技术领域
本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体而言，涉及一种溶瘤腺病毒，用于制备该腺病毒的载体及其应用。
背景技术
结直肠癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。2015年，我国新诊断结直肠患者超过37万例，死亡19万余例，分别占所有恶性肿瘤的8.77％和6.79％。结直肠癌的治疗原则为以手术为主的综合治疗，其中，完整结肠系膜切除术(CME)和完整直肠系膜切除术(TME)，已经作为局部进展期结直肠癌的规范化手术予以推荐。然而，晚期结直肠癌患者往往出现转移，包括远处淋巴结有、肝脏或其他脏器的转移等，手术治疗无法达到根治的目的。此时，化疗、免疫治疗等辅助手段，虽能在一定程度提升肿瘤患者的生活质量和延缓肿瘤的发展，但是仍然无法提高肿瘤患者的长期存活率。因此，急需探索新的、更加有效的治疗手段和方案。
近年来，免疫治疗发展迅速，以PD-1抗体为代表的肿瘤免疫治疗被《Science》评为2013年十大科学突破之首，免疫治疗有望成为继放疗、化疗、手术治疗之外的第四大肿瘤治疗手段。然而，以PD-1抗体为代表的肿瘤治疗药物，容易引发细胞因子风暴等毒副作用，如何管控这些毒副作用依然是阻挡免疫治疗发展的绊脚石。2015年10月，美国FDA批准了携带粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimutaing factor，GM-CSF)的单纯疱疹溶瘤病(T-VEC)上市，不仅为溶瘤病毒的发展注入了一支强心针，也为肿瘤免疫治疗开辟了新的途径。
溶瘤病毒可在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞，释放病毒，进一步感染周围的其他肿瘤细胞，进而发挥级联放大作用，最终达到消灭肿瘤的目的。目前，应用最为广泛的溶瘤病毒是溶瘤腺病毒。然而，单纯应用溶瘤腺病毒的疗效往往受到多种因素的制约：(1)人体内普遍存在5型腺病毒抗体，可清除溶瘤腺病毒溶瘤病毒；(2)启动病毒复制的肿瘤特异性启动子效率达不到预想等。基因修饰是提高溶瘤腺病毒疗效的重要手段，近年来，包括自杀基因、血管新生抑制基因、免疫基因等被应用于溶瘤病毒介导的基因治疗。溶瘤腺病毒作为免疫基因治疗的载体，其优势是：(1)溶瘤病毒裂解肿瘤细胞释放大量肿瘤抗原，可为特异性抗肿瘤免疫反应的激活提供物质基础；(2)溶瘤病毒发挥溶瘤功能，可以降低肿瘤负荷，为免疫基因功能发挥赢得时间。因此，将溶瘤腺病毒与基因治疗，特别是免疫基因治疗联合应用，已经成为肿瘤免疫治疗的热点领域和方向。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是为了制备一种联合decorin和GM-CSF蛋白表达的溶瘤腺病毒，并将其应用于结肠癌的治疗，为结肠癌的治疗提供一种有效的免疫基因治疗方案。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种溶瘤腺病毒重组载体，所述重组载体上同时携带有decorin基因表达框及GM-CSF基因表达框；
优选的，所述表达框均插入在腺病毒基因组E1区中。
核心蛋白聚糖(decorin，DCN)作为细胞外基质的重要组成成份，可以通过多种途径抑制肿瘤的发生、发展和转移，是重要的抑癌基因。临床数据分析结果显示，DCN在乳腺癌、前列腺癌、肾癌等多种肿瘤组织中表达下调。我们系统地分析了II/III期结肠癌患者肿瘤组织中DCN及其靶基因的表达，结果显示，DCN在结肠癌组织中表达下调；而DCN的重要靶基因，如Met、血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)等，均表达上调。此外，DCN的相对表达水平与结肠癌的转移、预后等密切相关：转移患者的DCN表达水平相对更低；回顾性分析结果提示，DCN表达水平低与肿瘤复发关系密切。已有研究报道，高表达DCN能够抑制肿瘤细胞增殖和迁移、促进肿瘤细胞凋亡；在乳腺癌骨转移模型中，溶瘤腺病毒介导的DCN高表达，能够抑制骨转移的发展、促进骨转移的愈合。因此，作为连接肿瘤与肿瘤微环境的重要分子，DCN已经成为肿瘤治疗的重要靶标。
DCN抑制肿瘤生长、进展和转移的主要的分子机制包括：(1)激活EGFR/MAPK/p21信号通路，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡；(2)结合并灭活转化生长因子β(Transforming growth factorβ，TGFβ)，降低VEGF表达水平，进而抑制肿瘤血管新生和上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)。TGF-β也是重要的免疫调节因子，可通过多种机制抑制肿瘤微环境的抗肿瘤免疫。研究证实，阻断TGFβ信号，可抑制骨髓来源抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)和CD4+Foxp3+调节性T淋巴细胞(Regulatory T cells，Tregs)，促进自然杀伤细胞(Natural Killer cells，NK)和细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocytes,CTLs)的活性，增强干扰素γ(Interferonγ，IFNγ)的表达及分泌，进而激活抗肿瘤免疫反应。在理论上，作为TGFβ的抑制分子，decorin必然具有一定的免疫调节功能，促进抗肿瘤免疫的形成。然而，对于decorin在结肠癌中的免疫调节作用尚无明确报道。
作为多功能的细胞因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimutaing factor，GM-CSF)，可促进树突状细胞(Dendritic cells，DCs)、巨噬细胞的成熟和分化，目前已被广泛应用于肿瘤的免疫与基因治疗中。研究证实，携带GM-CSF的溶瘤病毒局部给药，可调节肿瘤局部和机体的免疫状态，促进机体产生有效的抗肿瘤免疫反应。2015年10月，美国FDA批准了携带GM-CSF的单纯疱疹溶瘤病毒(T-VEC)进入市场，成为免疫基因治疗的重要里程碑。
综上所述，目前对于结肠癌，特别是晚期和转移的结肠癌患者仍然缺乏有效的治疗手段。Decorin与GM-CSF联合溶瘤腺病毒应用于肿瘤治疗，可集合溶瘤病毒治疗、靶向治疗、基因治疗和免疫治疗的优势，有效干预肿瘤微环境和机体抗肿瘤免疫反应，有望为结肠癌的治疗提供一种更加有效的免疫基因治疗方案。
本发明证实，携带decorin和GM-CSF的溶瘤腺病毒，能够有效杀伤肿瘤细胞，并实现肿瘤局部目的基因的高效表达；同时，肿瘤细胞裂解释放的大量肿瘤抗原，在GM-CSF协助下，有效激活机体的抗肿瘤免疫反应。
优选的，如上所述的溶瘤腺病毒重组载体，所述decorin基因表达框由CMV启动子和decorin蛋白开放读码框序列组成。
优选的，如上所述的溶瘤腺病毒重组载体，所述重组载体上还包含腺病毒复制调控基因序列；
所述腺病毒复制调控基因序列包括端粒酶启动子TERTp、腺病毒E1区复制起始基因E1A和E1B55K；
更优选的，从序列的5’至3’方向为：decorin基因表达框-腺病毒复制调控基因序列-GM-CSF基因表达框；
