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1、(10)授权公告号 CN 102101867 B (45)授权公告日 2012.07.04 CN 102101867 B *CN102101867B* (21)申请号 201010576224.9 (22)申请日 2010.12.07 C07D 513/04(2006.01) C12P 17/18(2006.01) A61K 31/542(2006.01) A61P 31/12(2006.01) A61P 31/22(2006.01) C12R 1/55(2006.01) (73)专利权人 中国医学科学院医药生物技术研 究所 地址 100050 北京市崇文区天坛西里 1 号 (72)发明人 武。
2、临专 王以光 倪四阳 王红远 (74)专利代理机构 北京华科联合专利事务所 11130 代理人 杨厚 王为 (54) 发明名称 噻嗪酮格尔德霉素及其制备方法和用途 (57) 摘要 本发明涉及格尔德霉素生物合成类似物噻嗪 酮格尔德霉素 TGDM， 所说类似物是由吸水链霉菌 17997 直接发酵、 提取、 分离得到的新产物 ； 实验 研究结果表明， 所说类似物与格尔德霉素相比， 其 生物学活性与格尔德霉素相近， 而水溶性和光稳 定性均比格尔德霉素有非常显著的提高， 有望开 发成为临床有用的抗病毒药物。 (51)Int.Cl. 审查员 孙一 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 4 页 (19)。
3、中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 一种格尔德霉素生物合成类似物 - 噻嗪酮格尔德霉素 TGDM， 其化学结构如式 (1) 所 示 2. 制备权利要求 1 所述 TGDM 的方法， 包括以下步骤 ： 对格尔德霉素产生菌进行发酵培养 ； 用等量乙酸乙酯萃取发酵液上清 ； 乙酸乙酯萃取 液经浓缩获得粗品 ； 在硅胶柱上用石油醚-乙酸乙酯混和液洗脱， 分部收集 ； 以TLC或HPLC 进行检测， 再经 Sephadex LH-20 色谱和制备型 HPLC， 得到 TGDM 纯品。 3. 权利要求 1 所述类似物 TG。
4、DM 在制备抗病毒药物中的应用。 4. 权利要求 1 所述类似物的药物组合物， 系以所述类似物为有效成分， 与药学上可接 受的一种或多种载体所组成。 5. 权利要求 4 所述组合物在制备抗病毒药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102101867 B 2 1/6 页 3 噻嗪酮格尔德霉素及其制备方法和用途 技术领域 ： 0001 本发明涉及一种新的格尔德霉素生物合成类似物及其制备方法， 具体而言， 涉及 噻嗪酮格尔德霉素及其制备方法和在抗病毒中的应用。 技术背景 ： 0002 格尔德霉素 (geldanamycin， GDM) 是一种苯 ( 醌型 ) 安莎类抗生素， 具有抗原虫、 抗肿瘤。
5、、 抗病毒以及免疫抑制等多种生物学活性 Sasaki K et al.J Antibiot(Tokyo)， 1979， 32(8) ： 849-51 ； 陶佩珍等， 中国抗生素杂志， 1997， 22 ： 368-372。 0003 GDM是人热休克蛋白90(heat shock protein 90， Hsp90)的特异性抑制剂。 Hsp90 是人体内许多信号蛋白的伴侣分子 ； GDM 通过对 Hsp90 的抑制， 可以间接影响人体细胞内信 号蛋白的功能， 因此有望成为一种颇具潜力的抗肿瘤和抗病毒药物 ； 但是 GDM 具有毒性大、 水溶性小、 光稳定性差等缺点。毒性大会限制其使用剂量， 水。
6、溶性小会减少其生物利用度， 光稳定性差会对其制造加工和保存带来不利影响 ； 这些缺陷将限制其开发成为有效药物。 所以， 寻找一种毒性低、 水溶性好、 光稳定性高的衍生物， 已成为其研究的主要目标之一。 目 前， 已有两个在 GDM 的 C17 位进行取代的衍生物17-AAG 和 17-DMAG， 在美国进行 II 期 和I期临床试验Goetz MP et al.J Clin Oncol， 2005， 23(6) ： 1078-1087 ； Glaze ER et al.Cancer Chemother Pharmacol， 2005， 56(6) ： 637-647。 0004 链霉菌次级代谢。
