贮存昆虫致病性线虫的方法和装置 本发明涉及为了转运或将来的应用而贮存昆虫致病性线虫。更具体地说，它涉及在受控的水活度下制备用于贮存的属于下列属的线虫的第三阶段感染性幼体(J3)的方法及其贮存方法：Steinernema属[异名：新生小纹线虫(Neoaplectana)]和异杆线虫(Heterorhabditis)属[异名：染色线(Chromonema)]。
人们熟知，Steinernematidae和异杆线虫科(Heterorhabditidae)中的昆虫致病性线虫对于一些虫害的生物控制具有相当大的潜能。线虫地感染性第三阶段幼体(J3)(它们能在环境中不进食而存活很多周)能找到昆虫，进入昆虫的血腔并在血腔中释放特异性共生细菌[致病杆菌属(Xenorhabdus)或光杆状菌属(Photorhabdus)的种]。该细菌在一天左右就杀死昆虫并为线虫繁殖提供合适的条件。
国际专利申请No.PCT/AU93/00465(以WlPO公开号WO94/05150公开)的说明书，包含以前采用的方法的全面归纳以及当时在贮存J3昆虫致病性线虫方面的最近工作细节，包括关于制备较长期贮存J3线虫的有效技术的描述。该技术包括：将洁净的J3昆虫致病性线虫的水提浓物与基本无水的高吸水性物质的颗粒一起混合，混合物中水提浓物与吸水性物质的比率使得：(a)吸水性颗粒从提浓物吸收足够的水而引起线虫的隐生现象，以及(b)平衡后的混合物水活度在0.80～0.995范围内。WlPO公开号WO94/05150还描述了在选定的水活度值下贮存隐生的J3线虫的适当方案。
本发明的第一方面是对迄今制备贮存用J3昆虫致病性线虫的优选方法(如WlPO公开号WO94/05150中描述的那样)的改进，即，选定所述方法中应用的吸水性物质而引起J3线虫的隐生现象，并且携带呈引起的隐生状态的J3昆虫致病性线虫。
在WlPO公开号WO94/05150中，指出了聚丙烯酰胺凝胶颗粒、或者淀粉聚丙烯酰胺凝胶颗粒(任选还存在聚丙烯酰胺凝胶颗粒)、或者甲基纤维素粉末可被用作介质，既用来引起线虫隐生状态，又用来在后续的贮存过程中保持选定的水活度。那些吸水性物质作为贮存基质比以前用于这方面的硅镁土好得多。有一篇文献(很早以前)记录了应用呈滤纸形式的纤维素作为介质，在它上面可贮存J3昆虫致病性线虫。该公开是J.F.Howell的论文，标题为“寄生性线虫线虫(Neoaplectana carpocapsae)’的新贮存方法和改良的捕集方法”，发表于无脊椎动物病理学杂志(Journal of Invertebrate Pathology)，第33卷，155～158页，1979。Howell将他的J3线虫放在冷环境中的滤纸上，所以保证它们确实进入与隐生现象类似的保护状态。但是，没有控制水活度，所以，如果在更高温度下贮存，J3线虫就不可能存活。此外，在滤纸上贮存线虫不是商用办法。如果线虫在贮存期间存活，它们就难于分散在野外。即使将滤纸裁成小片，滤纸中的纤维状纤维素也堵塞喷嘴。估计若要分散线虫，应通过下列方法使它们形成可喷洒的水悬浮液：(ⅰ)将含贮存的线虫的滤纸浸入水中直至线虫活动而离开滤纸，然后(ⅱ)从这样获得的线虫的稀悬浮液中除去滤纸，以及(ⅲ)任选在使线虫沉降后通过倾析浓缩悬浮液，或者应用细棉布收集线虫，从而形成J3线虫的可喷洒悬浮液。
本发明人发现了，非纤维状纤维素小颗粒[即，尺寸小于300微米(300μm)、优选小于200微米、更优选小于约100微米、最优选小于50微米的颗粒]可被用作J3昆虫致病性线虫的贮存介质，而且，当悬浮于水中时，J3线虫和这种粒状纤维素的混合物是可喷洒的。此外，还发现了，通过应用WIPO公开号WO94/05150中描述的方法，用该粒状非纤维状纤维素材料代替所述方法中的高吸水性物质，可以有效地长时间贮存J3昆虫致病性线虫。另外，发现了可简单地通过下列方法使以这种方式贮存(优选添加抗真菌剂)的J3线虫分布到野外，即，将贮存的线虫混合物(呈隐生状态)加到洁净的水中，等待5分钟到1小时使线虫达到它们的全活性水平，然后喷洒线虫和粒状纤维素的悬浮液。
简单地说，本发明的第一方面是WIPO公开号WO94/05150中描述的方法的改进形式，其中，将小直径粒状非纤维状纤维素用作所述方法的高吸水性物质。
所以，本发明的第一方面提供了一种制备贮存用昆虫致病性线虫的第三阶段感染性幼体(J3)的方法，该方法包括：将洁净的J3昆虫致病性线虫的水提浓物与基本无水的非纤维状纤维素小颗粒(该颗粒具有小于300μm的平均最大尺寸)一起混合，混合物中水提浓物与粒状纤维素的比率使得：(a)纤维素颗粒从提浓物吸收足够的水而引起线虫的隐生现象，以及(b)平衡后的混合物水活度在0.80～0.995范围内。
