球菌分泌的具有超抗原活性的外毒素。金黄色葡萄球菌肠毒素可不经抗原提呈细胞加工，直接与MHCⅡ类分子非限制性的结合，形成的复合物与T淋巴细胞抗原受体的β链V区结合，大量激活T淋巴细胞，使其活化、增殖，并释放大量的炎性细胞因子引起强烈的免疫应答，最终导致炎症失控和多器官的损害，引起毒素休克等疾病。此外，由于金黄色葡萄球菌肠毒素较能抗消化，耐热以及只需很小剂量就可引发T细胞应答，金黄色葡萄球菌肠毒素也被作为肿瘤治疗的超抗原药物。
金黄色葡萄球菌肠毒素有多个血清型，分别是A型、B型、C1型、C2型、C3型、D型、E型、G型、H型、I型、M型、N型、O型和毒性休克综合症1型毒素、毒性休克综合症2型毒素等，其中金黄色葡萄球菌肠毒素C2不仅与金黄色葡萄球菌相关感染有关，同时也是金黄色葡萄球菌肠毒素中应用最多的超抗原药物。
检测金黄色葡萄球菌肠毒素C2主要采用免疫学方法，包括沉淀反应、凝集反应、ELISA、固相RIA、生物传感器等，这些方法使用抗体作为金黄色葡萄球菌肠毒素C2检测的识别元件，而抗体的制备存在周期长，步骤繁琐，成本高等不足之处。近年来，以检测金黄色葡萄球菌肠毒素C2基因为目标的分子生物学方法发展较快，但PCR等分子生物学方法仍存在假阳性、假阴性等技术难题。因此，研制具有更高灵敏度、经济、简便的金黄色葡萄球菌肠毒素C2检测新技术，对于食品卫生监督、临床金黄色葡萄球菌感染的诊疗等都有重要意义。
治疗金黄色葡萄球菌肠毒素C2引起的毒素休克，临床常采用抗炎、补液等对症支持疗法。最新研究发现，抑制金黄色葡萄球菌肠毒素C2的超抗原活性，在初始阶段阻断炎症级联反应的发生，是治疗金黄色葡萄球菌肠毒素C2相关疾病的有效策略。基于此策略，研制各种多肽药物、抗体药物、疫苗等，已成为的金黄色葡萄球菌肠毒素C2生物技术新药研究的热点。
金黄色葡萄球菌肠毒素C2超抗原药物的获得，常采用基因克隆的方法，将金黄色葡萄球菌肠毒素C2基因片段克隆至原核表达载体中，在大肠杆菌中表达并纯化。但这种方法中纯化步骤常采用离子交换方法或带标签的亲和纯化方法，前者吸附选择特异性差，后者试剂成本较高。
适配体又被称为“合成抗体”、“化学抗体”，其化学本质是一条单链寡核酸分子(ssDNA或RNA)折叠成特定三维结构与靶物质高亲和力和高特异性结合。适配体的获得通过指数富集配体的系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,SELEX)的体外筛选过程。核酸适配体具有高亲和力、高特异性、可体外合成、可通过修饰改变其功能及药代动力学特性、无免疫原性、经济等特点。基于上述优势开发的核酸适配体药物可特异性阻断靶标功能；将核酸适配体作为识别元件，还可开发简便、精准的检测新技术以及高效、经济的亲和纯化系统。因此，筛选出高特异性、高亲和力结合金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体具有重要的科研、临床和市场价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高特异性和高亲和力的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C204及其筛选方法和应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C204，它的序列如下：
AGGGCCGAGCTCACTTGTCTTAGTCCGACATGGTGCCTCC 40
CTGCCCCAGAGCTCCGCCGGCACAATTGTGC 71
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C204的筛选方法，基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以金黄色葡萄球菌肠毒素C2为靶标，通过金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠从ssDNA文库中筛选得到与金黄色葡萄球菌肠毒素C2特异性结合的核酸适配体。
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C204的应用，在分离、纯化金黄色葡萄球菌肠毒素C2中的应用。
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C204的应用，在分析检测金黄色葡萄球菌肠毒素C2中的非疾病诊断和治疗方法应用。
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C204的应用，在金黄色葡萄球菌肠毒素C2为效应分子的靶向治疗中的应用。
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C204的应用，在治疗金黄色葡萄球菌感染中以及在治疗金黄色葡萄球菌肠毒素C2引起相关综合症中的应用。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