7、产物通常具有复杂的生物合成机制， 造成微生物次级代谢产物通 常具有复杂的化学结构， 难以化学全合成或化学全合成的成本甚高。 同时， 链霉菌次级代谢 产物生物合成途径中的部分生物合成步骤对底物的特异性有限， 或生物合成途径本身具有 分支或交叉， 造成微生物次级代谢产物通常为一组结构类似的化合物 ； 这种情况在抗生素 ( 链霉菌次级代谢产物 ) 中比较普遍， 形成抗生素的多组分现象。对于多组分抗生素， 不同 组分之间往往具有不同程度的生物活性及毒性， 或不同组分具有不同的生物学活性。 例如， 十四元大环内酯类抗生素红霉素具有 A、 B、 C、 D、 E 和 F 六个结构类似物 ( 组分 )， 其中。
8、 A 是 主要组分， 抗菌活性较高而毒性又较小。再例如， 萘安莎类抗生素利福霉素， 具有 A、 B、 C、 D、 E、 G、 SV 等十余种组分， 其中 SV 组分是半合成利福霉素类药物的重要原料。因此， 对抗生素 的生物合成类似物 ( 不同组分 ) 进行研究， 不仅可以对抗生素的生物合成机制有深入的了 解， 而且对新抗生素研制与开发具有重要的实用价值。 0005 在微生物次级代谢产物中， 大贝菌素 (macbecin)、 除莠霉素 (herbimyicn) 和安丝 菌素 (ansamitocin) 等也属于苯安莎类抗生素， 它们与 GDM 具有类似的化学结构。大贝菌 素、 除莠霉素和安丝菌素。
9、均已发现具有多个生物合成类似物， 特别是安丝菌素的生物合成 类似物数量较多。在 GDM 产生菌中， 已经报道了 4， 5- 双氢格尔德霉素和氢醌型格尔德霉素 等 GDM 生物合成类似物。 0006 但是， 从格尔德霉素 (GDM) 产生菌中发现并得到格尔德霉素生物合成新类似物噻 嗪酮格尔德霉素 (thiazinogeldanamycin， TGDM) 的研究， 迄今为止， 尚未见有国内外的有 关报道。 说 明 书 CN 102101867 B 3 2/6 页 4 0007 吸水链霉菌 17997(Streptomyces hygrocopicus 17997) 是中国医学科学院医药 生物技术研。
10、究所从我国土壤中分离到的格尔德霉素 (geldanamycin， GDM) 产生菌。目前， 已经从该菌株中克隆了格尔德霉素的部分生物合成基因簇 赫卫清等 . 吸水链霉菌 17997 格尔德霉素部分生物合成基因簇的克隆和分析 . 生物工程学报， 2006， 22(6) ： 902-906， ， 并对多个生物合成基因进行了功能研究 赫卫清等 . 格尔德霉素生物合成基因功能的验 证 .2008， 24(7) ： 1133-1139。此外， 在吸水链霉菌 17997 的发酵产物中发现了 4， 5- 双氢 格尔德霉素等格尔德霉素生物合成类似物 张侃等 . 吸水链霉菌 17997 产生的 4， 5- 双氢。
11、 格尔德霉素的鉴别与检测.中国抗生素杂志， 2009， 34(5) ： 268-272 ； 倪四阳等.高效液 相色谱 - 串联质谱分析微量格尔德霉素类似物 . 生物工程学报， 2009， 25(6) ： 847-853。 0008 本发明的目的是， 在已有研究的基础上， 寻找一种不仅具有生物学活性， 而且水溶 性好、 光稳定性好的格尔德霉素 (GDM) 生物合成新衍生物， 为临床应用提供一种有效手段。 发明内容 ： 0009 本发明提供一种从GDM产生菌吸水链霉菌17997中获得的生物合成类似物噻嗪 酮格尔德霉素 (thiazinogeldanamycin， TGDM)， 其化学结构如式 1 。
12、所示。 0010 0011 本发明还提供了噻嗪酮格尔德霉素 (TGDM) 的制备方法， 具体包括以下步骤 ： 0012 1、 吸水链霉菌17997的发酵及TGDM的检测 ： 将新鲜的吸水17997平板或斜面培养 物， 挖块接种于液体发酵培养基中， 振荡培养， 取发酵液少量， 离心， 上清液用乙酸乙酯提取 浓缩， 进行硅胶板 TLC 分离和 NaOH 显色， 显示棕色的条带为 TGDM。 0013 2、 TGDM 的获得 ： 将吸水链霉菌 17997 的发酵培养物上清液， 用等体积乙酸乙酯萃 取， 乙酸乙酯萃取液经旋转蒸发浓缩获得粗品， 利用硅胶柱和石油醚 - 乙酸乙酯混和液进 行洗脱， 分部收。
13、集， 以 TLC 或 HPLC 进行检测， 再经制备型 HPLC 获得 TGDM 纯品。 0014 3、 TGDM 的结构鉴定 ： 用高分辨质谱确定 TGDM 的精确分子质量， 元素分析显示其分 子中含有 1 个硫原子， 据此确定其分子式 ； 经 1H- 和13C-NMR 分析， 并通过化学结构解析， 确 定 TGDM 的化学结构为噻嗪酮格尔德霉素。 0015 本发明还提供了 TGDM 的水溶性和光稳定性实验研究， 结果表明， TGDM 的水溶性比 GDM 提高了约 1000 多倍， 光稳定性也比 GDM 有显著提高。 0016 本发明还提供了 TGDM 的生物学活性实验研究。结果表明， 所述。