如上所述，所述纤维素颗粒优选的最大尺寸小于200微米，更优选小于100微米。最优选所述纤维素颗粒直径小于50微米。一种特别适用的非纤维状纤维素形式是B0-2级纤维素，可得自德国的Cellulose-Füllstoff-Fabrik GmbH & Co KG,Mnchengladbach，通常被称为“CFF”，商标为TECHNOSEL 40。据信，B0-2级纤维素是通过研磨已被处理而除去了木质素和其它杂质的纤维素浆生产的。它包含的纤维素颗粒一般具有平均最大尺寸约32微米(32μm)的长方形截面。
优选地，J3线虫、粒状纤维素和水的平衡混合物的水活度在0.92～0.995的范围内；更优选地，所述平衡混合物的水活度在0.95～0.99的范围内。
优选地，J3线虫、非纤维状纤维素颗粒和水的混合物中包含一种抗真菌剂。
现在将仅仅通过实施例描述本发明第一方面的实施方案。本发明实施方案的描述
在本发明人为了证实本发明的效果而进行的一系列试验中，应用R A Bedding,M S Stanfield和G W Crompton在国际专利申请No.PCT/AU91/00136(WIPO公开号WO91/15569)的说明书中描述的方法培养和提取第三阶段幼态昆虫致病性线虫样品。不过，要实施本发明，也可在昆虫体内或液体培养中培养线虫，条件是该线虫：(a)不含明显量的、来自培养基的外来物质，以及(b)相对地没有除J3之外的线虫阶段(优选不存在成体线虫，当然，成虫应当不超过线虫的2％)。
本发明人为了试验而按国际专利申请No.PCT/AU88/00127的说明书中描述的方法培养的昆虫致病性线虫，在洗涤后沉降，排出过量的水。然后，从沉降槽将线虫沉积物泵送到用布(水能透过它，但线虫不能透过)作衬里的筛中。按这种方式排出水，并且在排放时通过搅拌线虫乳状物而进一步除去水。在一些试验中，在挤出某些残余水之前，通过集拢布边缘将线虫物质围在布中央而进一步除去水。形成的线虫乳状物每克含0.5～3.5百万个J3线虫，这取决于涉及的种和线虫中残余的水量。在一些试验中，当线虫还在槽中时，添加不同的抗真菌剂之一而与沉降的线虫混合。于是，在除去很多表面水之后(这样也除去大部分抗生素和/或抗真菌剂)，在引起隐生过程中一些抗真菌剂仍被纤维素颗粒吸附。本发明人应用的抗真菌剂是氯氧化铜和以下列商标购买的那些：Amistar(氧化偶氮毒杀宾(azoxystrobin)的一个牌号)、苯菌灵(Benlate)、Tecta和Proxel(这些杀真菌剂中的某些还具有杀细菌特性)。
应懂得，可应用除上述那些以外的培养J3线虫的方法，而且列出的杀真菌剂并不是穷举的、而是代表本发明人应用的抗真菌剂。
通常适合将线虫与吸收性物质结合的方法如下：称量纤维素颗粒，添加到适当重量的线虫中(适当重量是通过以前的试验方法确定的，以查明什么样的组合处于要求的水活度范围内)。接着，立即搅拌和混合纤维素颗粒和线虫以致纤维素颗粒均匀地分散在混合物中。
线虫和纤维素颗粒的混合物的水活度应在0.80～0.995的范围内。如上所述，水活度优选在0.92～0.995的范围内，最优选在0.95～0.99的范围内。
要求的混合物水活度是迅速达到的，但不是立即达到的。纤维素颗粒瞬时吸收线虫乳状物的游离表面水，然后吸收从线虫内部释放的水。所以，当游离表面水首先被吸收后，J3线虫、纤维素颗粒和水的混合物的水活度低于它的最终值，该最终值是在一小时或两小时内达到的。
在将线虫乳状物与一定量无水纤维素颗粒一起混合后，本发明人采用的常规方法是在15～23℃范围内的温度下、在允许通气但减少蒸发的条件下将混合物放置过夜。这通常是通过将混合物保存在加盖的容器中实现的。在此过夜的贮存期后，将纤维素颗粒(现在被水溶涨了)与线虫的混合物的样品放入各种贮存容器中，对每个容器都保证容器内部和外部之间的气体交换(同时使水损耗减至最少)，以致容器中不产生厌氧条件。
现在，本发明的价值是能长期贮存J3线虫。为了测试该贮存期，将包含处于隐生阶段的J3线虫的平衡混合物样品置于各种容器中。这些容器中的一些具有机械通风结构(例如，容器内的一系列孔)。其它容器则配备了膜，或者配有壁板，其材料能透过空气。
不过，结合本发明开发了新型贮存容器，而那些(优选的)新型贮存容器则构成本发明的第二方面，下文将描述该方面。
