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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410178685.9 (22)申请日 2014.04.29 C12N 15/113(2010.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 暨南大学 地址 510632 广东省广州市黄埔大道西 601 号 (72)发明人 齐绪峰 夏景波 陈卓莹 蔡冬青 龙颖妍 赵天琪 吴彩红 王健欢 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 苏运贞 陈燕娴 (54) 发明名称 一种有效抑制大鼠 FoxO3a 基因表。
2、达的 shRNA 及其应用 (57) 摘要 本发明涉及一种shRNA， 特别涉及一种有效抑 制大鼠 FoxO3a 基因表达的 shRNA 及其应用。编 码所述 shRNA 的 DNA 序列， 如下所示 ： 5 -GGAACT TCACTGGTGCTAAGCGCAAGAGGCTTAGCACCAGTGAAGTTC C-3 ， 所述的 GCAAGAG 为 loop 序列。所述的有效 抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA的应用包括将 所述的 shRNA 构建于慢病毒载体上， 得到含有所 述 shRNA 的重组载体 ； 将含有所述 shRNA 的重组 载体作用于大鼠细胞， 达到抑制大鼠 FoxO3a。
3、 基因 表达的目的。 该shRNA能有效抑制大鼠FoxO3a基 因在 mRNA 及蛋白水平的表达。 (51)Int.Cl. 审查员 高巍 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图4页 CN 103952410 B 2016.02.10 CN 103952410 B 1/1 页 2 1.一种有效抑制大鼠 FoxO3a 基因表达的 shRNA， 其特征在于 ： 编码所述 shRNA 的 DNA 序列如下所示 ： 5 -GGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCAAGAGGCTTAGCACCAGTGAAGTTCC-3 ，其 中， GCA。
4、AGAG 为 loop 序列。 2.权利要求1所述的shRNA在制备FoxO3a基因功能研究的产品以及在制备FoxO3a基 因有关疾病的靶向治疗药物中的应用。 3.根据权利要求 2 所述的 shRNA 在制备 FoxO3a 基因功能研究的产品以及在制备 FoxO3a 基因有关疾病的靶向治疗药物中的应用， 其特征在于该应用包括将权利要求 1 中所 述的DNA序列构建于慢病毒载体上， 得到含有权利要求1中所述DNA序列的重组载体 ； 将含 有权利要求 1 中所述 DNA 序列的重组载体作用于大鼠细胞， 达到抑制大鼠 FoxO3a 基因表达 的目的。 4.根据权利要求 3 所述的 shRNA 在制备。
5、 FoxO3a 基因功能研究的产品以及在制备 FoxO3a 基因有关疾病的靶向治疗药物中的应用， 其特征在于 ： 所述慢病毒载体为 pGLV3 慢病毒穿梭载体。 5.根据权利要求 4 所述的 shRNA 在制备 FoxO3a 基因功能研究的产品以及在制备 FoxO3a 基因有关疾病的靶向治疗药物中的应用， 其特征在于 ： 所述的含有权利要求 1 中所述 DNA 序列的重组载体的制备方法， 包含以下步骤 ： (1) 设计含有抑制大鼠 FoxO3a 基因表达的 shRNA 的 DNA 序列， 如下所示 ： 5 -GGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCAAGAGGCTTAGCACCAGTGA。
6、AGTTCC-3 ， 斜 体 加 下 划 线 为 loop 序列 ； 为将其克隆到 pGLV3 慢病毒穿梭载体上， 合成以下正义链及反义链 DNA 序列 ： FoxO3a-shRNA-2296 正义链 ： 5 -GATCCGGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCAAGAGGCTTAGCACCAGTGAAGTTCCTTTTTTG-3 ； FoxO3a-shRNA-2296 反义链 ： 3 -GCCTTGAAGTGACCACGATTCGCGTTCTCCGAATCGTGGTCACTTCAAGGAAAAAACTTAA-5 ； 上述正义链模板的 5 端添加了 GATCC， 与 BamH I 酶切后。
