技术领域
本发明涉及一种在细菌宿主细胞中生产具有确定的均一N末端的 异源目标多肽的方法，其包括通过Npro自我蛋白水解活性，由包含具 有瘟病毒自我蛋白酶Npro的自我蛋白酶水解活性的肽和异源多肽的初 表达之融合蛋白，经自我蛋白水解得到目标异源多肽。
背景技术
在异种生物体中生产重组蛋白质，比如在细菌细胞中表达人蛋白 质或者其他真核蛋白质，通常很难得到尽可能近乎100％均一的确定N 末端，尤其是在重组药物蛋白质的应用中。这些重组蛋白质的氨基酸 序列在很多情况下应该和人或者动物天然蛋白质的氨基酸序列完全相 同。
在天然蛋白质的表达中，比如在人中，许多目前在应用的药物蛋 白质被转运到胞外间隙，切去前体蛋白质中的信号肽，得到N末端确 定的蛋白质。在细菌细胞中，由于几种原因，不容易得到这种均一N 末端的蛋白质。
细菌只有很少情况下可以在合适的原核或者真核信号肽序列帮助 下，输到细胞周质。而且因为细菌的功能不强，所以只能积累很少量 的产物。
然而，细菌细胞质和真核细胞的胞外区呈明显不同。一方面，那 里是还原条件；另一方面没有切去N末端前导序列产生成熟蛋白质的 机制。所有细胞质蛋白质合成时的第一个氨基酸是甲硫氨酸，也就是 起始密码子ATG编码的氨基酸。这个N末端甲硫氨酸在很多蛋白质中 仍然保留，而在其它一些蛋白质中被宿主细胞质中内在的甲硫氨酸氨 肽酶(MAP)切掉了。切除的效率依赖于两个因素：1，后面氨基酸的性 质；2，N末端在蛋白质空间构象中的位置。如果随后的氨基酸是丝氨 酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或者缬氨酸，以及N末端暴露，即没 有“埋藏”在蛋白质内部，那么N末端甲硫氨酸优先被切除。另一方 面，如果随后的氨基酸是其它氨基酸，尤其是带电荷的氨基酸(谷氨 酸、天冬氨酸、赖氨酸和精氨酸)，或者如果N末端位于蛋白质内部， 则大多数情况下N末端甲硫氨酸不会被切除。(Knippers，Rolf(1995) Molekulare Genetik，6th edition，Georg Thieme Verlag，Stuttgart， NewYork，ISBN 3-13-103916-7)
而且即使第二位的氨基酸能够促进甲硫氨酸的切除，切除很少会 是完全的。通常有一小部分(1％到50％)没有被MAP酶切。
在细菌细胞生产重组药物蛋白的早期，一般的方法是简单的把编 码甲硫氨酸的起始密码子ATG加到成熟蛋白质(即没有信号肽或其他 N末端区)的开放阅读框架(ORF)前面。因而表达出的蛋白质序列为 H2N-Met-目标蛋白质。在少数蛋白质的生产中，含有宿主内在的MAP 可以完全切除N末端甲硫氨酸。然而多数用这种方法生产的蛋白质具 有不均一N端(N端有Met和N端没有Met两种形式的混合物)，或 者N端都具有一个额外的外源氨基酸(N端全是甲硫氨酸的形式)。
然而，在很多情况下，这种不均一或者与天然序列不同是不能被 接受的，因为这些产物通常具有不同的免疫原性(比如诱导抗体形成 方面)和药理学性质(半衰期，药代动力学)。由于这些原因，很多 情况下必须生产性质相同的蛋白质(N端均一且没有外来氨基酸)。 在细胞质表达中，大多数情况通过在目标蛋白质N端融合一段可以被 特定内肽酶(例如因子Xa、肠激酶、KEX内肽酶和IgA蛋白酶)或氨 肽酶(例如二肽基氨肽酶)切除的序列来补救。然而，这就使产品在 后续处理即所谓的下游纯化之前必须增加一个步骤，这将消耗材料和 增加费用。
因而需要在细菌细胞中生产目标蛋白质的方法，从而可以得到具 有特定均一N端的目标蛋白质，并且不需要增加复杂体外纯化步骤(重 折叠、纯化、蛋白酶水解，进一步纯化等)。本发明建立了一个使用 瘟病毒自我蛋白酶Npro的生产蛋白质方法。
瘟病毒构成了一类能够引起世界范围猪和反刍动物严重经济损失 的病原体。在这些可传染疾病的病原体中，传统的猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)是非常重要的。牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起的损失也是相当严重的，特别是常 常子宫内感染胎牛。
