技术领域
本发明属于生物分析领域，具体涉及一种天然水华蓝藻中微囊藻毒素的降解菌的分离与鉴定。
背景技术
微囊藻毒素(microcystins，MCs)是由淡水蓝藻中的微囊藻、颤藻及念珠藻等几类主要的淡水蓝藻产生的最常见的毒素。微囊藻毒素的主要结构为环 D- 丙氨酸- R1- R2- 赤- β- 甲基- D- 异天冬氨酸- L- Z-adda- D- 异谷氨酸- N- 甲基脱氢丙氨酸，至今已发现 80 种以上的微囊藻毒素异构体。微囊藻毒素主要是对两种蛋白磷酸酶（PP-1和PP-2A）的活性，从而产生强烈的肝毒性及诱发癌症，对哺乳动物具有极大的威胁。在所有淡水蓝藻产生的毒素中，微囊藻可能是危害最严重的，它常在富营养化的浅湖泊或池塘中大量发生。
近来随着人类生活方式的改变，城镇工业的迅速发展和城市人口的增加，生活污水和部分工业废水大量注入湖泊致使湖泊渐渐富营养化。水体环境富营养化引起的蓝藻水华问题在我国已日趋严重，淡水湖泊如滇池、太湖和巢湖，每年夏秋季都会爆发高浓度的蓝藻水华，对水体生态系统和人类健康带来直接或潜在的严重危害。物理化学方法治理微囊藻毒素污染耗费大量财力物力, 并且治标不治本, 甚至还有可能对水体造成二次污染 ,而微生物去除微囊藻毒素具有成本低、安全性强、利于生态修复等优点 , 是一种去除微囊藻毒素很有前途的方法。目前，已报道的降解微囊藻毒素纯菌株有鞘氨醇单胞菌、铜绿假单胞菌、伯克氏菌等多种鞘氨醇单胞菌属，但此类菌株对微囊毒素的降低作用十分有限，研究显示，采用恶臭假单胞菌降解微囊毒素时，5d后的降解率仅为55.3%。为此，本发明提供一种微囊毒素降解能力更强的菌株，以期为微囊藻毒素的微生物降解提供更好的更高效的方法。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种微囊毒素降解能力更强的菌株，且该菌的筛选成本低，可满足实际大量应用的需求。
本发明的技术方案如下：
一种天然水华蓝藻中微囊藻毒素的降解菌的分离与鉴定,包括以下步骤：
（1）制备微囊藻毒素粗品：取天然水华的新鲜蓝藻5-10g，置于碾钵中研碎后加提取溶剂，放入磁力搅拌器中搅碎1-2h，离心，取上清液；取滤渣重复萃取3-5次，合并上清液，采用微孔滤膜过滤，将滤液采用PH调节剂调节PH至7.5-8后经0.45um微孔滤膜过滤，在30-60℃条件下蒸发浓缩，再将浓缩液采用0.45um微孔滤膜过滤，制得微囊藻毒素粗品；
（2）采用C18固相萃取柱进行洗脱制备微囊藻毒素纯品：将步骤（1）中制得的微囊藻毒素粗品，上样，先用20-50ml蒸馏水洗脱，再用20-50ml 20-35%的甲醇洗脱，最后用 40-60ml 40-80%的甲醇洗脱，利用柱层析系统分离、纯化，将纯化液移至玻璃定量管中，常温下离心，取上清液旋转蒸发蒸干溶剂，制得微囊藻毒素产品；
（3）微囊藻毒素的测定：采用微囊藻毒素检测试剂盒检测步骤（2）中制备的微囊藻毒素产品，将太湖腐烂的水华上清液添加于基础培养基中，28-30℃恒温培养，连续富集培养3次，根据菌落性状不同进行分离纯化；
（4）采用基因组提取试剂盒对提取菌株基因组DNA，进行PCR扩增，将所有菌株的16SrRNA基因通过软件比对，采用最大似然法与最大简约法构建系统发育树，并对基因序列采用Blast录入，观察该菌株所在分支，判断筛选菌株与已知菌株亲缘关系，并将该菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中培养，培养温度为25-40℃，Ph为7-8，观察该菌株生理生化特性，根据筛选菌株与已知菌株亲缘关系及其生理生化特性对该菌株进行鉴定；
（5）观察筛选菌株对微囊藻毒素的降解能力：将筛选菌株与恶臭假单胞菌接种至底物为初始浓度为15.4ng/L的M9培养基中，连续5d每24h取样1次，上清液以微孔滤膜过滤后，测定微囊藻毒素含量。
