一种具有抗肿瘤生理活性的尖叶唐松草阿原碱及其提取方法 本发明涉及一种新颖的具有抗肿瘤生理活性的碱及其提取方法。
唐松草属(Thalictrum)植物民间常常用作清热解毒、抗菌消炎等药，Boustie J.等人在J.Nat.Prod.，61(4)，1998，马竹卿等人在《中草药》，11(5)，1980，发明人等在《中草药》，19(1)，1988中报道其中的一些生物碱成分具有明显的抗癌、抗菌消炎、抗病毒、降压等生理活性，其化学结构具有一定的新颖性。发明人曾从采自广西大容山的尖叶唐松草(Thalictrumacutifolium(Hand.-Mazz.)Boivin)根分离鉴定了8种成分：尖叶唐松草啶碱、木防己宁碱、氧化小蘖碱、棕榈酸甲酯、亚油酸甲酯、β-谷甾醇、正二十九烷和正三十五烷。其中尖叶唐松草啶碱和木防己宁碱具有阿朴菲生物碱骨架；氧化小蘖碱具有原小蘖碱骨架。
本发明的目的在于提供一种新的具有抗肿瘤生理活性的尖叶唐松草阿原碱。
本发明的另一目的在于提供一种提取具有抗肿瘤生理活性的尖叶唐松草阿原碱的方法。
本发明新的具有抗肿瘤生理活性的尖叶唐松草阿原碱，其结构式为：该化合物是由尖叶唐松草中提取而得到的，该提取方法依次包括以下步骤：(1)取尖叶唐松草根切碎后，用甲醇或乙醇回流提取，提取液减压浓缩得甲醇或乙醇浸膏；(2)浸膏用稀盐酸溶液萃取，得到的稀酸萃取液再用氯仿萃取；(3)氯仿层浓缩后再经氧化铝柱层析、甲醇-氯仿洗脱，得到一无定型粉末；(4)将该无定型粉末加入稀碱溶液中，过滤，洗涤，干燥即得所需的产物。其中，甲醇或乙醇浓度为75％～95％，稀盐酸溶液的浓度为5％～15％，加入的稀碱溶液使溶液的PH值为9～12时止，其中的碱为氢氧化钠、碳酸氢钠或碳酸钠。
本发明地化合物为浅黄色无定型粉末，将其制成盐酸盐后再经甲醇-乙醚重结晶得到一浅黄色片状结晶。
发明人发现本发明的化合物具有抑制人肿瘤细胞生长，诱导人肿瘤细胞凋亡的生理活性。
图1为本发明化合物的裂解途径；
图2本发明化合物远程碳氢偶合(HMBC)示意图。
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
尖叶唐松草阿原碱的提取(1)取尖叶唐松草根切碎后，用95％乙醇回流提取，提取液减压浓缩得乙醇浸膏；(2)乙醇浸膏用5％稀盐酸溶液萃取，得到的稀酸萃取液再用氯仿萃取；(3)氯仿层浓缩后再经氧化铝柱层析、甲醇-氯仿洗脱，得到一无定型粉末；(4)将该无定型粉末加入稀氢氧化钠溶液中，使溶液的PH值为10，过滤，洗涤，干燥即得所需的产物。
实施例2
尖叶唐松草阿原碱的提取(1)取尖叶唐松草根切碎后，用85％甲醇回流提取，提取液减压浓缩得甲醇浸膏；(2)甲醇浸膏用10％稀盐酸溶液萃取，得到的稀酸萃取液再用氯仿萃取；(3)氯仿层浓缩后再经氧化铝柱层析、甲醇-氯仿洗脱，得到一无定型粉末；(4)将该无定型粉末加入稀碳酸氢钠溶液中，使溶液的PH值为11，过滤，洗涤，干燥即得所需的产物。
实施例3
尖叶唐松草阿原碱的提取(1)取尖叶唐松草根切碎后，用75％乙醇回流提取，提取液减压浓缩得乙醇浸膏；(2)乙醇浸膏用15％稀盐酸溶液萃取，得到的稀酸萃取液再用氯仿萃取；(3)氯仿层浓缩后再经氧化铝柱层析、甲醇-氯仿洗脱，得到一无定型粉末；(4)将该无定型粉末加入稀碳酸钠溶液中，使溶液的PH值为12，过滤，洗涤，干燥即得所需的产物。
实施例1、2和3中得到的产物为浅黄色无定型粉末，其盐酸盐的熔点m.p.：183.5-184℃。(甲醇-乙醚重结晶)，[α]24D-14.2°(CH3OH，C=3.14)。