瘟病毒是一种小的包膜病毒，其基因组直接充当mRNA，大小为 12.3kb，由此在细胞质中转录病毒基因产物。这一过程是以单一多蛋 白形式进行的，该多蛋白包括大约4000个氨基酸，在病毒和细胞蛋白 酶的作用下，大约被切割成12种成熟蛋白质。
到目前为止，已经在瘟病毒中鉴定了两个病毒编码的蛋白酶，即 自我蛋白酶Npro和丝氨酸蛋白酶NS3。N端蛋白酶Npro定位在该寡聚蛋 白质的N末端，表观分子量为23kd。它催化自身C末端(Cys168)和 核衣壳蛋白C的N末端(Ser169)之间的酶切。(R.Stark et al.，J.Viro1.657(1993)，7088-7095)另外，在致细胞病变的牛病毒 性腹泻病毒中发现Npro基因为重复形式。其中，在同样重复的NS3蛋 白酶的N端有另一个拷贝的Npro，在这种情况下也观察到Npro-NS3蛋白 质的自我蛋白水解。(R.Stark et al.，如上)
Npro是168个氨基酸组成的自我蛋白酶，表观分子量约为20kd(体 内)。它是瘟病毒(比如猪瘟病毒、边界病病毒(border disease virus，BDV)或者牛病毒性腹泻病毒)寡聚蛋白质中的第一种蛋白质， 可以把它和后面的核衣壳蛋白C自我蛋白酶切开来。(M.Wiskerchen et al.，J.Virol.65(1991)，4508-4514；Stark et al.， J.Virol.67(1993)，7088-7095)这个酶切发生在Npro序列最后一个氨 基酸，Cys168之后。
发明内容
本发明中惊人地发现，瘟病毒自我蛋白酶Npro的自我蛋白水解功 能在细菌表达系统中仍然存在，尤其是在异源蛋白质的表达中。因而 本发明涉及在细菌宿主细胞中生产具有确定的均一N端的目标异源多 肽的方法。其中由包含具瘟病毒自我蛋白酶Npro之自我蛋白水解活性 的肽和异源多肽的初始表达融合多肽，通过Npro自我蛋白水解活性而 切下目标异源多肽。本发明还涉及本发明的这个过程所用到的克隆方 法。
具有瘟病毒自我蛋白酶Npro自我蛋白水解活性的多肽或者具有瘟 病毒自我蛋白酶Npro自我蛋白水解功能的多肽，具体地是瘟病毒自我 蛋白酶Npro或者是其具有自我蛋白水解活性的衍生物。
在本发明中，名词“异源多肽”是指不会被瘟病毒自我蛋白酶Npro由天然融合蛋白质或者多蛋白天然切割的多肽。异源多肽的例子是工 业酶(工艺酶)或者药物活性多肽，尤其是可以用于人的药物活性多 肽。
在人体中具有药物活性的优选多肽的例子是细胞因子，比如白介 素，例如白介素-6(IL-6)；干扰素，比如白细胞干扰素，例如干 扰素α2B；生长因子，尤其造血或愈伤生长因子，比如G-GSF，促红 细胞生成素或IGF；激素比如人生长激素(hGH)；抗体或者疫苗。
一方面，本发明涉及编码融合蛋白质的核酸分子，其中所述融合 蛋白质包括具有瘟病毒自我蛋白酶Npro的自我蛋白水解功能的第一种 多肽，以及连接在第一种多肽C末端的第二种多肽，该第一和第二种 多肽的连接方式可以使得第二种多肽能够被第一种多肽的自我蛋白水 解活性从融合蛋白中切下，并且该第二种多肽是异源多肽。
用于该目的瘟病毒优选自猪瘟病毒、边界病病毒和牛病毒性腹泻 病毒，其中猪瘟病毒是首选。
本发明的优选核酸序列是其中融合蛋白质的第一种多肽包含如下 的CSFV自我蛋白酶Npro氨基酸序列(也可以参见EMBL数据库编号 X87939)(氨基酸1到168，方向为N端到C端)得序列：
(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDL PRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYH IYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168)，
或者其具有自我蛋白水解活性的衍生物的氨基酸序列。
具有猪瘟病毒自我蛋白酶Npro的自我蛋白水解活性的衍生物是通 过诱变，尤其是氨基酸替换、删除、增加和/或氨基酸插入而产生的那 些自我蛋白酶Npro，条件是保留了所需的自我蛋白水解活性，尤其是产 生具均一N末端目标蛋白所需活性。本领域技术人员熟知诱变产生这 些衍生物的方法。例如，可能通过这些突变方法相对于不同的待切割 异源蛋白质优化自我蛋白酶Npro水解活性。构建好编码包含目标异源 蛋白质和自我蛋白酶Npro衍生物(其中所述Npro衍生物和天然Npro蛋白质 相比可能具有一个或多个突变)的融合蛋白质的核酸之后，通过在表达 体系中测定自我蛋白水解活性来确定是否存在所需功能。