优选的，步骤（1）中所述的磁力搅拌的速度为2000-2500r/min。
优选的，步骤（1）中所述的提取溶剂选自50-80%的甲醇水溶液或酸溶液中的一种或多种。
优选的，所述的酸溶液选自2-5%的的甲酸溶液、2-5%的乙酸溶液或5-10%的三氯乙酸中的一种或多种。
优选的，所述的提取液为体积比为（30-40）：（60-70）的5%的乙酸溶液与80%的甲醇水溶液。
优选的，步骤（1）与步骤（2）中所述的离心速度为10000-12000r/min，离心时间为20-30min。
优选的，步骤（3）中所述的基础培养基为添加了1-3mg/L的微囊藻毒素的培养基。
优选的，步骤（2）中所述的柱层析系统参数为：层析柱直径2-4cm，长20-40cm，填料为15-20umC18硅胶，流动相为体积比为（30-45）:（50-60）:（0.03-0.12）的水、甲醇及乙酸；流速为2-5ml/min; 进样体积为2-5ml。
优选的，步骤（3）中所述的富集培养3次后的培养基中微囊藻毒素浓度依次为5-10 mg/L、10-20 mg/L、20-40 mg/L。
优选的，步骤（4）中所述的PCR引物采用细菌通用引物，所述的PCR反应条件为：94℃预变性 5 m i n , 94℃变性 30 s , 55℃退火 30 s , 72℃延伸 45 s , 38个循环, 最后 72℃延伸10 m i n , 4℃保存；反应结束后 , 取 5μL 反应液经1. 2%琼脂糖电泳 , E B 染色 ,紫外检测。
所述的PCR扩张时采用的细菌通用引物序列为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
所述的PCR产物由上海生工生物工程技术服务公司完成测序。
本发明与现有技术相比，有益效果体现在：
1. 动物组织中微囊藻毒素的提取溶剂主要包括体积比为1:4的正丁醇及甲醇的的水溶液、酸化的甲醇溶液等，而微囊藻毒素的两种常见的异构体具有不同的极性，因此，对提取溶剂选择性也有所不同。本发明中，对提取液的配方及组成成分的体积比均进行了优化，采用体积比为（30-40）：（60-70）的5%的乙酸溶液与80%的甲醇水溶液作为提取液时，微囊藻毒素的回收率可达90%以上。
2.目前，国内外有关微囊藻毒素降解菌的分离等相关研究中，微囊藻毒素种类、提取方法、菌株接种量及培养基成分等多种原因对筛选菌株的分离等均有不同程度的影响，本发明将筛选菌株与恶臭假单胞菌接种均接种于具有同样初始浓度的微囊藻毒素的相同培养基中，对相同实验条件下，两种菌株对微囊藻毒素的降解能力进行比较，实验更加严谨，结果也更为准确。
3.本发明中的筛选菌株选自太湖腐烂蓝藻，其在常温甚至高达40℃温度下，在常规PH范围内均可良好的生长，具有良好的环境兼容性，因此，将其作为微囊藻毒素的降解菌成本低廉，降解效果好，应用前景十分广阔。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明：
实施例1
一种天然水华蓝藻中微囊藻毒素的降解菌的分离与鉴定,包括以下步骤：
（1）制备微囊藻毒素粗品：取天然水华的新鲜蓝藻5g，置于碾钵中研碎后加50%的乙醇溶液，放入磁力搅拌器中以2000r/min搅碎1h，以10000r/min离心20min，取上清液；取滤渣重复萃取3次，合并上清液，采用微孔滤膜过滤，将滤液采用PH调节剂调节PH至7.5后经0.45um微孔滤膜过滤，在30℃条件下蒸发浓缩，再将浓缩液采用0.45um微孔滤膜过滤，制得微囊藻毒素粗品；
（2）采用C18固相萃取柱进行洗脱制备微囊藻毒素纯品：将步骤（1）中制得的微囊藻毒素粗品，上样，先用20ml蒸馏水洗脱，再用20ml 20%的甲醇洗脱，最后用 40ml 40%的甲醇洗脱，利用柱层析系统分离、纯化，将纯化液移至玻璃定量管中，以10000r/min常温下离心15min，取上清液旋转蒸发蒸干溶剂，制得微囊藻毒素产品；