本发明化合物盐酸盐的红外光谱(IR)和质谱(MS)数据见表1；质子间交叉弛豫的二维核磁共振相关谱(NOESY)数据见表2；1H-核磁共振谱(1H-NMR)、13C-核磁共振谱(13C-NMR)和远程碳氢偶合(HMBC)数据见表3。
表1本发明化合物盐酸盐IR and MS数据IR(v/cm-1)3001，2920，2890，2750～2200(br),1510,1480,1450,1406,1340,1260,1020MS(m/e)724(M+100％)，709，693，533，518，502，384，324，206，192
表2本发明化合物盐酸盐NOESY数据 δArH 7.19(d,C10) 7.01(s,C4) 6.88(s,C1) 5.84(s,C3) δ-OCH3 3.82(C11) 3.91(C3) 3.87(C2) 3.55(C2)
本发明化合物由高分辨质谱测得M+=724.33211，结合13C-核磁共振的无畸变激化转移增益实验(13C-NMR(DEPT))确定化合物的分子式为C42H48N2O9，不饱和度为20。IR显示有＞NH+(2750～2200(br)cm-1)，＞NCH3(2800，1370cm-1)和醚键(1340，1260，1024(强)cm-1)吸收。13C-NMR有24个芳香碳信号(见表3)，确定分子中有4个苯环存在。IR显示芳核-OCH3(2850cm-1)吸收，并在13C-NMR有8个连氧芳季碳，结合1H-NMR中8个连氧的甲基共振信号和13C-1HCOSY可分别确定8个芳核-OCH3的存在。此外，由13C-1H二维核磁共振相关谱(13C-1H COSY)还发现一个连于电负性原子上的-CH3(δC 41.8，δH3.16(3H，br，s))，由碳化学位移可确定此甲基连于氮原子上。
分析本发明化合物的分子式，它是一个双生物碱。发明人曾从同一生物体中分离到具有阿朴菲骨架的尖叶唐松草啶碱和具有原小蘖碱骨架的氧化小蘖碱和木防己宁碱。从生源来看，本发明化合物是这两类生物碱的醚链双碱。从1H-1H二维核磁共振相关谱(1H-1H COSY)可以看到本发明化合物有下列几个片段。
-CH2--CH2- -CH2--CH2- -CH--CH2- -CH--CH2- -CH==CH- -CH2-
3.43 3.05 3.58 3.13 4.16 2.80 4.79 3.00 7.38 7.19 4.47
3.80 3.13 3.87 3.30 3.46 4.06 4.69
本发明化合物的MS裂解碎片进一步确定分子内同时存在阿朴菲和原小蘖碱骨架，其裂解途径如图1所示。
本发明化合物有9个氧原子，却有10个与氧相连的芳香季碳原子。除8个为-OCH3外，第9个氧原子以醚的形式同时与两个芳香季碳相连形成双生物碱。至于分子中的8个-OCH3、5个芳香族质子和氧桥的位置，可通过1H-NMR结合NOESY和HMBC确定下来。阿朴菲部分：从生源来看，所有的天然生物碱均在C1、C2上有取代结合图1的骨架推断C1、C2上应各有一个-OCH3取代基，而C3上应有一个芳氢。