优选的，如上所述的溶瘤腺病毒重组载体，所述E1A由端粒酶启动子TERTp调控，所述E1B55K由天然E1B启动子调控；
更优选的，从序列5’至3’方向为：端粒酶启动子TERTp-腺病毒E1A基因-天然E1B启动子-E1B55K；
优选的，如上所述的溶瘤腺病毒重组载体，所述GM-CSF基因表达框位于所述天然E1B启动子下游，由核糖体内部进入位点IRES连接GM-CSF和E1B55K，实现共同表达；
Internal ribosome entry site,IRES。IRES能招募核糖体对mRNA进行翻译。
优选的，从序列的5’至3’方向为：天然E1B启动子-GM-CSF基因表达框-IRES序列-E1B55K。
如上所述的溶瘤腺病毒重组载体的构建方法，包括：
1)、将decorin基因表达框序列插入到穿梭载体中得到第一重组穿梭载体；
2)、从TE-TP-E1A-GM-55K载体上酶切得到包含GM-CSF基因表达框的核酸片段，并将其定向克隆至步骤1)得到的第一重组穿梭载体中，得到第二重组穿梭载体；
3)、将所述第二重组穿梭载体与复制缺陷型病毒载体同源重组，得到如上所述的溶瘤腺病毒重组载体。
TE-TP-E1A-GM-55K载体为现有载体，本领域技术人员可根据Cancer Gene Ther.2008Mar；15(3):173-82.Epub 2007Dec 21.A simplified system for generating oncolytic adenovirus vector carrying one or two transgenes.文章中记载的相关内容自行构建该载体，此处不做赘述。
优选的，如上所述的溶瘤腺病毒重组载体的构建方法，所述穿梭载体为pShuttle-CMV。
优选的，如上所述的溶瘤腺病毒重组载体的构建方法，所述复制缺陷型病毒载体为pAdEasy。
一种溶瘤腺病毒，其如上所述的溶瘤腺病毒重组载体线性化后转染至病毒包装细胞中进行包装、扩增、纯化后获得；
优选的，所述腺病毒包装细胞为HEK293细胞。
如上所述的溶瘤腺病毒重组载体及权利要求如上所述的溶瘤腺病毒在制备用于治疗结肠癌的药物中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
附图1溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM和对照病毒的构建；
A，溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM、rAd.DCN、rAd.GM、rAd.Null和复制缺陷型腺病毒Ad.Null和Ad.DCN的基因组结构示意图；B，pShuttle-CMV-DCN的BglII和XhoI酶切鉴定结果：M为λ-HindIII Marker，C1为pShuttle-CMV载体的酶切产物，C2为DCN基因，1-8为pShuttle-CMV-DCN的1-8号克隆；C，重组腺病毒载体PacI酶切鉴定结果：M1为DL2000Marker；M2为λ-HindIII Marker；C1为pShuttle-CMV-DCN酶切产物，1为pAd.DCN.GM.RE酶切产物，2为pAd.DCN.RE酶切产物；
附图2磺酰罗丹明B比色法测定溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM对结肠癌细胞系SW480、SW620和CT26的杀伤作用；
附图3溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM在结肠癌细胞系中的复制能力检测结果；
附图4 ELISA检测溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM介导DCN蛋白表达的能力；
附图5溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM及对照病毒治疗小鼠结肠癌细胞CT26移植瘤的疗效评价：A为肿瘤生长曲线；B为治疗后第22天(Day29)剥离肿瘤的体重与Buffer组相比，***，p<0.001,**,p<0.01；与rAd.Null组相比，##，p<0.01；
附图6溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治疗后5天，肿瘤组织中DCN及其靶基因Met、β-catenin和VEGF表达的real-time检测结果*,与rAd.Null组相比，p<0.05；
附图7溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治疗后5天，外周血中CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞的比例与Buffer组相比，*,p<0.05，**，p<0.01；
附图8溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治疗后5天，脾脏细胞中书突状细胞(DCs)与骨髓来源抑制细胞(MDSCs)的比例；
附图9溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治疗后5天，脾脏中细胞因子IL-2、IL-6、IFN-γ和TGF-β表达的real-time检测结果。
具体实施方式
在本发明的一个具体实施方式中，本发明采用AdEasy系统，将“端粒酶启动子TERTp调控E1A的表达框，E1B启动子调控GM-CSF和E1B-55KDa的表达框，及cmv启动子调控decorin的表达框”构建到穿梭质粒。采用限制性内切酶PmeI将其线性化并去磷酸化，并于BJ5183菌株中与骨架质粒AdEasy-1同源重组。得到的重组腺病毒质粒，经PacI线性化后，转染HEK293细胞，包装得到溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM。并在人结肠癌细胞、小鼠结肠癌细胞中鉴定目的基因sTGFβRIIFc的表达；在体外证实了rAd.DCN.GM对结肠癌细胞的溶瘤作用；在小鼠结肠癌细胞CT26移植瘤模型中明确其治疗效果和机制。
在进一步优选的实施方式中，本发明采用的方法具体为：
1、溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM的构建与制备：
采用本实验建立的“一种简单的能够携带1-2个基因的溶瘤腺病毒制备体系”，构建并制备溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM。具体为：从本实验室保存的质粒载体TE-TP-E1A-GM-55K中，通过酶切方式，获得“由端粒酶启动子TERTp启动腺病毒复制必需基因E1A表达，由E1B启动子启动GM-CSF和E1B55K表达”的序列TERTp-E1A-E1Bp-GM-IRES-E1B55K，并克隆到携带DCN基因的穿梭质粒上；最后，采用AdEasy系统制备重组腺病毒载体pAd.DCN.GM。并于HEK293细胞中包装获得重组腺病毒rAd.DCN.GM。