自我蛋白水解活性最初能够在体外系统中进行检测。为了进行检 测，通过使用体外翻译试剂盒，把DNA构建物转录成RNA，然后翻译 成蛋白质。为了增加灵敏度，在某些情况下通过掺入放射性标记的氨 基酸来标记所得蛋白质。产生的Npro-目标蛋白融合蛋白质产物在翻译 过程中和/或之后，被自我蛋白酶Npro准确切除N端的Npro部分，产生 目标蛋白质。可以很容易检测酶切产物，并且可以很容易的处理体外 翻译反应之后的混合物。然后用混合物加样到蛋白质凝胶(例如Lammli SDS-PAGE)上并进行电泳。随后，凝胶用合适的染料染色或者放射自 显影显色。也可能进行Western杂交，随后免疫染色。融合蛋白质酶 切效率可以从蛋白质产物条带的亮度得知。
下一步，可以把融合蛋白质的核酸片段克隆到细菌表达载体中(如 果因为进行体外翻译，还没有构建的话)，并把后者转化到合适的宿 主中(例如大肠杆菌(E.coli))。所得到的表达菌株组成性表达或者 在加入诱导物之后表达融合蛋白质。后面这种情况就需要在加入诱导 物之后，多培养1个小时或更长时间，以得到足够量的产物。接着自 我蛋白酶Npro在翻译过程中或者之后水解所表达的融合蛋白质，从而 产生自我蛋白酶Npro本身和具有确定N端的目标蛋白质。量培养或诱 导期结束后取少量样品，如上所述用SDS-PAGE方法进行检测，从而 评估酶切反应的效率。
所述融合蛋白质的优选自我蛋白酶Npro衍生物具有，例如其中2 到21氨基酸区的1个或多个氨基酸被删除或替换的N末端区，但其衍 生物仍然有足够水平的Npro自我蛋白水解活性。本发明中融合蛋白质 中优选的自我蛋白酶Npro衍生物包含，例如CSFV自我蛋白酶Npro的氨基 酸序列，并且其中2到16或2到21位氨基酸删除。也可能有氨基酸 替换或增加来交换或引入氨基酸序列，从而例如引入有助于纯化的氨 基酸序列(见实施例)。
本发明特别优选的核酸分子是其中第一种多肽包括CSFV自我蛋 白酶Npro的Glu22到Cys168氨基酸序列，或其具有自我蛋白酶活性的 衍生物，该第一种多肽N端为甲硫氨酸，异源多肽直接与CSFV自我蛋 白酶Npro的Cys168相连。
本发明同样优选的核酸分子是其中第一种多肽包括CSFV自我蛋 白酶Npro的Pro17到Cys168氨基酸序列，或其具有自我蛋白酶活性的 衍生物，而且第一种多肽N端为甲硫氨酸，异源多肽直接与CSFV自我 蛋白酶Npro的Cys168相连。
本发明的核酸分子尤其是DNA分子形式。
本发明进一步涉及克隆元件，尤其是含有本发明的核酸分子的表 达载体和宿主细胞。因此本发明进一步涉及和预定细菌宿主细胞相容 的表达载体，其包含本发明的核酸分子和至少一个表达调控序列。表 达调控序列尤其是启动子(比如lac，tac，T3，T7，Trp，gac，vhb，lambda pL或phoA)、核糖体结合位点(例如属于上述启动子的天然核糖体结 合位点，cro或合成核糖体结合位点)或者转录终止子(例如rrnB T1T2 或bla)。上面的宿主细胞优选埃希氏菌属细胞，尤其是大肠杆菌。 然而，也可能用其他细菌细胞(参见下文)。在一个优选实施方案中， 本发明的表达载体是质粒。
本发明进一步涉及包含本发明的表达载体的细菌宿主细胞。这样 的细菌宿主细胞可以从下面的微生物组中选择，例如：革兰氏阴性细 菌(Gram-negative bacteria)比如埃希氏菌(Escherichia species)， 例如大肠杆菌；或其他革兰氏阴性细菌，例如假单胞菌(Pseudomonas)， 比如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；或柄杆菌 (Caulobacter)，比如新月形柄杆菌(Caulobacter crescentus)； 或革兰氏阳性细菌(Gram-positive bacteria)比如芽孢杆菌 (Bacillus)，尤其是枯草芽孢杆菌(Bacilus subtills)。大肠杆 菌特别优选作为宿主细胞。
本发明进一步涉及生产目标异源多肽的方法，包含：