14、 TGDM 的抗病毒活 说 明 书 CN 102101867 B 4 3/6 页 5 性略优于 GDM。 0017 发明效果 ： 0018 本发明从 GDM 产生菌吸水链霉菌 17997 的发酵培养物中发现了一种新的 GDM 生 物合成类似物， 经分离纯化、 结构解析， 确证其为新的格尔德霉素生物合成类似物噻嗪酮格 尔德霉素 (TGDM)。TGDM 具有抗病毒、 抗肿瘤和免疫抑制活性 ； TGDM 的水溶性相对于 GDM 有 非常显著的提高 ； TGDM 的光稳定性也比 GDM 好。因此， 噻嗪酮格尔德霉素 (TGDM) 有望研制 成为抗病毒、 抗肿瘤和免疫抑制的药物或其先导化合物。 附图说明。
15、 ： 0019 图 1TGDM 的硅胶板 TLC 检测 0020 其中 ： 1、 3- 发酵培养液中没有添加半胱氨酸 ； 0021 2、 4- 发酵培养液中添加了半胱氨酸 0022 图 2TGDM 的 1H-NMR 图谱 0023 图 3TGDM 的 13C-NMR 图谱 0024 图 4TGDM 与 GDM 的光稳定性比较 0025 其中 ： A-GDM 光稳定性 ； 0026 B-TGDM 光稳定性 0027 实施方案 ： 0028 以下所列实施例是为帮助本领域技术人员更好地理解本发明， 但不以任何方式限 制本发明。 0029 吸水链霉菌 17997 的发酵培养 0030 新鲜的吸水链霉菌。
16、 17997 斜面 ( 培养基组成为 ： 酵母提取物 0.4， 麦芽提取物 1.0， 葡萄糖 0.4， 琼脂粉 1.5 ) 挖块接种于液体种子培养基 ( 葡萄糖 0.5， 酵母提 取物 0.4， 玉米浆 0.5， 棉子饼粉 0.25， KH2PO4 0.05， MgSO4 0.05， CaCO3 0.3 ) 中， 28振荡 (100-300r/min) 培养 24-48h ； 5 -20转种量接种于液体发酵培养基 ( 淀 粉 2， 棉子饼粉 0.5， 葡萄糖 0.5， 玉米浆 1.0， 酵母粉 0.5， CaCO3 0.2 )， 28 继续振荡培养， 至 80-140h， 将所获发酵培养液离心。
17、， 弃菌体， 留上清液用于检测和分离提取 TGDM。 0031 吸水链霉菌 17997 发酵培养物中 TGDM 的检测 0032 实施例 1 中所得上清液， 用等体积乙酸乙酯提取后， 溶于一定体积乙酸乙酯中， 点 样于 TLC 硅胶板上， 在乙酸乙酯二氯甲烷正己烷甲醇 (9 6 6 1.5) 溶媒系统 中展层 ； 用少量 NaOH(2.0mol/L) 溶液喷涂， 在硅胶板上可观察到一条棕色条带 ( 图 1)， 为 TGDM。如果用三氯化铁溶液喷涂， 则显示蓝色， 提示其分子中具有酚羟基结构。 0033 半胱氨酸提高吸水链霉菌 17997 发酵生产 TGDM 的水平 0034 按照实施例 1 中。
18、吸水链霉菌 17997 的发酵培养， 如果于发酵培养的 72-96h 期间补 加半胱氨酸， 至终浓度为 100-1000mg/L， 继续培养 24h， 硅胶板 TLC 检测发酵液中的 TGDM 水 平， 并与不补加半胱氨酸的发酵培养液中的 TGDM 水平进行比较， 结果显示， 补加半胱氨酸 的 TGDM 产量可提高 1 倍以上 ( 图 1)。 0035 TGDM 的分离纯化与制备 说 明 书 CN 102101867 B 5 4/6 页 6 0036 实施例 1 的发酵上清液， 或者如实施例 3 中补加了半胱氨酸的发酵上清液， 用等 体积乙酸乙酯提取， 旋转蒸发浓缩后上硅胶柱， 以石油醚 - 。
19、乙酸乙酯混和液 ( 起始比例为 19 1， 逐步提高乙酸乙酯的比例， 至 1 19) 进行洗脱， 分部收集洗脱液， 经 TLC 硅胶板检 测后， 合并含有 TGDM 的部分， 旋转蒸发浓缩后， 经 Sephadex LH-20 柱层析分离 ( 洗脱溶剂 为甲醇 )， 分部收集洗脱液， 经 TLC 硅胶板检测后， 合并含有 TGDM 的部分， 旋转蒸发浓缩后， 进行反相 HPLC(ODS-C18柱， 150mm20mm， 流动相为甲醇 - 水 14 11， 流速为 2-5ml/min)， 收集合并含有 TGDM 的洗脱液， 旋转蒸发浓缩， 得 TGDM 纯品。 0037 TGDM 化学结构的确定。