1.该核酸适配体C204无毒性，分子量小，渗透性好，易于合成与标记。
2.该核酸适配体C204的合成成本较抗体制备的成本低，且周期短，重现性好。
3.该核酸适配体C204能高亲和力、高特异性地与金黄色葡萄球菌肠毒素C2结合，解离常数为5.7±0.26nM，且它对其他同源蛋白不具有识别功能。
4.该核酸适配体C204在金黄色葡萄球菌肠毒素C2的分离、纯化，金黄色葡萄球菌肠毒素C2相关的食品安全检测，金黄色葡萄球菌肠毒素C2相关疾病的诊断和治疗，金黄色葡萄球菌感染的诊断和治疗，金黄色葡萄球菌肠毒素C2介导的靶向治疗等领域方面具有广阔的应用前景和重要的科学、社会、经济价值。
附图说明
图1为核酸适配体C204二级结构的生物学信息学模拟图。
图2为荧光结合率实验分析核酸适配体C204的特异性图。在图2中，横坐标为分析的蛋白，纵坐标为荧光结合率。
图3为荧光结合率实验分析核酸适配体C204结合金黄色葡萄球菌肠毒素C2的解离常数绘制曲线。解离常数(Kd)为5.7±0.26nM。在图3中，横坐标为DNA浓度(pM)，纵坐标为荧光结合率。
图4为CCK-8法测定核酸适配体C204对金黄色葡萄球菌肠毒素C2诱导的PBMC增殖活性的作用。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
一种金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C204，它的序列如下：
AGGGCCGAGCTCACTTGTCTTAGTCCGACATGGTGCCTCC 40
CTGCCCCAGAGCTCCGCCGGCACAATTGTGC 71
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C204，在25℃，100mM Na+，1mM Mg2+的条件下，其空间结构如下：
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C204，对所述核酸适配体C204的5’端或3’端进行FITC、氨基、生物素、地高辛化学修饰。
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C204，对所述核酸适配体C204做截短或延长或部分碱基替换的结构改造所得到的产物进行FITC、氨基、生物素、地高辛化学修饰。
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C204的筛选方法，基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术，利用羧基磁珠作为固相介质，以金黄色葡萄球菌肠毒素C2为靶标，通过金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠从ssDNA文库中筛选得到与金黄色葡萄球菌肠毒素C2特异性结合的核酸适配体。
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C204的筛选方法，它包括以下步骤：
(1)筛选文库的准备：准备以下序列所示的随机ssDNA文库：
5’-AGGGCCGAGCTCACTTGT-N35-CCGCCGGCACAATTGTGC-3’；
(2)将金黄色葡萄球菌肠毒素C2与羧基磁珠偶联制备金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠；
(3)将ssDNA文库进行热激活处理；
(4)将经步骤(3)后的ssDNA文库与步骤(2)所得的金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠进行孵育；
(5)磁性分离经步骤(4)后的金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠，洗去金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠表面未结合、弱结合及非特异性结合的ssDNA；加热金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠，收集与金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠特异性结合的ssDNA，即ssDNA富集文库；
(6)PCR扩增：将步骤(5)所得的ssDNA富集文库进行PCR扩增，其中PCR扩增所用的引物为：
引物P1：5’-FAM-AGGGCCGAGCTCACTTGT-3’
引物P2：5’-Biotin-GCACAATTGTGCCGGCGG-3’；
(7)PCR产物的纯化：利用小片段纯化试剂盒对PCR产物进行纯化；将纯化后的dsDNA与链霉亲和素磁珠进行孵育，结合dsDNA的链霉亲和素磁珠经洗涤、dsDNA解链后，用磁力架分离，收集上清；上清经乙醇沉淀后获得用于下一轮筛选的次级ssDNA文库；