此外，在更优选的具体实施方式中，为了进行功能和机制研究，还制备了多种对照病毒：(1)rAd.Null，具有溶瘤功能，不携带目的基因的对照病毒；(2)rAd.DCN，仅携带DCN基因的溶瘤腺病毒；(3)rAd.GM，仅携带GM-CSF的基因溶瘤腺病毒；(4)Ad.Null，不携带目的基因的复制缺陷性腺病毒；(5)Ad.DCN，携带DCN基因的复制缺陷性腺病毒。
2、溶瘤腺病毒介导的目的基因表达和溶瘤功能评价；
为明确目的基因在结肠癌细胞中的表达及其效率，采用溶瘤腺病毒和对照病毒感染结肠癌细胞48h后，采用Western-blotting和ELISA检测目的基因DCN和GM-CSF的表达水平。
为检测病毒复制和杀伤效应，采用不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)的溶瘤腺病毒感染结肠癌细胞，采用SRB检测病毒对不同结肠癌细胞的杀伤效率；采用病毒扩增法，检测溶瘤病毒的复制能力。
3、溶瘤腺病毒体内抗肿瘤效应评价
为评价小鼠体内抗肿瘤效应，建立了小鼠结肠癌CT26细胞的小鼠移植瘤模型，通过瘤内给药方式进行治疗后，观察溶瘤腺病毒对移植瘤生长的抑制作用，明确其治疗效果。
4、溶瘤腺病毒体内抗肿瘤机制研究
为明确溶瘤病毒的体内抗肿瘤机制，检测了肿瘤局部DCN及其相关靶基因表达水平，检测脾脏及肿瘤局部炎症因子表达水平、免疫细胞表型等，初步阐明了其作用机制。
本发明的创新点在于有效集合溶瘤腺病毒、靶向治疗、基因治疗和免疫治疗的优势，联合发挥decorin对肿瘤微环境和免疫调控作用、GM-CSF对DC和巨噬细胞的活化作用、以及溶瘤病毒的溶瘤及免疫激活效应。
具体为，(1)溶瘤病毒裂解肿瘤细胞，减轻肿瘤负荷，为目的基因功能发挥赢得时间，为免疫激活赢得“时间可能”；同时，肿瘤细胞裂解释放的大量肿瘤抗原利于抗肿瘤免疫反应的激活。(2)Decorin通过多种途径下调转移相关基因的表达，抑制肿瘤转移；同时，调节肿瘤免疫微环境，改善肿瘤局部免疫抑制状态，募集免疫细胞，为抗肿瘤免疫激活创造“空间可能”。(3)GM-CSF可促进肿瘤局部DCs和巨噬细胞的成熟和分化，有利于形成强效的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞，从而最终清除肿瘤。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1重组腺病毒rAd.DCN的构建与制备
其方法是合成是人DCN基因，将其插入到pShuttle-CMV载体中，获得pShuttle-CMV-DCN；MfeI酶切由本实验室保存的质粒载体TE-TP-E1A-GM-55K，获取含有复制相关基因、GM-CSF的基因片段——TERTp-E1A-E1Bp-GM-IRES-E1B55K，并将其正向克隆到pShuttle-CMV-DCN的相应位点，获得穿梭质粒pSh.cmv.DCN.GM.RE；参照AdEasy系统，获得重组腺病毒质粒pAd.DCN.GM.RE；并于HEK293细胞制备获得溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM。具体为：
(1)pShuttle-CMV-DCN的构建
通过基因合成技术，合成人DCN基因的全序列，并在上下游分别加入BglII和XhoI的酶切位点，将其酶切后，连接到pShuttle-CMV的相应位点，获得携带目的基因的穿梭质粒pShuttle-CMV-DCN。
(2)pShuttle-CMV-DCN-GM-RE的构建
质粒TE-TP-E1A-GM-55K，含有TERTp启动子启动E1A表达、E1B启动子调控GM-CSF和E1B55K表达两个表达框，其中，GM-CSF编码区和E1B55K编码区之间通过核糖体内部进入位点(internal ribosome entry sites，IRES)连接。MfeI酶切TE-TP-E1A-GM-55K，获得此部分序列TERTp-E1A-E1Bp-GM-IRES-E1B55K，然后将其正向克隆到pShuttle-CMV-DCN的相应位点(MfeI)，获得含有全部目的序列的穿梭质粒pShuttle-CMV-DCN-GM-RE(如SEQ ID NO：1所示)。
(3)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM的制备
参照AdEasy系统制备重组腺病毒质粒：PmeI酶切穿梭质粒pShuttle-CMV-DCN-GM-RE,电转BJ5183感受态细胞，与AdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒pAd.DCN.GM.RE。PacI酶切重组腺病毒质粒，并将其转染HEK293细胞，制备获得溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM(附图1所示)。鉴定正确后，进行扩增、纯化和滴度测定；结果显示，病毒滴度和纯度均符合要求(表1所示)。
(4)对照病毒的构建和制备
按照溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM构建、制备流程，采用pShuttle-CMV替换pSh.cmv.DCN，构建和制备仅携带GM-CSF基因的溶瘤腺病毒rAd.GM；采用TE-TP-E1A(本实验室构建并保存)替换TE-TP-E1A-GM-55K，构建和制备仅携带DCN基因的溶瘤腺病毒rAd.DCN；同时采用pShuttle-CMV和TE-TP-E1A制备不携带目的基因的对照溶瘤病毒rAd.Null。同时，采用AdEasy系统，制备复制缺陷型对照病毒Ad.DCN和Ad.Null。对照病毒经鉴定正确后，进行扩增、纯化和滴度测定；结果显示，病毒滴度和纯度均符合要求(表1所示)。
表1病毒滴度、纯度检测结果
实施例2溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM体外功能验证
其方法是，在结肠癌细胞中，采用磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色法，检测溶瘤病毒的杀伤效应；通过Adeno-X Rapid Titer Kit测定从感染后3h到48h，溶瘤病毒在结肠癌细胞中的扩增倍数，明确病毒的复制能力；通过Western-blotting和ELISA检测目的基因DCN和GM-CSF在结肠癌细胞中的表达。具体为：
(1)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM的杀伤能力检测
将人肾癌癌细胞系SW620、SW480和小鼠结肠癌细胞系CT26，分别以1×103细胞/100μl培养基/孔接种96孔板。第二天，溶瘤腺病毒rAd.DCN,对照溶瘤病毒rAd.GM、rAd.DCN、rAd.Null，和复制缺陷性对照病毒Ad.Null和Ad.DCN，分别以5倍梯度稀释的方式感染细胞(1.25×106Vps/细胞-80Vps/细胞)。第七天(感染后第六天)，采用SRB染色检测每孔中细胞的存活率，明确溶瘤腺病毒的细胞杀伤作用。计算方法为：细胞存活率＝相应感染滴度下的OD值/对照孔的OD值。结果显示，溶瘤病毒不但能够有效地杀伤人结肠癌细胞SW620和SW480，还能杀伤小鼠结肠癌细胞CT26(如附图2所示)。
(2)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM的复制能力检测