7、形成的粘端互补 ； 反义链模板 的 5 端添加了 AATTC， 与 EcoR I 酶切后形成的粘端互补 ； (2) 将等量的正义链和反义链 DNA 混合， 进行退火， 以形成 DNA 双链， 得到 shRNA 模板 ； (3) 将 pGLV3 载体用 BamH I 和 EcoR I 双酶切， 得到线性化的 pGLV3 载体 ； (4)将步骤(2)中的shRNA模版和步骤(3)中线性化的pGLV3载体进行连接， 得到重组 载体 pGLV3-FoxO3a-shRNA。 6.根据权利要求 5 所述的 shRNA 在制备 FoxO3a 基因功能研究的产品以及在制备 FoxO3a 基因有关疾病的靶向治疗。
8、药物中的应用， 其特征在于 ： 步骤 (2) 中所述的 shRNA 模板的终浓度为 200nM。 7.根据权利要求 5 所述的 shRNA 在制备 FoxO3a 基因功能研究的产品以及在制备 FoxO3a 基因有关疾病的靶向治疗药物中的应用， 其特征在于 ： 步骤 (3) 中所述的线性化的 pGLV3 载体的终浓度为 50ng/L。 权 利 要 求 书 CN 103952410 B 2 1/6 页 3 一种有效抑制大鼠 FoxO3a 基因表达的 shRNA 及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种 shRNA， 特别涉及一种有效抑制大鼠 FoxO3a 基因表达的 shRNA 及 其应用。 。
9、背景技术 0002 FoxO3a是属于Forkhead box(Fox)蛋白家族的一个核转录因子， 可通过调节Bim、 Fas ligand(FasL)、 TNFR2、 p27、 p53、 抗氧化物酶等多种下游靶基因的转录而发挥促细胞凋 亡、 细胞周期阻滞及抗氧化等不同的生物学功能。目前研究认为， FoxO3a 广泛分布于哺乳 动物的多种组织和细胞中， 并参与糖代谢、 骨骼肌的分化发育、 血管发生、 抑制细胞增殖、 抑 制心肌肥厚等生理和病理过程。因此， 研究不同病理及生理条件下 FoxO3a 转录因子的功能 越来越受到人们的广泛关注。 0003 随着RNA干扰技术的不断深入发展， 将设计合成。
10、的shRNA构建到慢病毒表达系统， 进而感染特定的靶细胞， 特异性沉默相关基因表达， 已经成为研究基因功能的最有效的手 段之一， 也是靶向基因治疗的有效途径。 shRNA慢病毒表达系统有效克服了以往人工合成的 siRNA 转染效率低、 持续时间短等不足， 已经逐步发展成为在原代细胞及体内研究基因功能 的有效途径之一。针对大鼠 FoxO3a 基因设计特异性的 shRNA 序列， 构建相应的慢病毒表达 系统， 为今后深入研究大鼠FoxO3a基因的功能奠定了基础， 可广泛应用于FoxO3a基因相关 的大鼠细胞及动物模型， 具有重要的应用前景和经济价值。 发明内容 0004 本发明的首要目的在于克服现。
11、有技术的缺点与不足， 提供一种有效抑制大鼠 FoxO3a 基因表达的 shRNA。 0005 本发明的另一目的在于提供上述有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA的应用。 0006 本发明的再一目的在于提供一种含有上述 shRNA 的重组载体。 0007 本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 0008 一种有效抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA， 其靶向大鼠FoxO3a基因的序列如下 所示 ： 5 -GGA ACT TCA CTG GTG CTA AGC-3 ， 位于大鼠FoxO3a基因mRNA(NM-001106395.1) 的 2296 位点开始的 21 个碱基序列 ； 0009。
12、 编码所述的抑制大鼠 FoxO3a 基因表达的 shRNA 的 DNA 序列， 如下所示 ： 0010 5 -GGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCTTAGCACCAGTGAAGTT CC-3 ， 斜体加下划 线为 loop 序列 ； 0011 所述的有效抑制大鼠 FoxO3a 基因表达的 shRNA 的应用， 该应用包括将所述的 shRNA 构建于慢病毒载体上， 得到含有所述 shRNA 的重组载体 ； 将含有所述 shRNA 的重组载 体作用于大鼠细胞， 达到抑制大鼠 FoxO3a 基因表达的目的 ； 0012 所述慢病毒载体为 pGLV3/H1/GFP+Puro(pGLV3) 慢。