(i)培养具有包含本发明核酸分子的本发明表达载体的本发明细 菌宿主细胞，其中培养是在可以使融合蛋白质表达，并且使宿主细胞 中通过第一种多肽的自我蛋白水解活性将异源多肽由融合蛋白质自我 蛋白水解下来的条件下进行的。
(ii)分离裂解下的异源多肽产物。
本发明的方法主要是通过首先按已知的微生物学方法培养细菌宿 主细胞即表达菌株进行。菌株通常来自营养培养基上的单克隆，但是 它也可能用低温保藏的细菌悬浮液(细胞库)。为了得到足够下一步 使用的生物量，菌株通常需要经过多步培养。
小规模培养中，可以使用摇瓶，大多数情况下可能采用复合培养 基(complex medium)(比如LB肉汤培养基)。然而，也可能使用已 知成分培养基(defined medium)(例如柠檬酸盐培养基(citrate medium))。培养时，先制备小量宿主菌株预培养物(从单克隆或低 温保藏的细菌悬浮液接种)，其培养温度对于后面的表达结果影响不 是很大，因而一般选择相对较高的温度(例如30℃或37℃)。主要培 养物体积一般比较大(例如500ml)，此时尤其需要好的通风条件(大 摇瓶里装少量培养基，高速旋转)。因为想要让表达产物为可溶形式， 所以主要培养大多在相对比较低的温度(例如22℃或28℃)下培养。 诱导系统(例如trp、lac、tac或phoA启动子)和组成性系统二者都 适于产生可溶性蛋白质。对数生长期后期之后(通常摇瓶中OD值0.5 到1.0)，在诱导系统中加入诱导物(例如吲哚丙烯酸(indoleacrylic acid)，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG))，继续培养1到5个小时。此时 诱导物的浓度最好选择在低限，以便能够细微表达。在这个过程中， 大部分Npro-目标蛋白质融合蛋白质形成，在翻译过程中或者之后Npro部分被水解，以致于培养结束时两个裂解部分已经分开了。最后收集 所得细胞并进行下一步的处理。
大规模培养中，多步培养系统由多个生物反应器(发酵罐)组成， 为了提高整个过程的工程化控制，此时优选使用已知成分营养培养基。 另外，它可以通过调节特殊营养物(分批补料(fed batch))的浓度， 大大增加生物量和产物形成。其他的步骤和摇瓶法相似。例如，使用 了早期发酵罐和主要发酵罐，培养温度的选择也和摇瓶法类似。早期 发酵罐用从单克隆或低温保藏的细菌悬浮液接种的在摇瓶中培养一段 时间的所谓接种物接种。发酵罐中必须保证好的通风条件和足够的诱 导物浓度，其中尤其在主要发酵罐中。然而，在某些情况下和摇瓶相 比诱导期必须延长。最后同样对所得细胞进行下一步的处理。
从融合蛋白质上切下来的异源目标蛋白质可以通过本领域技术人 员熟知的蛋白质纯化方法(参见，例如M.P.Deutscher，in：Methods in Enzymology：Guide to Protein Purification，Academic Press Inc.，(1990)，309-392)进行分离。纯化方法一般包括细胞破碎步骤、 澄清步骤(离心或微量过滤)、各个层析步骤、过滤和沉淀。
具体实施方式
下面的实施例只是用来举例说明，并没有从任何角度限制本发明。
实施例
实施例1：Npro-C融合蛋白质在细菌宿主中的表达和体内切割
构建在细菌宿主中表达Npro-C融合蛋白质的质粒NPC-pET。表达 载体采用了pETlla载体(F.W.Studier et al.，Methods.Enzymol.185(1990)，60-89)。将Npro-C融合蛋白质的 天然结构基因(来自猪瘟病毒RNA基因组)克隆入该表达载体。用PCR 方法从已转录成cDNA的病毒基因组扩增融合蛋白质的结构基因(并且 克隆到载体中)。此外，天然Npro序列的开始16个氨基酸 (MELNHFELLYKTSKQK)被一段10个氨基酸的寡聚组氨酸纯化辅助序列 (MASHHHHHHH)替换。最后得到的构建物被命名为NPC-pET。NPC- pET中编码的Npro部分和Npro-C融合蛋白质自我蛋白水解位点的序列 结构如下，其中水解位点在Cys168和Ser169之间。 MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGN HLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCIL LKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC(168)s(169)DDGAS-(nucleocapsld proteln C)