并且这表3本发明化合物盐酸盐NMR数据 13C(CD3OD) 1H(J,Hz.CD3OD) HMBC(Carbon,CD3OD) 1 1a 1b 2 3 3a 4 5 6a 7 7a 8 9 10 11 11a 1＇ 1a＇ 2＇ 3＇ 4＇ 4a＇ 5＇ 6＇ 8＇ 8a＇ 9＇ 10＇ 11＇ 12＇ 12a＇ 13＇ 13a＇ 1-OCH3 2-OCH3 11-OCH3 2＇-OCH3 3＇-OCH3 10＇- OCH3 11＇-OCH3 12＇- OCH3 N-CH3 140.8(s) 127.5(s) 113.0(s) 152.8(s) 99.7(d) 120.2(s) 26.6(t) 53.3(t) 63.9(d) 33.2(t) 127.0(s) 141.6(s) 126.2(d) 113.7(d) 153.7(s) 128.1(s) 113.2(d) 124.8(s) 151.0(s) 150.3(s) 110.5(d) 125.6(s) 26.6(t) 60.8(t) 52.7(t) 120.9(s) 152.2(s) 153.5(s)a 147.0(s)a 152.6(s) 123.0(s) 29.4(t) 60.4(d) 61.1(q) 56.7(q)b 61.1(q) 57.0(q) 56.7(q) 61.7(q)b 61.4(q) 56.7(q) 41.8(q) / / / / 5.84(s) / 3.05(m),3.13(m) 3.43(m),3.80(m) 4.16(d,J=12.5) 2.80(m),3.46(m) / / 7.38(d,J=11.4) 7.19(d,J=11.4) / / 6.88(s) / / / 7.01(s) / 3.13(m),3.30(m) 3.58(m),3.87(m) 4.47(d,J=17.1),4.69(d,J=17.1) / / / / / / 3.00(m),4.06(m) 4.79(dd,J1=14.3,J2=5.7) 3.76(s,3H) 3.55(s,3H) 3.82(s,3H) 3.87(s,3H) 3.91(s,3H) 3.55(s,3H) 3.63(s,3H) 3.85(s,3H) 3.16(s,3H) 1-OCH3,3 7 3,4 2-OCH3,3 4,5 9 7,10 11-OCH3,9,10 7,10 4＇ 2＇-OCH3,4＇,1＇ 3＇-OCH3,1＇,4＇ 1＇,13a＇ 8＇ 10＇-OCH3 11＇-OCH3 12＇-OCH3,13＇ 8＇些判断也与HMBC的信息相符合(见图2)。由于1H-NMR在δ8.0左右无吸收信号，表明C11上无芳氢，因此C11应为-OCH3或氧桥取代。这样，分子中的两个邻位氢应处于C8、C9或C9、C10上。HMBC表明C11为-OCH3取代，C8为氧桥取代，两个邻位氢则处于C9、C10上，见图2所示。原小蘖碱部分：以上己确定了3个芳氢的位置，根据1H-NMR和NOESY，剩下的两个芳氢应为各有一个邻位-OCH3取代基的独处芳氢。结合图1的骨架推断，这两个芳氢应处于C1’和C4’上，C2’和C3’上分别为-OCH3取代。并且这些判断也与HMBC的信息相符合(见图2)。另外氧桥只有处于C9’才符合全部的核磁共振数据。由此确定本发明化合物的结构为图1所示。这种由阿朴菲和原小蘖碱的氧桥相连的新型双生物碱，尚属首次报道。根据1H-1H COSY、13C-1H COSY和HMBC可确定其碳氢归属(见表3)。实施例4
本发明化合物的抗肿瘤作用
高倍光学和荧光显微镜形态学观察本发明化合物对体外培养的人肿瘤细胞系的作用，发现12小时后，肿瘤细胞生长受到抑制，并有凋亡现象出现；48小时后，肿瘤细胞全部死亡，出现许多细胞凋亡小体。运用酶联免疫检测其对肿瘤细胞半数生长抑制浓度(IC50)的结果为：胃癌细胞(Mgc)65μg/ml，肝癌细胞(Lcc)60μg/ml，宫颈癌细胞(Hela)37μg/ml，肺癌(Nsclc)82μg/ml；运用流式细胞术检测其诱导肺癌细胞凋亡率大于60％。