20、 0038 TGDM 纯品经高分辨质谱分析， 确定其精确分子质量为 656.27953( 加 Na) ； 对化合 物进行硫元素分析， 确证其分子中含有 4.77硫， 相当于分子中含有 1 个硫原子 ； 根据精确 分子质量数据和元素分析结果， 确定 TGDM 的分子式为 C31H43O8N3S(Na)。将化合物 TGDM 与 GDM 的 NMR 信号进行比较， 主要变化在于苯醌环上的信号差异， 并且多了一个羰基和一个亚 甲基， 并且苯醌结构被还原为其氢醌形式。化合物 TGDM 的 1H- 和13C-NMR 数据见表 1， NMR 图谱见图 2 和图 3 ； 结合化合物 TGDM 的 DEPT 和。
21、 HMBC 谱图， 其化学结构被确定为噻嗪酮格 尔德霉素 ( 式 1)。 0039 表 1 TGDM( 溶于 DMSO-d6) 的 NMR 数据 说 明 书 CN 102101867 B 6 5/6 页 7 0040 0041 TGDM 的水溶性和光稳定性测定 0042 水溶性测定 ： 首先， 采用 HPLC 方法建立 TGDM 和 GDM 的浓度峰面积标准曲线 ( 室 温， 25 )。然后， 分别将过量的 TGDM 或 GDM 溶于纯水中， 在室温 (25 )、 闭光条件下搅拌 12h， 高速离心后过滤上清液， 取 10l 上清液用 HPLC 测定 TGDM 或 GDM 的峰面积， 查标准曲。
22、 线， 计算出上清液中 TGDM 或 GDM 的浓度， 换算为溶解度 ( 单位为 mg/ml 或 g/ml)。实验 结果表明 ： TGDM 的溶解度为 1.165mg/ml， 而 GDM 的溶解度小于 1g/ml。因此， TGDM 比 GDM 的水溶性高 1000 多倍。 0043 光稳定性测定 ： 将 TGDM 溶液 (100g/ml， 溶于甲醇 - 水， 1 1) 和 GDM 溶液 (72g/ml， 溶于甲醇 - 水， 1 3) 置于相同的玻璃瓶中接受光照射 ( 光照强度为 4000lx)， 说 明 书 CN 102101867 B 7 6/6 页 8 在不同时间(20、 40、 60、 。
23、80、 100min)取样10l， 用HPLC测定样品中的TGDM或GDM峰面积， 查上述标准曲线， 计算其中的 TGDM 或 GDM 浓度， 与初始浓度进行比较， 得到光稳定性数据。 实验结果表明， GDM 在光照强度 4000lx、 光照时间 100min 时降解约 1/3， 而 TGDM 在相同条 件下基本没有降解 ( 图 4)。 0044 TGDM 的抗病毒活性测定 0045 细胞培养 ： 在长满猴肾细胞 (VERO， 上海坤肯生物化工有限公司 ) 的培养瓶内加 0.25胰酶 0.1ml， 0.02 EDTA 5ml， 37消化 20 25min， 废弃消化液， 加 Eagle s M。
24、EM 培养液 ( 上海典微生物技术公司 ) 吹打， 1 3 传代， 3d 长满， 配制成每毫升 20 30 万个 细胞， 接种96孔细胞培养板， 每孔0.1ml， 37， 5CO2培养24h， 细胞长成单层后进行实验。 0046 对疱疹病毒的抑制试验 ： 以每毫升 20 30 万个 VERO 细胞接种 96 孔细胞培养板， 每孔 0.1ml， 37， 5 CO2培养 24 小时， 弃培养液， 加入适量病毒， 吸附 1h 后， 弃病毒液， 加 入样品， 进行 3 倍系列稀释， 设 8 个稀释度， 每浓度 2 孔， 37 5 CO2培养。48h 观察细胞 病变， 完全破坏 100为 4 ； 75为。
25、 3 ； 50为 2 ； 25为 1 ； 无病变为 0。设细胞对照、 病毒对 照和阳性对照 ( 阿西洛韦 ACV)。按 Reed & Muench 法计算样品半数有效浓度 (IC50)。 0047 结果表明 ： TGDM 的 IC50 0.051g/ml ； GDM 的 IC50 0.082g/ml， TGDM 的抗病 毒活性略优于 GDM。 说 明 书 CN 102101867 B 8 1/4 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102101867 B 9 2/4 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 102101867 B 10 3/4 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 102101867 B 11 4/4 页 12 图 4 说 明 书 附 图 CN 102101867 B 12 。