在该序列中，天然Npro序列的17位脯氨酸(融合蛋白质的第二位) 是斜体，C序列起始部分是粗体。融合蛋白质分子量大约为32kd，其 中自我蛋白水解之后，Npro部分为18kd，C部分为14kd。
为了衡量酶切位点C端第一个氨基酸的重要性，用定点诱变的方 法把天然蛋白质的Ser169替换成其他19种天然氨基酸。将由此构建 好的构建物命名为NPC-pET-Ala，NPC-pET-Gly等。再用这些质粒构建 表达菌株。
用大肠杆菌BL21(DE3)作为表达Npro-C融合蛋白质的大肠杆菌 宿主菌株。这个菌株具有如下基因型：
E.coli B F dcm omp T hsdS(rb-mb-)ga/λ(DE3)
可以从Stratagene公司购买这个菌株的感受态细胞。它的基因组 中含有一个溶原性λ噬菌体，其包含处于lacUV5启动子调控下的T7 RNA聚合酶基因。因而，可以通过加入异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 诱导T7RNA聚合酶和目标蛋白质的产生。很多目标蛋白质都可以通过 这个两步系统达到相当高的特异和绝对表达水平。
用相应表达质粒转化BL21(DE3)构建表达菌株BL21(DE3)[MPC -pET]，BL21(DE3)[MPC-pET-Ala]等。按照感受态细胞生产商 (Stratagene公司或Novagen公司)说明书进行转化。将转化混合物 铺在含有100mg/l氨苄青霉素的Luria琼脂平板培养基上，37℃培养 过夜。
挑选具有清晰边缘的中等大小克隆作为合适表达菌株。培养该克 隆之后，在-80℃低温保藏于冷藏小管中(master cell bank MCB)。 将菌株在Luria琼脂平板(含有氨卡青霉素)上划线以便日常使用。
使用特定菌株，由在琼脂平板上传代培养的单菌落接种摇瓶中的 早期培养物。取部分早期培养物接种(取10ml，加入到装有200ml培 养基的摇瓶中)主要培养物，直到OD600值达到0.5到1.0。接着用1.0 mM IPTG(终浓度)诱导融合蛋白质的生产。再培养培养物2到4小时， 直到OD600值达到1.0到2.0。培养温度为30℃+/-2℃，培养基为LB 培养基+2g/l葡萄糖+100mg/l氨苄青霉素。
诱导前和诱导后不同时间从培养物中取样，并进行离心，用变性 样品缓冲液将沉淀煮沸，并经SDS-PAGE、考马氏亮蓝(Coomassie) 染色或Western杂交分析。样品在标准化条件下采集，培养物密度的 不同通过调整悬浮所用样品上样缓冲液的体积进行补偿。
诱导后显示的条带位于大于20kd处(Npro)和大约14kd处(C)。 每种构建物的融合蛋白质酶切效率用考马氏亮蓝染色凝胶中和 Western杂交中的亮度进行衡量。结果发现，在酶切位点C端第一位(即 靶蛋白质N末端)可以耐受大多数氨基酸，即发生非常有效的自我蛋白 水解切割。
这些数据显示，原则上有可能成功应用自我蛋白酶Npro的自我蛋 白水解活性，实现在细菌宿主细胞中重组融合蛋白的特异性切割。 实施例2：表达和体内水解Npro-人白细胞介素6(human interleukin 6， hIL6)融合蛋白质，生产均一的成熟hIL6
构建表达Npro-hIL6融合蛋白质的质粒NP6-pET。表达载体采用 pET11a(F.W.Studier et al.，Methods.Enzymol.185(1990)，60-89)。 首先，将包含Npro和猪瘟病毒核衣壳蛋白质的融合蛋白克隆到这个表 达载体(参见实施例1)。通过PCR方法构建该融合蛋白质的结构基 因。其中，天然Npro序列的开始16个氨基酸(MELNHFELLYKTSKQK)被 10个氨基酸的寡聚组氨酸纯化辅助序列(MASHHHHHHH)替换。