13、病毒穿梭载体 ； 0013 所述的含有所述 shRNA 的重组载体的制备方法， 包含以下步骤 ： 说 明 书 CN 103952410 B 3 2/6 页 4 0014 (1) 设计含有抑制大鼠 FoxO3a 基因表达的 shRNA 的 DNA 序列， 如下所示 ： 0015 5 -GGAACTTCACTGGTGCTAAGCGCTTAGCACCAGTGAAGTT CC-3 ， 斜体加下划 线为 loop 序列 ； 0016 为将其克隆到 pGLV3 慢病毒穿梭载体上， 合成以下正义链 (F) 及反义链 (R)DNA 序 列 ： 0017 FoxO3a-shRNA-2296 正义链 ： 0018。
14、 5 - G A T C C TTTTTTG-3 ； 0019 FoxO3a-shRNA-2296 反义链 ： 0020 3-G AAAAAACTTAA-5 ； 0021 上述正义链模板的 5 端添加了 GATCC， 与 BamH I 酶切后形成的粘端互补 ； 反义链 模板的 5 端添加了 AATTC， 与 EcoR I 酶切后形成的粘端互补 ； 0022 (2)将等量的正义链和反义链DNA混合， 进行退火， 以形成DNA双链， 得到shRNA模 板 ； 0023 (3) 将 pGLV3 载体用 BamH I 和 EcoR I 双酶切， 得到线性化的 pGLV3 载体 ； 0024 (4)将步。
15、骤(2)中的shRNA模版和步骤(3)中线性化的pGLV3载体进行连接， 得到 重组载体 pGLV3-FoxO3a-shRNA ； 0025 步骤 (2) 中所述的 shRNA 模板的终浓度优选为 200nM ； 0026 步骤 (3) 中所述的线性化的 pGLV3 载体的终浓度优选为 50ng/L ； 0027 将重组载体 pGLV3-FoxO3a-shRNA 与包装载体 pGag/Pol、 pRev、 pVSV-G 一起倒入 293T 细胞， 收集培养上清获得含有目的 shRNA 的病毒颗粒， 可用于转染目的细胞。 0028 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果 ： 0029 本发明所。
16、述抑制大鼠 FoxO3a 基因表达的 shRNA 能有效抑制大鼠 FoxO3a 基因在 mRNA及蛋白水平的表达。 将所述抑制大鼠FoxO3a基因表达的shRNA构建于慢病毒载体上， 不仅可有效作用于分裂及非分裂状态的细胞， 也适用于体内及体外研究。 同时， 对于深入研 究大鼠 FoxO3a 基因的功能及其相关疾病的治疗均具有重要的科学意义及应用前景。 附图说明 0030 图 1 是本发明所设计的靶向抑制大鼠 FoxO3a 基因表达的 shRNA 的设计位点对比 图。 0031 图 2 是用荧光显微镜检测将重组载体导入原代大鼠心脏微血管内皮细胞的效率 图。 0032 图 3 是利用 Weste。
17、rn blotting 技术检测转染 4 种重组慢病毒载体后大鼠细胞中 内源性 FoxO3a 蛋白表达水平分析图， 其中， A 为所设计的 4 种 shRNA 对 FoxO3a 蛋白表达抑 说 明 书 CN 103952410 B 4 3/6 页 5 制的 Western Blotting 分析 ； B 为 FoxO3a 蛋白的相对表达量统计分析 ； C 为 4 种 shRNA 对 FoxO3a 蛋白表达的抑制率统计分析。 0033 图 4 是用 RT-PCR 技术检测大鼠细胞中内源性 FoxO3a 基因 mRNA 被抑制情况分析 图， 其中， A 为电泳检测 FoxO3a 的 mRNA 表达。
18、 ； B 为 FoxO3a-shRNA-2296 抑制 FoxO3a 的 mRNA 表达的统计分析。 0034 图 5 是利用 Western blotting 技术检测大鼠心脏微血管内皮细胞导入重组质粒 后 FoxO3a 下游靶基因 p27 的表达分析图， 其中， A 为本发明所述的 shRNA 对 p27 蛋白表达 抑制的 Western Blotting 分析 ； B 为 FoxO3a-shRNA-2296 抑制 p27 蛋白表达的统计分析。 具体实施方式 0035 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述， 但本发明的实施方式不限 于此。 0036 实施例 1shRNA 序列的设。