(8)循环筛选：将步骤(7)所得的FAM标记的次级ssDNA文库，作为下一轮筛选的次级文库，并重复步骤(3)～(7)的筛选过程。
实施例一：核酸适配体C204的筛选
所述的金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C204的筛选方法，它包括以下步骤：
(1)筛选文库的准备：设计两端固定区域为18个核苷酸、中间随机区域为35个核苷酸的随机ssDNA文库(5’-AGGGCCGAGCTCACTTGT-N35-CCGCCGGCACAATTGTGC-3’)，并委托生工生物工程股份有限公司合成。
(2)金黄色葡萄球菌肠毒素C2与羧基磁珠偶联：所述金黄色葡萄球菌肠毒素C2蛋白购自美国Toxin Technology公司，所述羧基磁珠及其偶联试剂购自美国Bangs Laboratories公司，操作参照制造商提供的说明书；通过BCA法蛋白浓度测定耦联前后金黄色葡萄球菌肠毒素C2溶液中蛋白浓度的变化，经计算磁珠的耦联效率为85％；将金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠分散于PBS缓冲液中，4℃保存。
(3)取2nmol随机ssDNA文库溶于500μL选择缓冲液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM MgCl2，5mM KCl，pH7.4)，然后经热激活处理。其中，热激活处理的方法为：95℃变性5min后，立即置于冰水浴中冰浴10min，随后置于室温10min。
(4)将经步骤(3)后的ssDNA文库与步骤(2)所得的金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠(金黄色葡萄球菌肠毒素C2载量为100ng)以及酵母tRNA(摩尔量为ssDNA文库的5倍)混合并于室温孵育1h。
(5)磁性分离经步骤(4)后的金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠，用含0.2％BSA的选择缓冲液洗去金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠表面未结合、弱结合及非特异性结合的ssDNA；然后将金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠用200μL ddH2O重悬，100℃热水浴5min后，置于磁力架1-2min，收集上清，获得与金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠特异性结合的ssDNA，即ssDNA富集文库。
(6)PCR扩增：将步骤(5)所得的ssDNA富集文库加入到1mL PCRmix中；漩涡振荡混匀后，按每管50μL分装进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性5min后；94℃变性30S，58℃退火30S，72℃延伸30S，15-25个循环。
其中1mL PCRmix中含有：10×PCR缓冲液100μL；pfu酶3μL；dNTP 20μL；引物P1：5’-FAM-AGGGCCGAGCTCACTTGT-3’和引物P2：5’-Biotin-GCACAATTGTGCCGGCGG-3’各3μL；所述引物P1和引物P2均委托生工生物工程股份有限公司合成。
(7)PCR产物的纯化：两端分别标有生物素和荧光基团FAM的PCR产物，使用小片段纯化试剂盒纯化(所述的小片段纯化试剂盒购自生工生物工程股份有限公司)，将纯化后的dsDNA与链霉亲和素磁珠(购自Invitrogen-Dynal公司)在37℃孵育20min，用洗涤缓冲液(5mM Tris-HCl，pH7.5，1M NaCl，500μMEDTA)洗涤结合dsDNA的链霉亲和素磁珠三次后，用50μL NaOH溶液(0.1M)在37℃孵育30min使dsDNA解链；用磁力架分离，收集上清，上清经乙醇沉淀获得FAM标记的次级ssDNA文库，并溶解于选择缓冲液中，作为下一轮筛选的次级文库。
(8)筛选过程共进行9轮。从第二轮开始，次级文库的用量均为50pmol。
实施例二：核酸适配体C204序列的分析：
(1)经过9轮筛选后，收集富集的ssDNA文库，并委托上海派森诺生物科技股份有限公司利用高通量测序技术对文库序列进行分析，分析过程为：PCR扩增富集文库，并加上测序接头和Index部分；通过凝胶电泳选择纯化文库；利用Agilent 2100Bioanalyzer通过Agilent High Sensitivity DNA Kit对文库质控；利用Quant-iT PicogGreen dsDNA Assay Kit对文库进行定量；利用IlluminateNextSeq 500平台，以单链文库为模板进行桥式PCR扩增、测序引物退火、边合成边测序；并对测序结果进行比对和富集分析。
(2)利用UNAFold网络平台分析在25℃，100mM Na+，1mM Mg2+的条件下，核酸适配体C204序列的二级结构。分析出核酸适配体C204序列的二级结构示意图如图1所示。