通过定点诱变的方法，在所得表达质粒中Npro和核衣壳蛋白质之 间的接头部分引入Spe I酶切位点。这样就可以用限制性内切酶Spe I (5’端，对应于蛋白质的N端)和Xho I(3’端，对应于蛋白质的C 端)由载体删除核衣壳蛋白质的结构基因。通过制备性凝胶电泳，就 可以得到去除核衣壳蛋白质基因片段的相应线性Npro-pET11a载体。 之后，可以通过Spe I和Xho I粘性末端把hIL6结构基因导入载体。
下面的准备工作是非常必要的。用高保真PCR的方法(例如采用 Roche Biochemicals公司的Pwo系统，按照其说明进行操作)从hIL6 cDNA克隆扩增结构基因，所述克隆可以由C10MJ2细胞产生。下面的 寡聚核苷酸就是用于这一PCR扩增的引物：
寡 核苷酸1(“N端”)
5′-ATAATTACTA GTTGTGCTCC AGTACCTCCA GGTGAAG-3′
寡 核苷酸2(“C端”)
5′-ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTACATTTGC CGAAGAGCCC TCAGGC-3′
通过所用的寡核苷酸，在5’端引入了Spe I酶切位点，在3’端引 入了Xho I酶切位点。另外，为了使翻译有效终止，在结构基因的3’ 端引入了双赭石终止密码子(TAATAA)。前端的Spe I酶切位点有助于 与前面提到的Npro-pET11a载体读框一致地连接。后面的Xho I酶切 位点可以促使定向克隆。
含有hIL6结构基因的PCR片段(539bp)的序列如下所示(方向 为N端到C端)。限制性切割位点具有下划线，hIL6的第一个密码子 (Ala)和终止密码子为粗体：
ATAATT ACTAGTTGTGCTCCAGTACCTCCAGGTGAAGATTCTAAAGATGTAGCCGCCCCACACAGAC AGCCACTCACCTCTTCAGAACGAATTGACAAACAAATTCGGTACATCCTCGACGGCATCTCAGCCCT GAGAAAGGAGACATGTAACAAGAGTAACATGTGTGAAAGCAGCAAAGAGGCACTGGCAGAAAACAAC CTGAACCTTCCAAAGATGGCTGAAAAAGATGGATGCTTCCAATCTGGATTCAATGAGGAGACTTGCC TGGTAAAAATCATCACTGGTCTTTTGGAGTTTGAGGTATACCTAGAGTACCTCCAGAACAGATTTGA GAGTAGTGAGGAACAAGCCAGAGCTGTGCAGATGAGTACAAAAGTCCTGATCCAGTTCCTGCAGAAA AAGGCAAAGAATCTAGATGCAATAACCACCCCTGACCCAACCACAAATGCCAGCCTGCTGACGAAGC TGCAGGCACAGAACCAGTGGCTGCAGGACATGACAACTCATCTCATTCTGCGCAGCTTTAAGGAGTT CCTGCAGTCCAGCCTGAGGGCTCTTCGGCAAATGTAATAA CTCGAGGATCCAATTAT
PCR产物和Npro-pET11a质粒连接之后得到的构建物命名为NP6- pET。
NP6-pET编码的Npro-hIL6融合蛋白质的序列(共有347个氨基 酸，其中Npro部分有162个氨基酸，hIL6部分有185个氨基酸)如下 所示，hIL6部分序列为粗体：
MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGN HLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCIL LKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISA LRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRF ESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKE FLQSSLRALRQM