接下来，我们进一步明确了溶瘤病毒在结肠癌细胞中的复制能力。具体为：将25000VPs/细胞的溶瘤病毒rAd.DCN和对照病毒感染结肠癌细胞SW620、SW480和CT26；于感染后3h，PBS洗涤细胞去除病毒；洗涤后即刻和48h，收集细胞和上清，反复冻融后，将其感染24孔板中的HEK293细胞(提前一天按照1×105细胞/孔接种)。
48h后，采用Adeno-X Rapid Titer Kit进行染色并计算病毒滴度，明确病毒扩增倍数。结果显示，与复制缺陷型腺病毒相比，溶瘤病毒rAd.DCN.GM、rAd.GM、rAd.DCN和rAd.Null均能在人结肠癌细胞SW620和SW480中有效复制；而在小鼠结肠癌细胞CT26中却无明显复制能力(如附图3所示)。
(3)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM可在结肠癌细胞中高效表达目的基因DCN和GM-CSF
采用25000VPs/细胞的溶瘤病毒rAd.DCN.GM和对照病毒感染结肠癌细胞细胞SW620、SW480和CT26后，孵育16h后，将细胞培养基替换为无血清培养基。继续培养24h-32h，分别收集上清和细胞，采用ELISA分别检测目的基因DCN和GM-CSF的表达。结果显示，无论复制缺陷型腺病毒Ad.DCN，还是溶瘤腺病毒rAd.DCN和rAd.DCN.GM均能在结肠癌细胞中高效地表达治疗基因DCN；而rAd.GM和rAd.DCN.GM能够表达治疗基因GM-CSF(如附图4所示)。
实施例3溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治疗小鼠结肠癌移植瘤的疗效评价
其方法是，采用小鼠结肠癌细胞CT26建立小鼠移植瘤模型，通过瘤内给予溶瘤病毒的方式进行治疗，通过对其生长情况的监测，评价溶瘤病毒对小鼠肾癌移植瘤的治疗作用。具体为：
小鼠结肠癌细胞CT26，以单细胞悬液(2×106细胞/小鼠)皮下荷瘤6-8周的Babl/c小鼠，观察肿瘤的生长情况，于荷瘤后8d，检测肿瘤的体积，并按照体积进行分层随机分组，划分为Buffer组、rAd.Null组、rAd.DCN组、rAd.GM组和rAd.DC.GM组。并以未荷瘤小鼠作为正常对照，来评价其免疫指标。
荷瘤后第7天，溶瘤腺病毒以2.5×1010VPs/100μl的剂量，瘤内注射进行治疗；第10天，相同剂量溶瘤腺病毒再次给药。治疗后，监测小鼠健康状况、小鼠体重、肿瘤生长曲线等。
待任意一组小鼠的肿瘤出现破溃或者体积大于2000mm3时，终止实验。处死小鼠后，检测肿瘤的体重。结果显示，与Buffer组和rAd.Null组相比，携带目的基因的溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM、rAd.GM和rAd.DCN均能有效抑制肿瘤的生长(p<0.05)(如附图5所示)。
实施例4溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM治疗小鼠结肠癌移植瘤的机制研究
为进一步明确rAd.DCN.GM治疗结肠癌的机制，分别检测肿瘤组织中DCN相关靶基因的表达水平、EMT水平以及炎症因子的表达水平；检测血液和脾脏中T淋巴细胞亚型、骨髓来源抑制细胞(Bone marrow derived suppressor cells,MDSCs)/细胞因子的表达等，明确rAd.DCN.GM对机体抗肿瘤免疫的调节作用。具体为：
(1)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM对DCN靶基因和转移相关分子表达的影响
荷瘤后第12d(第一次给药后第5d)和第29天，分别处死小鼠，分离小鼠肿瘤组织，提取RNA。检测DCN及其重要靶基因Met、β-catenin和VEGF的表达水平；检测EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达水平。结果显示，rAd.dcn和rAd.dcn.GM均能高效介导目的基因DCN在肿瘤局部的表达；同时，可检测到DCN的重要靶基因Met、β-catenin和VEGF均表达下调(如附图6所示)。上述结果提示，rAd.DCN.GM可通过高表达DCN，抑制结肠癌抑制瘤的增殖和转移。
(2)溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM对机体抗肿瘤免疫的调控作用
溶瘤腺病毒可以裂解肿瘤细胞，释放大量肿瘤抗原，为机体免疫激活提供基础；而GM-CSF是重要的免疫调节因子，对于机体抗肿瘤免疫反应的激活具有重要意义。在本研究中，我们发现溶瘤病毒治疗可以通过调节CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的比例，促进细胞因子的表达和释放(如附图7所示)。与单纯的溶瘤腺病毒相比，携带DCN和GM-CSF的溶瘤腺病毒具有更强的免疫激活效应：例如，携带DCN的溶瘤腺病毒能够有效降低脾脏细胞中MDSCs的数量和比例；而携带GM-CSF的溶瘤腺病毒则能够明显提升脾脏中DC细胞的数量和比例。此外，联合应用DCN和GM-CSF获得的溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM则能够同时发挥DCN和GM-CSF对机体免疫的调节作用(如附图8所示)。
此外，对于细胞因子的检测结果显示，携带GM-CSF的溶瘤腺病毒可以诱导TH1型细胞因子，例如IL-2、IL-12、IFN-γ的表达；而携带DCN的溶瘤腺病毒则可降低TH2型细胞因子，如IL-6、TGF-β的表达水平。而rAd.DCN.GM则可以同时调控TH1型细胞因子和TH2型细胞因子，有望最大程度激活机体的抗肿瘤免疫反应(如附图9所示)。
综上所述，我们成功构建了由端粒酶启动子调控溶瘤(TERTp启动E1A表达)、由E1B启动子(E1Bp)调控GM-CSF和E1B55K表达、由cmv启动子调控DCN蛋白表达的溶瘤腺病毒rAd.DCN.GM。体外结果证实，该溶瘤腺病毒能够在体外人结肠癌癌细胞系中大量复制并杀伤细胞；能够实现目的基因在结肠癌细胞中的高效表达。在小鼠结肠癌细胞CT26的小鼠移植瘤模型中，rAd.DCN.GM不但能够有效抑制肿瘤的生长，降低肿瘤转移相关分子的表达水平；还能够激活机体的抗肿瘤免疫反应。其中，DCN和GM-CSF能够发挥各自的免疫调节作用，从不同角度协同产生有效的抗肿瘤免疫反应。因此，该溶瘤腺病毒有望成为结肠癌晚期或转移患者治疗的重要候选药物，成为手术治疗、放疗、化疗和免疫治疗的重要补充。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
<110> 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所；北京知光医学科技股份有限公司
<120> 溶瘤腺病毒，用于制备该腺病毒的载体及其应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 13033