19、计与合成 0037 (1) 通 过 GeneBank 数 据 库 (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) 查 询 大 鼠 FoxO3a 基因的 mRNA 信息， 根据 shRNA 设计原则， 设计了 4 条针对大鼠 FoxO3a 基因的 FoxO3a-shRNA 序列， 并将上述设计完成的 shRNA 序列送生工生物 ( 上海 ) 有限公司合成。 其中 4 条 shRNA 分别为靶向大鼠 FoxO3a 基因 (NM_001106395.1) 的 1012 位点、 1765 位点、 1903 位点及 2296 位点， 长为 21 个碱基 ( 图 1)。 0038。
20、 其中， 本发明所涉及的 FoxO3a-shRNA-1012 的作用位点序列为 ： 5-GCA AGA GCT CTT GGT GGA TCA-3 ； FoxO3a-shRNA-1765的作用位点序列为 ： 5 -GCC ACA GCG ATG TCA TGA TGA-3 ； FoxO3a-shRNA-1903 的作用位点序列为 ： 5-GGA GTT TGG TCA ATC AGA ACT-3 ； FoxO3a-shRNA-2296 的作用位点序列为 ： 5-GGA ACT TCA CTG GTG CTA AGC-3 。 0039 根据上述 4 中 shRNA 的作用位点序列设计合成相应的 。
21、shRNA 的正义与反义链 DNA 序列 ： 0040 FoxO3a-shRNA-1012 正义链 ： 0041 5 -GATCC TTTTTTG-3 ； 0042 FoxO3a-shRNA-1012 反义链 ： 0043 3 -G AAAAACTTAA-5 ； 0044 FoxO3a-shRNA-1765 正义链 ： 0045 5 -GATCC TTTTTTG-3 ； 说 明 书 CN 103952410 B 5 4/6 页 6 0046 FoxO3a-shRNA-1765 反义链 ： 0047 3 -G AAAAACTTAA-5 ； 0048 FoxO3a-shRNA-1903 正义链 ：。
22、 0049 5 -GATCC TTTTTTG-3 ； 0050 FoxO3a-shRNA-1903 反义链 ： 0051 3 -G AAAAACTTAA-5 ； 0052 FoxO3a-shRNA-2296 正义链 ： 0053 5 -GATCC TTTTTTG-3 ； 0054 FoxO3a-shRNA-2296 反义链 ： 0055 3 -G AAAAACTTAA-5 ； 0056 上述正义链模板的 5 端添加了 GATCC， 与 BamH I 酶切后形成的粘端互补 ； 反义链 模板的 5 端添加了 AATTC， 与 EcoR I 酶切后形成的粘端互补。 0057 (2) 将等量的正义链 。
23、(100M， 5L) 和反义链 (100M， 5L)DNA 混合， 加入 5 倍 的 Annealing Buffer for DNA Oligos(10L,Beyotime)， 然后用去离子水补充到 50L。 在 PCR 仪上按照如下程序进行退火处理 ： 95 5min， 然后以每 8 秒下降 0.1的速率降至 25进行退火， 最后4保存备用。 将退火后所得shRNA模板溶液稀释50倍， 使其终浓度为 200nM， 用于连接反应。 0058 (3)将pGLV3载体(吉玛基因股份有限公司)用BamH I和EcoR I双酶切， 进行载体 的线性化处理， 酶切条件如下所述 ： 将 pGLV3 载体。
24、 (10g)、 BamH I 内切酶 (5L， TOYOBO)、 EcoR I 内切酶 (5L， TOYOBO)、 H buffer(80L， TOYOBO) 混匀， 置于 37反应 1 小时， 用 凝胶回试剂盒 (Qiagen) 回收线性载体片段， 将其浓度稀释至 50ng/L。 0059 (4) 将线性化的 pGLV3 载体 1L、 经退火处理的 shRNA 模版 1L、 T4DNA 连接酶 (Fermentas)1L、 10T4 连接缓冲液 (Fermentas)2L、 去离子水 15L 混匀， 于 22连 接 1 小时。取连接产物 2L 转化大肠杆菌 Top10 感受态细胞 (TIAN。
25、GEN)， 在含有 100g/ mL 氨苄青霉素的 LB 平板上于 30培养过夜。挑选长出的单克隆在含有 100g/mL 氨苄青 说 明 书 CN 103952410 B 6 5/6 页 7 霉素的LB液体培养基中于30培养过夜， 用质粒抽提试剂盒(Qiagen)纯化质粒， 经测序验 证后大量制备重组质粒 pGLV3-FoxO3a-shRNA。 0060 (5) 将重组载体 pGLV3-FoxO3a-shRNA 与包装载体 pGag/Pol、 pRev、 pVSV-G( 吉玛 基因股份有限公司)一起倒入293T细胞(ATCC， 美国)， 收集培养上清， 获得含有目的shRNA 的病毒颗粒。 0。