融合蛋白质还原态分子量为39,303.76d，若酶切之后，Npro部分 (还原态)分子量将为18,338.34d，hIL6部分(还原态)分子量将为 20,983.63d。Npro部分具有6个半胱氨酸，hIL6部分有4个。细菌细 胞质中，这些半胱氨酸可能大多处于还原状态。在后续加工中，推测 至少部分形成了二硫键。据估计，融合蛋白质(或Npro部分)N末端的 甲硫氨酸大多数被宿主内在的甲硫氨酸氨肽酶(MAP)切掉了，因而分子 量将减少大约131d，分别变成39,172.76d(融合蛋白质)和18,207.13 d(Npro部分)。
表达Npro-hIL6融合蛋白质的大肠杆菌宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3)(参见实施例1)。
通过实施例1中所述的方法把表达质粒MP6-pET转化到菌株BL21 (DE3)中构建表达菌株BL21(DE3)[MP6-pET]。
从琼脂平板上挑取表达菌株BL21(DE3)[MP6-pET]的单菌落进 行传代培养，之后接种LB+100mg/l氨苄青霉素(1升摇瓶中装有200ml 培养基)早期培养基。30℃，250rpm培养早期培养物14个小时，直 到OD值600nm达到1.0左右。接着取10ml早期培养物，接种主要培养 物(每个1升摇瓶中装有330ml LB培养基)(3％的接种量)。30℃， 250rpm进行主要培养，直到OD值600nm达到0.8左右，接着用0.5或 1.0mM IPTG(终浓度)诱导融合蛋白质的表达。再30℃，250rpm培 养3个小时，直到OD600值达到大约1.0到2.0。
把培养物转入500ml灭过菌的离心杯中，10,000g离心30分钟。 完全弃去离心后上清，于-80℃冻存沉淀，以备进一步处理。
完全裂解物中新蛋白质条带可通过SDS-PAGE电泳，考马氏亮蓝 染色容易地检测。BL21(DE3)[MP6-pET]裂解液中存在的各个条带表 观分子量大约为19kd，21kd，40kd。用特异的抗hIL6抗体进行的 表达分析基本上确认了考马氏亮蓝染色之后获得的实验结果。
为了优化Npro-hIL6的酶切，在不同温度和不同IPTG浓度下进行 诱导，然后再用凝胶染色和Western杂交进行分析。结果发现在22℃ 的培养温度下，Npro-IL6几乎可以被完全酶切。
这个实验显示在细菌表达系统中，也可以把异源蛋白质融合在Npro的C端，并且可以得到很有效的酶切。随后的蛋白质N端氨基酸的改 变(丙氨酸代替丝氨酸)也没有不利的影响。因而，这个系统适用于 生产具有均一的真实N端的重组蛋白质，尤其是在细菌表达系统这样 的异源表达系统中，并且不需要进一步的处理步骤。
实施例3：通过包含Npro和人干扰素α2β(IFNα2β)的融合蛋白质的表 达和体内酶切，生产均一的成熟IFNα2β
参见实施例2中就hIL6所述的方法克隆IFNα2β得到载体 NPI-pET。用高保真PCR的方法(例如采用Roche Biochemicals公司 的Pwo系统，按照说明进行操作)扩增结构基因。模板采用可以使用 技术人员熟知的标准方法由人白细胞制备的IFNα2β-cDNA克隆。或者 也可能合成整个基因。结构基因的序列可参见Genbank数据库V00548 号。使用下面的寡聚核苷酸进行PCR扩增：
寡核苷酸1(“N端”)
5′-ATAATTACTA GTTGTTGTGA TCTGCCTCAA ACCCACAGCC-3′
寡核苷酸2(“C端”)
5′-ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTATTCCTTA CTTCTTAAAC TTTCTTGCAA G-3′
IFNα2β结构基因的PCR片段(533bp)序列如下所示。限制性内 切位点具有下划线，IFNα2β的第一个密码子(Cys)和终止密码子为 粗体：
ATAATT ACTAGTTGTTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCC TGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCA GGAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAG ATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCT ACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGA GACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTGAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTAT CTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTT CTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAATAATAA CTCGAGGATCCAATTAT
将PCR产物和Npro-pET11a质粒连接之后得到的构建物命名为NPI -pET。
NPI-pET质粒编码的Npro-IFNα2β融合蛋白质的序列(共有327 个氨基酸，其中Npro部分有162个氨基酸，IFNα2β部分有165个氨基 酸)如下所示，其中IFNα2β部分序列为粗体(方向为N端到C端)：
MASHHHHHHHPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGN HLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCIL LKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCCDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRRISLFSCLKDRHDFGFP QEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVT ETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE
还原态融合蛋白质的分子量为37,591.44d，发生可能的酶切之 后，Npro部分(还原态)分子量应为18,338.34d，IFNα2β部分(还 原态)分子量应为19,271.09d。Npro部分具有6个半胱氨酸，IFNα2β 部分有4个。这些半胱氨酸在细菌细胞质中有可能大多处于还原状态。 在后续加工中，推测至少部分形成了二硫桥。据估计，融合蛋白质(或 Npro部分)N末端的甲硫氨酸大多数被宿主内在的甲硫氨酸氨肽酶(MAP) 切掉了，因而分子量减少了大约131d，分别变成37,460.23d(融合 蛋白质)和18,207.13d(Npro部分)。
表达Npro-IFNα2β融合蛋白质的大肠杆菌宿主细胞为大肠杆菌 BL21(DE3)(参见实施例1)。
通过实施例1中所述的方法把上述表达质粒NPI-pET转化到菌株 BL21(DE3)中构建了表达菌株BL21(DE3)[NPI-pET]。
从琼脂平板上挑取单菌落，对菌株BL21(DE3)[NPI-pET]进行 传代培养，之后接种LB+100mg/l氨苄青霉素(1升摇瓶中装有200ml 培养基)早期培养物。30℃，250rpm培养14小时，直到OD600nm达到 1.0左右。接着取10ml早期培养物，接种主要培养物(每个1升摇瓶 装有330ml LB培养基)(3％的接种量)。30℃，250rpm进行主要培 养，直到OD600nm达到0.8左右，接着用0.5或1.0mM IPTG(终浓度) 诱导融合蛋白质的表达。再在30℃，250rpm继续培养3个小时，直到 OD600达到大约1.0到2.0。
把培养物转入500ml灭过菌的离心杯中，10,000g离心30分钟。 完全弃去离心后上清，于-80℃冻存沉淀，以备进一步处理。
完全裂解物中新蛋白质条带可通过SDS-PAGE电泳，考马氏亮蓝 染色，很容易地检测。BL21(DE3)[NPI-pET]裂解液存在的各个条带 分子量大约为19kd，38kd。在SDS-PAGE中IFNα2β条带和Npro条带无 法分离。
使用特异性的抗IFNα2β对这些样品进行分析，进一步证实存在经 切割的IFNα2β条带。为了优化Npro-IFNα2β的酶切，同样在不同温度 和不同IPTG浓度下进行诱导，然后再用凝胶染色和Western杂交进行 分析。结果同样发现，这种情况下在22℃到30℃的较低培养温度下， 获得较佳的切割。