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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cttctgcttg cacaagtttc ctgggctgga ccgtttcaac agagaggctt atttgacttt 1020
atgctagaag atgaggcttc tgggataggc ccagaagttc ctgatgaccg cgacttcgag 1080
ccctccctag gcccagtgtg ccccttccgc tgtcaatgcc atcttcgagt ggtccagtgt 1140
tctgatttgg gtctggacaa agtgccaaag gatcttcccc ctgacacaac tctgctagac 1200
ctgcaaaaca acaaaataac cgaaatcaaa gatggagact ttaagaacct gaagaacctt 1260
cacgcattga ttcttgtcaa caataaaatt agcaaagtta gtcctggagc atttacacct 1320
ttggtgaagt tggaacgact ttatctgtcc aagaatcagc tgaaggaatt gccagaaaaa 1380
atgcccaaaa ctcttcagga gctgcgtgcc catgagaatg agatcaccaa agtgcgaaaa 1440
gttactttca atggactgaa ccagatgatt gtcatagaac tgggcaccaa tccgctgaag 1500
agctcaggaa ttgaaaatgg ggctttccag ggaatgaaga agctctccta catccgcatt 1560
gctgatacca atatcaccag cattcctcaa ggtcttcctc cttcccttac ggaattacat 1620
cttgatggca acaaaatcag cagagttgat gcagctagcc tgaaaggact gaataatttg 1680
gctaagttgg gattgagttt caacagcatc tctgctgttg acaatggctc tctggccaac 1740
acgcctcatc tgagggagct tcacttggac aacaacaagc ttaccagagt acctggtggg 1800
ctggcagagc ataagtacat ccaggttgtc taccttcata acaacaatat ctctgtagtt 1860
ggatcaagtg acttctgccc acctggacac aacaccaaaa aggcttctta ttcgggtgtg 1920
agtcttttca gcaacccggt ccagtactgg gagatacagc catccacctt cagatgtgtc 1980
tacgtgcgct ctgccattca actcggaaac tataagtaac tcgagcctaa gcttctagat 2040
aagatatccg atccaccgga tctagataac tgatcataat cagccatacc acatttgtag 2100
aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga 2160
atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 2220
gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 2280
aactcatcaa tgtatcttaa cgcgcggccg ctggcccctc cctcgggtta ccccacagct 2340
taggccgatt cgacctctct ccgctggggc cctcgctggc gtccctgcac cctgggagcg 2400
cgagcggcgc gcgggcgggg aagcgcggcc cagacccccg ggtccgcccg gagcagctgc 2460
gctgtcgggg ccaggccggg ctcccagtgg attcgcgggc acagacgccc aggaccgcgc 2520
ttcccacgtg gcggagggac tggggacccg ggcacccgtc ctgccccttc accttccagc 2580
tccgcctcct ccgcgcggac cccgccccgt cccgacccct cccgggtccc cggcccagcc 2640
ccctccgggc cctcccagcc cctccccttc ctttccgcgg ccccgccctc tcctcgcggc 2700
gcgagtttca ggcagcgctg cgtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc 2760
cccgcggaat tcatgagaca tattatctgc cacggaggtg ttattaccga agaaatggcc 2820
gccagtcttt tggaccagct gatcgaagag gtactggctg ataatcttcc acctcctagc 2880
cattttgaac cacctaccct tcacgaactg tatgatttag acgtgacggc ccccgaagat 2940
cccaacgagg aggcggtttc gcagattttt cccgactctg taatgttggc ggtgcaggaa 3000
gggattgact tactcacttt tccgccggcg cccggttctc cggagccgcc tcacctttcc 3060
cggcagcccg agcagccgga gcagagagcc ttgggtccgg tttctatgcc aaaccttgta 3120
ccggaggtga tcgatcttac ctgccacgag gctggctttc cacccagtga cgacgaggat 3180
gaagagggtg aggagtttgt gttagattat gtggagcacc ccgggcacgg ttgcaggtct 3240
tgtcattatc accggaggaa tacgggggac ccagatatta tgtgttcgct ttgctatatg 3300
aggacctgtg gcatgtttgt ctacagtaag tgaaaattat gggcagtggg tgatagagtg 3360
gtgggtttgg tgtggtaatt ttttttttaa tttttacagt tttgtggttt aaagaatttt 3420
gtattgtgat ttttttaaaa ggtcctgtgt ctgaacctga gcctgagccc gagccagaac 3480
cggagcctgc aagacctacc cgccgtccta aaatggcgcc tgctatcctg agacgcccga 3540
catcacctgt gtctagagaa tgcaatagta gtacggatag ctgtgactcc ggtccttcta 3600