26、061 实施例 2 重组慢病毒载体感染原代大鼠心脏微血管内皮细胞的效率 0062 将表达上述 4 种 shRNA 的慢病毒颗粒转染 SD 大鼠 ( 购买于广东省医学实 验 动 物 中 心 ) 心 脏 微 血 管 内 皮 细 胞 (Cao L,Zhang L,Chen S,Yuan Z,Liu S,Shen X,Zheng X,Qi X,Lee KK,Chan JY,Cai D.BDNF-mediated migration of cardiac microvascular endothelial cells is impaired during ageing.J Cell Mol Med,20。
27、12,16(12):3105-15)， 利用荧光显微镜技术检测不同 shRNA 的感染效率。 0063 (1) 实 验 分 组 ：实 验 分 为 空 白 对 照 组、 FoxO3a-shRNA-1012 感 染 组、 FoxO3a-shRNA-1765 感染组、 FoxO3a-shRNA-1903 感染组、 FoxO3a-shRNA-2296 感染组等共 5 组， 所有组别的细胞数量及培养条件一致 ； 0064 (2) 具体感染方法 ： 将 1105个细胞与 510 6TU 病毒颗粒混合于 500L 的 EGM-2(LONZA) 完全培养基中 ( 内含 5的 FBS+ 双抗 +5g/mL 的 。
28、polybrene)， 并接种于 24 孔板， 于37的培养箱中培养12小时， 去除原有培养基， 并加入新鲜的EGM-2完全培养基继 续培养 ； 0065 (3) 荧光显微镜检测 ： 细胞感染 72 小时后进行荧光显微镜观察并进行拍照。结果 表明， 与对照组相比， 所设计合成的4种shRNA慢病毒载体均能有效感染原代的大鼠心脏微 血管内皮细胞， 感染率均在 80以上， 其中 FoxO3a-shRNA-2296 的感染效率最高， 感染效率 依次为 ： FoxO3a-shRNA-2296FoxO3a-shRNA-1012FoxO3a-shRNA-1765FoxO3a-shRNA-190 3( 图 。
29、2)。 0066 实施例 3 重组慢病毒载体对大鼠心脏微血管内皮细胞中内源性 FoxO3a 蛋白表达 的抑制作用 0067 利用 Western blooting 技术检测 4 种 shRNA 对大鼠心脏微血管内皮细胞内源性 FoxO3a 蛋白表达水平的影响。 0068 (1) 实 验 分 组 ：实 验 分 为 空 白 对 照 组、 FoxO3a-shRNA-1012 感 染 组、 FoxO3a-shRNA-1765 感染组、 FoxO3a-shRNA-1903 感染组、 FoxO3a-shRNA-2296 感染组等共 5 组。所有组别的细胞数量及培养条件一致， 感染组均用同样的病毒量 (MO。
30、I 50) 进行处 理。 0069 (2)Western blooting 检测 ： 细胞感染 72 小时后， 利用蛋白质裂解液 ( 碧云天 ) 提取总蛋白质， 利用 Bio-Rad 公司生产的蛋白质浓度测定试剂测定其蛋白浓度。具体实验 方法请参照文献 (Xu-Feng Qi,Dong-Heui Kim,Yang-Suk Yoon,Jian-Hong Li,Soon-Bong Song,Dan Jin,Xue-Zhu Huang,Yung-Chien Teng,Kyu-Jae Lee.The adenylyl cyclase-cAMP system suppresses TARC/CCL17a。
31、nd MDC/CCL22production through p38MAPK and NF-B in HaCaT keratinocytes.Mol Immunol,2009,46(10):1925-1934.) 执 行， 使 用 anti-FoxO3a 抗 体 (Cell Signaling Technology) 及 -actin 抗 体 (Cell Signaling Technology) 进行检测， 并用 IPP 软件对蛋白条带进行灰度分析。结果表明， 说 明 书 CN 103952410 B 7 6/6 页 8 FoxO3a-shRNA-1012及FoxO3a-shRNA-2296。