实施例三：核酸适配体C204的特异性分析：
(1)体外化学合成FAM标记的核酸适配体C204，并将其溶于选择缓冲液。
(2)参照实施例一中步骤(2)，将BSA、金黄色葡萄球菌肠毒素A、金黄色葡萄球菌肠毒素B以及金黄色葡萄球菌肠毒素C1分别与羧基磁珠耦联制备BSA磁珠、金黄色葡萄球菌肠毒素A磁珠、金黄色葡萄球菌肠毒素B磁珠、金黄色葡萄球菌肠毒素C1磁珠以及金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠。其中，所述BSA购自Sigma公司，所述金黄色葡萄球菌肠毒素A、金黄色葡萄球菌肠毒素B以及金黄色葡萄球菌肠毒素C1均购自美国Toxin Technology公司。
(3)取200μL步骤(1)所得的核酸适配体C204溶液分别与步骤(2)制得的BSA磁珠、金黄色葡萄球菌肠毒素A磁珠、金黄色葡萄球菌肠毒素B磁珠、金黄色葡萄球菌肠毒素C1磁珠以及金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠混合，在暗盒中室温孵育1h，设空白磁珠为对照。
(4)用0.1％PBST洗涤经步骤(3)的上述磁珠3遍，与上述磁珠结合的核酸适配体，用200μL选择缓冲液100℃煮沸5min洗脱。
(5)利用荧光定量仪分别测定初始溶液和洗脱液的荧光强度，计算荧光结合率＝(初始荧光强度-洗脱荧光强度)/初始荧光强度×100％，用计算值初步代表核酸适配体C204与靶分子的结合率。
如图2所示，核酸适配体C204与金黄色葡萄球菌肠毒素C2的结合率均显著高于其与BSA、金黄色葡萄球菌肠毒素A、金黄色葡萄球菌肠毒素B、金黄色葡萄球菌肠毒素C1的结合率，表明核酸适配体C204与金黄色葡萄球菌肠毒素C2的结合具有较好的特异性。
实施例四：核酸适配体C204的亲和力分析
(1)取不同浓度的FAM标记核酸适配体C204溶液分别与金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠混合，在暗盒中室温孵育1h。
(2)参照实施例三中的步骤(4)和步骤(5)，实验获得并计算不同浓度核酸适配体C204溶液与金黄色葡萄球菌肠毒素C2磁珠的荧光结合率。
(3)利用荧光结合率的计算值，绘制核酸适配体C204结合金黄色葡萄球菌肠毒素C2的饱和结合曲线，通过非线性回归分析计算核酸适配体C204结合金黄色葡萄球菌肠毒素C2的解离常数。
如图3所示，我们获得了核酸适配体C204的饱和结合曲线，经计算核酸适配体C204的解离常数为5.7±0.26nM，表明核酸适配体C204与金黄色葡萄球菌肠毒素C2结合的结合能力强，解离常数在纳摩尔级别。
实施例五：核酸适配体C204抑制金黄色葡萄球菌肠毒素C2的超抗原活性
(1)无菌抽取健康成年志愿者外周血，肝素抗凝后用等量RPMI1640培养液稀释，置于淋巴细胞分离液上，采用常规密度梯度离心法(2000rmp，20min)分离获取人外周血单个核细胞(PBMCs)。
(2)用含5％新生牛血清(NBS)和5％人自体血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为1～2×106/mL，铺96孔板，每孔100μL。
(3)各组加入核酸适配体C204的浓度分别依次为0μM、10μM，每孔加入终浓度为250ng/mL的金黄色葡萄球菌肠毒素C2，设置即不加金黄色葡萄球菌肠毒素C2，也不加核酸适配体C204的空白对照组。
(4)将细胞置于37℃、5％CO2的CO2培养箱中培养，培养24h后，每孔加入10μL的CCK-8，继续培养4h。
(5)分光光度计检测每孔在450nm的吸光度(OD)。
如图4所示，横坐标为核酸适配体C204的浓度，纵坐标为450nm处的OD值。当核酸适配体C204为10μM时，金黄色葡萄球菌肠毒素C2刺激PBMCs的增殖水平明显降低(P＜0.05)，上述结果表明核酸适配体C204在体外实验中对金黄色葡萄球菌肠毒素C2的超抗原活性具有明显地抑制作用，是一种潜在的金黄色葡萄球菌肠毒素C2抑制剂。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军南京军区福州总医院
<120> 金黄色葡萄球菌肠毒素C2的核酸适配体C204及其筛选方法和应用
<160> 3
<210> 1
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agggccgagc tcacttgtct tagtccgaca tggtgcctcc 40
ctgccccaga gctccgccgg cacaattgtg c 71
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agggccgagc tcacttgt 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcacaattgt gccggcgg 18