acacacctcc tgagatacac ccggtggtcc cgctgtgccc cattaaacca gttgccgtga 3660
gagttggtgg gcgtcgccag gctgtggaat gtatcgagga cttgcttaac gagcctgggc 3720
aacctttgga cttgagctgt aaacgcccca ggccataagg tgtaaacctg tgattgcgtg 3780
tgtggttaac gcctttgttt gctgaatgag ttgatgtaag tttaataaag ggtgagataa 3840
tgtttaactt gcatggcgtg ttaaatgggg cggggcttaa agggtatata atgcgccgtg 3900
ggctaatctt ggttacatct gacctcacta gtatgtggct gcagagcctg ctgctcttgg 3960
gcactgtggc ctgcagcatc tctgcacccg cccgctcgcc cagccccagc acgcagccct 4020
gggagcatgt gaatgccatc caggaggccc ggcgtctcct gaacctgagt agagacactg 4080
ctgctgagat gaatgaaaca gtagaagtca tctcagaaat gtttgacctc caggagccga 4140
cctgcctaca gacccgcctg gagctgtaca agcagggcct gcggggcagc ctcaccaagc 4200
tcaagggccc cttgaccatg atggccagcc actacaagca gcactgccct ccaaccccgg 4260
aaacttcctg tgcaacccag attatcacct ttgaaagttt caaagagaac ctgaaggact 4320
ttctgcttgt catccccttt gactgctggg agccagtcca ggagtgagtc gacgaattaa 4380
ttcgctgtct gcgagggcca gctgttgggg tgagtactcc ctctcaaaag cgggcatgac 4440
ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat ttgatattca cctggcccgc 4500
ggtgatgcct ttgagggtgg ccgcgtccat ctggtcagaa aagacaatct ttttgttgtc 4560
aagcttgagg tgtggcaggc ttgagatctg gccatacact tgagtgacaa tgacatccac 4620
tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc caggtccaac tgcaggtcga gcatgcatct 4680
agggcggcca attccgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct 4740
tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgtgattttc caccatattg ccgtcttttg 4800
gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt 4860
cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg 4920
aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac 4980
ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg 5040
cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct 5100
caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg 5160
atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag 5220
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actcgacgag ttttataaag gataaatgga gcgaagaaac ccatctgagc ggggggtacc 5340
tgctggattt tctggccatg catctgtgga gagcggttgt gagacacaag aatcgcctgc 5400
tactgttgtc ttccgtccgc ccggcgataa taccgacgga ggagcagcag cagcagcagg 5460
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ctcgggaatg aatgttgtac aggtggctga actgtatcca gaactgagac gcattttgac 5580
aattacagag gatgggcagg ggctaaaggg ggtaaagagg gagcgggggg cttgtgaggc 5640
tacagaggag gctaggaatc tagcttttag cttaatgacc agacaccgtc ctgagtgtat 5700
tacttttcaa cagatcaagg ataattgcgc taatgagctt gatctgctgg cgcagaagta 5760
ttccatagag cagctgacca cttactggct gcagccaggg gatgattttg aggaggctat 5820
tagggtatat gcaaaggtgg cacttaggcc agattgcaag tacaagatca gcaaacttgt 5880
aaatatcagg aattgttgct acatttctgg gaacggggcc gaggtggaga tagatacgga 5940
ggatagggtg gcctttagat gtagcatgat aaatatgtgg ccgggggtgc ttggcatgga 6000
cggggtggtt attatgaatg taaggtttac tggccccaat tttagcggta cggttttcct 6060
ggccaatacc aaccttatcc tacacggtgt aagcttctat gggtttaaca atacctgtgt 6120
ggaagcctgg accgatgtaa gggttcgggg ctgtgccttt tactgctgct ggaagggggt 6180
ggtgtgtcgc cccaaaagca gggcttcaat taagaaatgc ctctttgaaa ggtgtacctt 6240
gggtatcctg tctgagggta actccagggt gcgccacaat gtggcctccg actgtggttg 6300