32、均对内源性大鼠FoxO3a基因的表达具有较强的 抑制作用， FoxO3a-shRNA-2296 的抑制效率最高， 达 99 ； FoxO3a-shRNA-1012 的抑制效率 也达到 97 ； FoxO3a-shRNA-1765 的抑制效率达到 80， 而 FoxO3a-shRNA-1903 几乎没有 任何抑制效果 ( 图 3)。 0070 实施例 4FoxO3a-shRNA-2296 对大鼠心脏微血管内皮细胞 FoxO3a 基因 mRNA 表达 的影响 0071 利用 FoxO3a-shRNA-2296 对 SD 大鼠 ( 购买于广东省医学实验动物中心 ) 心脏微 血管内皮细胞(Cao L,。
33、Zhang L,Chen S,Yuan Z,Liu S,Shen X,Zheng X,Qi X,Lee KK,Chan JY,Cai D.BDNF-mediated migration of cardiac microvascular endothelial cells is impaired during ageing.J Cell Mol Med,2012,16(12):3105-15) 进行感染 (MOI 50)， 48 小时后收集总 RNA 样品。以未进行任何处理的细胞作为空白对照。通过 RT-PCR 技 术检测了大鼠心脏微血管内皮细胞中 FoxO3a 的 mRNA 表达情况。具体实验。
34、方法为 ： 用 TRI reagent(Molecular Research Center Inc.,Cincinnati,USA) 提取细胞的总 RNA， 用 A260 与A280检测其质量， 用Prime RT Premix kit(GeNet Bio,Chungnam,Korea)合成cDNA。 所 用 RT-PCR 引物序列为 ： 0072 FoxO3a 上游引物 ： 5 -TCG CGC ACC AAT TCC AAC-3 ； 0073 FoxO3a 下游引物 ： 5 -TCG CTG TGG CTG AGT GAG TC-3 ； 0074 -actin 上游引物 ： 5 -GCA 。
35、CCA CAC CTT CTA CAA TGA G-3 ； 0075 -actin 下游引物 ： 5 -TTG GCA TAG AGG TCT TTA CGG A-3 ； 0076 PCR 反应用 Prime Taq Premix kit(GeNet Bio,Chungnam,Korea) 试剂盒完成， 反 应程序为 ： 94预变性 5 分钟 ； 94变性 30 秒、 56 65退火 30 秒、 72延伸 30 秒， 30 个 循环 ； 72延伸 7 分钟。PCR 产物用质量百分比 2的琼脂糖凝胶进行电泳并拍照。结果表 明， 大鼠心脏微血管内皮细胞中存在 FoxO3a 基因的内源性表达， 而 。
36、FoxO3a-shRNA-2296 感 染可有效抑制 FoxO3a 基因的 mRNA 表达水平， 说明本发明所述 shRNA 可在 mRNA 水平上有效 抑制靶基因 FoxO3a 的表达 ( 图 4)。 0077 实施例5FoxO3a-shRNA-2296感染对大鼠心脏微血管内皮细胞中FoxO3a下游靶基 因 p27 表达的影响 0078 p27蛋白是转录因子FoxO3a下游的经典靶基因之一， FoxO3a的活性升高可导致其 靶基因 p27 的表达升高、 活性增强。为进一步验证本发明所述 shRNA 对 FoxO3a 基因的靶向 抑制作用， 同时利用Western blooting技术检测了F。
37、oxO3a-shRNA-2296感染对大鼠心脏微 血管内皮细胞中p27蛋白表达的影响。 所用p27及-actin抗体均购置于Cell Signaling 公司。 Western blooting技术的具体实验方法参照实施例3。 结果表明， FoxO3a-shRNA-2296 感染可有效抑制 FoxO3a 下游靶基因 p27 蛋白的表达水平 ( 图 5)。 0079 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103952410 B 8 1/3 页 9 0001 序 列 表 CN 103952410 B 9 2/3 页 10 0002 0003 序 列 表 CN 103952410 B 10 3/3 页 11 序 列 表 CN 103952410 B 11 1/4 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 103952410 B 12 2/4 页 13 图 2 说 明 书 附 图 CN 103952410 B 13 3/4 页 14 图 3 说 明 书 附 图 CN 103952410 B 14 4/4 页 15 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103952410 B 15 。