（3）微囊藻毒素的测定：采用微囊藻毒素检测试剂盒检测步骤（2）中制备的微囊藻毒素产品，将太湖腐烂的水华上清液添加于含1mg/L的微囊藻毒素的培养基中，28℃恒温培养，连续富集培养3次，3次富集后的培养基中的微囊藻毒素的浓度依次为5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L根据菌落性状不同进行分离纯化；
（4）采用基因组提取试剂盒对提取菌株基因组DNA，进行PCR扩增，将所有菌株的16SrRNA基因通过软件比对，采用最大似然法与最大简约法构建系统发育树，并对基因序列采用Blast录入，观察该菌株所在分支，判断筛选菌株与已知菌株亲缘关系，并将该菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中培养，培养温度为25℃，Ph为7，观察该菌株生理生化特性，根据筛选菌株与已知菌株亲缘关系及其生理生化特性对该菌株进行鉴定；
（5）观察筛选菌株对微囊藻毒素的降解能力：将筛选菌株与恶臭假单胞菌接种至底物为初始浓度为15.4ng/L的M9培养基中，连续5d每24h取样1次，上清液以微孔滤膜过滤后，测定微囊藻毒素含量。
步骤（2）中所述的柱层析系统参数为：层析柱直径2cm，长20cm，填料为15umC18硅胶，流动相为体积比为30:50:0.03的水、甲醇及乙酸；流速为2ml/min; 进样体积为2ml。
优选的，步骤（4）中所述的PCR引物采用细菌通用引物，所述的PCR反应条件为：94℃预变性 5 m i n , 94℃变性30 s , 55℃退火 30 s , 72℃延伸 45 s , 38个循环, 最后 72℃延伸10min , 4℃保存；反应结束后 , 取5μL 反应液经1. 2%琼脂糖电泳 , EB 染色 ,紫外检测。
实施例2
一种天然水华蓝藻中微囊藻毒素的降解菌的分离与鉴定,包括以下步骤：
（1）制备微囊藻毒素粗品：取天然水华的新鲜蓝藻10g，置于碾钵中研碎后加2%的的甲酸溶液，放入磁力搅拌器中以2500r/min搅碎1h，以12000r/min离心30min，取上清液；取滤渣重复萃取5次，合并上清液，采用0.45um微孔滤膜过滤，将滤液采用PH调节剂调节PH至8后经0.45um微孔滤膜过滤，在60℃条件下蒸发浓缩，再将浓缩液采用0.45um微孔滤膜过滤，制得微囊藻毒素粗品；
（2）采用C18固相萃取柱进行洗脱制备微囊藻毒素纯品：将步骤（1）中制得的微囊藻毒素粗品，上样，先用50ml蒸馏水洗脱，再用50ml 35%的甲醇洗脱，最后用 60ml 80%的甲醇洗脱，利用柱层析系统分离、纯化，将纯化液移至玻璃定量管中，以12000r/min常温下离心30min，取上清液旋转蒸发蒸干溶剂，制得微囊藻毒素产品；
（3）微囊藻毒素的测定：采用微囊藻毒素检测试剂盒检测步骤（2）中制备的微囊藻毒素产品，将太湖腐烂的水华上清液添加于含3mg/L的微囊藻毒素的培养基中，30℃恒温培养，连续富集培养3次，3次富集后的培养基中的微囊藻毒素的浓度依次为10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L根据菌落性状不同进行分离纯化；
（4）采用基因组提取试剂盒对提取菌株基因组DNA，进行PCR扩增，将所有菌株的16SrRNA基因通过软件比对，采用最大似然法与最大简约法构建系统发育树，并对基因序列采用Blast录入，观察该菌株所在分支，判断筛选菌株与已知菌株亲缘关系，并将该菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中培养，培养温度为40℃，Ph为8，观察该菌株生理生化特性，根据筛选菌株与已知菌株亲缘关系及其生理生化特性对该菌株进行鉴定；