cttcatgcta gtgaaaagcg tggctgtgat taagcataac atggtatgtg gcaactgcga 6360
ggacagggcc tctcagatgc tgacctgctc ggacggcaac tgtcacctgc tgaagaccat 6420
tcacgtagcc agccactctc gcaaggcctg gccagtgttt gagcataaca tactgacccg 6480
ctgttccttg catttgggta acaggagggg ggtgttccta ccttaccaat gcaatttgag 6540
tcacactaag atattgcttg agcccgagag catgtccaag gtgaacctga acggggtgtt 6600
tgacatgacc atgaagatct ggaaggtgct gaggtacgat gagacccgca ccaggtgcag 6660
accctgcgag tgtggcggta aacatattag gaaccagcct gtgatgctgg atgtgaccga 6720
ggagctgagg cccgatcact tggtgctggc ctgcacccgc gctgagtttg gctctagcga 6780
tgaagataca gattgaggta ctgaaatgtg tgggcgtggc ttaagggtgg gaaagaatat 6840
ataaggtggg ggtcttatgt agttttgtat ctgttttgca gcagccgccg ccgccatgag 6900
caccaactcg tttgatggaa gcattgtgag ctcatatttg acaacgcgca tgcccccatg 6960
ggccggggtg cgtcagaatg tgatgggctc cagcattgat ggtcgccccg tcctgcccgc 7020
aaactctact accttgacct acgagaccgt gtctggaacg ccgttggaga ctgcagcctc 7080
cgccgccgct tcagccgctg cagccaccgc ccgcgggatt gtgactgact ttgctttcct 7140
gagcccgctt gcaagcagtg cagcttcccg ttcatccgcc cgcgatgaca agttgacggc 7200
tcttttggca caattggatt ctttgacccg ggaacttaat gtcgtttctc agcagctgtt 7260
ggatctgcgc cagcaggttt ctgccctgaa ggcttcctcc cctcccaatg cggtttaaaa 7320
cataaataaa aaaccagact ctgtttggat ttggatcaag caagtgtctt gctgtcttta 7380
tttaggggtt ttgcgcgcgc ggtaggcccg ggaccagcgg tctcggtcgt tgagggtcct 7440
gtgtattttt tccaggacgt ggtaaaggtg actctggatg ttcagataca tgggcataag 7500
cccgtctctg gggtggaggt agcaccactg cagagcttca tgctgcgggg tggtgttgta 7560
gatgatccag tcgtagcagg agcgctgggc gtggtgccta aaaatgtctt tcagtagcaa 7620
gctgattgcc aggggcaggc ccttggtgta agtgtttaca aagcggttaa gctgggatgg 7680
gtgcatacgt ggggatatga gatgcatctt ggactgtatt tttaggttgg ctatgttccc 7740
agccatatcc ctccggggat tcatgttgtg cagaaccacc agcacagtgt atccggtgca 7800
cttgggaaat ttgtcatgta gcttagaagg aaatgcgtgg aagaacttgg agacgccctt 7860
gtgacctcca agattttcca tgcattcgtc cataatgatg gcaatgggcc cacgggcggc 7920
ggcctgggcg aagatatttc tgggatcact aacgtcatag ttgtgttcca ggatgagatc 7980
gtcataggcc atttttacaa agcgcgggcg gagggtgcca gactgcggta taatggttcc 8040
atccggccca ggggcgtagt taccctcaca gatttgcatt tcccacgctt tgagttcaga 8100
tggggggatc atgtctacct gcggggcgat gaagaaaacg gtttccgggg taggggagat 8160
cagctgggaa gaaagcaggt tcctgagcag ctgcgactta ccgcagccgg tgggcccgta 8220
aatcacacct attaccggct gcaactggta gttaagagag ctgcagctgc cgtcatccct 8280
gagcaggggg gccacttcgt taagcatgtc cctgactcgc atgttttccc tgaccaaatc 8340
cgccagaagg cgctcgccgc ccagcgatag cagttcttgc aaggaagcaa agtttttcaa 8400
cggtttgaga ccgtccgccg taggcatgct tttgagcgtt tgaccaagca gttccaggcg 8460
gtcccacagc tcggtcacct gctctacggc atctcgatcc agcatatctc ctcgtttcgc 8520
gggttggggc ggctttcgct gtacggcagt agtcggtgct cgtccagacg ggccagggtc 8580
atgtctttcc acgggcgcag ggtcctcgtc agcgtagtct gggtcacggt gaaggggtgc 8640
gctccgggct gcgcgctggc cagggtgcgc ttgaggctgg tcctgctggt gctgaagcgc 8700
tgccggtctt cgccctgcgc gtcggccagg tagcatttga ccatggtgtc atagtccagc 8760
ccctccgcgg cgtggccctt ggcgcgcagc ttgcccttgg aggaggcgcc gcacgagggg 8820
cagtgcagac ttttgagggc gtagagcttg ggcgcgagaa ataccgattc cggggagtag 8880
gcatccgcgc cgcaggcccc gcagacggtc tcgcattcca cgagccaggt gagctctggc 8940
cgttcggggt caaaaaccag gtttccccca tgctttttga tgcgtttctt acctctggtt 9000
tccatgagcc ggtgtccacg ctcggtgacg aaaaggctgt ccgtgtcccc gtatacagac 9060
ttgagaggga gtttaaacga attcaatagc ttgttgcatg ggcggcgata taaaatgcaa 9120
ggtgctgctc aaaaaatcag gcaaagcctc gcgcaaaaaa gaaagcacat cgtagtcatg 9180
ctcatgcaga taaaggcagg taagctccgg aaccaccaca gaaaaagaca ccatttttct 9240
ctcaaacatg tctgcgggtt tctgcataaa cacaaaataa aataacaaaa aaacatttaa 9300
acattagaag cctgtcttac aacaggaaaa acaaccctta taagcataag acggactacg 9360
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agcgcttcca cagcggcagc cataacagtc agccttacca gtaaaaaaga aaacctatta 9720
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gcagagcgag tatatatagg actaaaaaat gacgtaacgg ttaaagtcca caaaaaacac 9840
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cccaacacat acaagttact ccgccctaaa acctacgtca cccgccccgt tcccacgccc 10020
cgcgccacgt cacaaactcc accccctcat tatcatattg gcttcaatcc aaaataaggt 10080
atattattga tgatgttaat taacatgcat ggatccatat gcggtgtgaa ataccgcaca 10140
gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 10200
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tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 10320
ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 10380
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ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 10560
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 10620
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agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 11040
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 11100
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taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 11280
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cctagatcct tttcacgtag aaagccagtc cgcagaaacg gtgctgaccc cggatgaatg 11520
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tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg 11940
ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc 12000
cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg 12060
aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca 12120
tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc 12180
aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg 12240
atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg 12300
cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata 12360
tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg 12420
accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat 12480
gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct 12540
tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa ttttgttaaa atttttgtta aatcagctca 12600
ttttttaacc aataggccga aatcggcacc atcccttata aatcaaaaga atagaccgag 12660
atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc 12720
aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc 12780
taatcaagtt ttttgtggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc 12840
ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa 12900
gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc 12960
acacccgcgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccat tcgccattca ggatcgaatt 13020
aattcttaat taa 13033