（5）观察筛选菌株对微囊藻毒素的降解能力：将筛选菌株与恶臭假单胞菌接种至底物为初始浓度为15.4ng/L的M9培养基中，连续5d每24h取样1次，上清液以微孔滤膜过滤后，测定微囊藻毒素含量。
步骤（2）中所述的柱层析系统参数为：层析柱直径3cm，长30cm，填料为20umC18硅胶，流动相为体积比为45:60:0.12的水、甲醇及乙酸；流速为5ml/min; 进样体积为5ml。
优选的，步骤（4）中所述的PCR引物采用细菌通用引物，所述的PCR反应条件为：94℃预变性 5 m i n , 94℃变性 30s , 55℃退火 30 s , 72℃延伸 45 s , 38个循环, 最后 72℃延伸10 min , 4℃保存；反应结束后 , 取 5μL 反应液经1. 2%琼脂糖电泳 , EB染色 ,紫外检测。
实施例3
一种天然水华蓝藻中微囊藻毒素的降解菌的分离与鉴定,包括以下步骤：
（1）制备微囊藻毒素粗品：取天然水华的新鲜蓝藻8g，置于碾钵中研碎后加体积比为30：60的5%的乙酸溶液与80%的甲醇水溶液，放入磁力搅拌器中以2300r/min搅碎1h，以11000r/min离心20min，取上清液；取滤渣重复萃取4次，合并上清液，采用0.45um微孔滤膜过滤，将滤液采用PH调节剂调节PH至7.8后经0.45um微孔滤膜过滤，在45℃条件下蒸发浓缩，再将浓缩液采用0.45um微孔滤膜过滤，制得微囊藻毒素粗品；
（2）采用C18固相萃取柱进行洗脱制备微囊藻毒素纯品：将步骤（1）中制得的微囊藻毒素粗品，上样，先用30ml蒸馏水洗脱，再用30ml 30%的甲醇洗脱，最后用50ml 60%的甲醇洗脱，利用柱层析系统分离、纯化，将纯化液移至玻璃定量管中，以11000r/min常温下离心20min，取上清液旋转蒸发蒸干溶剂，制得微囊藻毒素产品；
（3）微囊藻毒素的测定：采用微囊藻毒素检测试剂盒检测步骤（2）中制备的微囊藻毒素产品，将太湖腐烂的水华上清液添加于含2mg/L的微囊藻毒素的培养基中，29℃恒温培养，连续富集培养3次，3次富集后的培养基中的微囊藻毒素的浓度依次为8mg/L、16mg/L、32 mg/L根据菌落性状不同进行分离纯化；
（4）采用基因组提取试剂盒对提取菌株基因组DNA，进行PCR扩增，将所有菌株的16SrRNA基因通过软件比对，采用最大似然法与最大简约法构建系统发育树，并对基因序列采用Blast录入，观察该菌株所在分支，判断筛选菌株与已知菌株亲缘关系，并将该菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基中培养，培养温度为32℃，Ph为7.5，观察该菌株生理生化特性，根据筛选菌株与已知菌株亲缘关系及其生理生化特性对该菌株进行鉴定；
（5）观察筛选菌株对微囊藻毒素的降解能力：将筛选菌株与恶臭假单胞菌接种至底物为初始浓度为15.4ng/L的M9培养基中，连续5d每24h取样1次，上清液以微孔滤膜过滤后，测定微囊藻毒素含量。
步骤（2）中所述的柱层析系统参数为：层析柱直径3cm，长30cm，填料为18umC18硅胶，流动相为体积比为40:55:0.10的水、甲醇及乙酸；流速为3ml/min; 进样体积为3ml。
优选的，步骤（4）中所述的PCR引物采用细菌通用引物，所述的PCR反应条件为：94℃预变性 5 m i n , 94℃变性 30 s , 55℃退火 30 s , 72℃延伸 45 s , 38个循环, 最后 72℃延伸10 m i n , 4℃保存；反应结束后 , 取 5μL 反应液经1. 2%琼脂糖电泳 , E B 染色 ,紫外检测。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式，并不应理解为对本发明的限定，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。