在一些试验中，将容纳了线虫、水和非纤维状纤维素颗粒的平衡混合物样品之后的容器立即在试验的长期贮存温度下贮存。在其它试验中，首先将容器在15℃下贮存三天，然后在长期贮存温度下贮存。在所有试验中，长期贮存是以这种方式进行的，即，使纤维素/线虫组合物的水活度保持在0.80～0.99的范围内。
在这些试验的早期注意到，如果贮存的J3线虫受真菌感染，贮存期就显著缩短。为了防止真菌感染，在很多试验样品中包含了杀真菌剂。在上述杀真菌剂中，氧化偶氮毒杀宾是优选的，优选与Proxel(商标)组合。
本发明一个特别严格的试验是在23℃下贮存隐生线虫。通常，难于在此温度下将J3线虫贮存2～3周以上。应用本发明，达到了J3线虫的下列贮存时间：
Steinernema glaseri -2～5个月
Steinernema feltiae -4～5个月
Steinernema carpocapsae -约8个月
Steinernema scapterisci -约9个月
试验的全部异杆线虫的种 -2～3个月。
如上所述，应用本发明方法贮存的隐生J3线虫可通过简单地将贮存的线虫和非纤维状纤维素的混合物加到水中调配而分布在野外。线虫达到它们的全活性水平所需的时间取决于它们呈隐生状态贮存的时间。已被长时间贮存了的线虫可能需要一小时来恢复它们的全活性水平。但是，大多数种的线虫在5～10分钟内就能恢复它们的全活性水平。然后，就可按常规方法喷洒活性J3线虫与它们的贮存介质，因为非纤维状纤维素的小颗粒不堵塞喷嘴。本发明第二方面的公开
本发明第二方面涉及这样的设备：其中，可贮存呈隐生状态的J3昆虫致病性线虫。
为了长期贮存隐生的昆虫致病性J3线虫，必须将贮存环境的水活度保持在大致所需的值，而且必须存在氧(空气)使线虫正常呼吸。允许充分通气导致从贮存环境失去水。随着长期贮存，水的减少降低了贮存环境的水活度。这样又导致J3线虫进一步脱水，结果不利地影响线虫，以及它们随后的死亡。
显然，有利的是在维持水活度的适当值时保存贮存环境中的水，这就是本发明第二方面的目的。
为了实现该目的，本发明第二方面提供了水活度控制附件，该附件被用来装到用于贮存呈隐生状态的J3昆虫致病性线虫的容器的孔上。
在一种形式中，该附件包括大致刚性的管，该管：
(a)适合以气密方式装入容器的孔内或装在容器的孔上，以致管的一端处于容器内；以及
(b)它的另一端位于一个腔室内，该腔室中具有至少一个小孔，它将腔室的内部与外界空气连通。
当用于提供水活度控制时，所述管将盛装一种透气性物质(例如棉绒)堵塞物，而且所述腔室将盛装吸水性物质，该物质已被水饱和，或者被饱和盐溶液饱和(如果贮存容器中要求特定的水活度)。例如，如果要产生0.97的水活度，所述吸水性物质可以包含硫酸钾的饱和溶液。
设计了关于这种新型水活度控制附件的改进形式，用来装配在用于贮存呈隐生状态的J3线虫的宽颈罐的颈内，并被所述宽颈罐的颈支承。这种水活度控制附件的改进形式包括：
(a)一个适合装入宽颈罐的颈部内的环形腔室，该环形腔室的外径稍微小于宽颈罐的颈的内径；所述腔室的顶部敞开，而它的底部则封闭，于是，环形腔室的中心部分形成与所述腔室的颈共轴的管；
(b)从所述腔室的顶部周边水平向外延伸的凸缘，所述凸缘的尺寸应这样，即，当将所述腔室放入所述颈时，所述凸缘适合被所述颈的上表面支承；以及
(c)适合装在所述颈上的帽盖，所述帽盖内具有至少一个小孔。
当应用这种形式的附件时，将透气性物质堵塞物插入位于所述腔室中央的管内，并将已被水或浓盐溶液饱和的吸水性物质置于环形腔室内。
还设计了另一种形式的水活度控制附件，所述附件用在被用于贮存呈隐生状态的J3昆虫致病性线虫的容器上。本发明第二方面的该第三种形式提供了一种用在容器(该容器在其壁内(或一个壁内)具有至少一个孔)上的水活度控制附件，所述附件包括一个具有正面和背面的塑料囊，至少在靠近背面的边缘的背面区涂一层粘合剂；背面内具有至少一个孔；而且所述囊的正面在其上部区内具有至少一个小孔。
当应用这种附件来控制贮存于容器中的隐生J3昆虫致病性线虫的水活度时，利用粘合剂层将所述囊粘合在容器壁上，该壁的内部具有至少一个孔，使囊背面的那个孔(或数个孔)至少部分地覆盖容器壁的那个孔(或数个孔)。此外，囊内将盛装已被水或饱和盐溶液饱和的吸水性物质，还可包含至少一个柔性间隔部件以保障囊的正面与背面彼此分离，而且囊正面内的孔不覆盖囊背面的孔。
现在将通过仅仅举例的方式参照附图描述这些形式的水活度控制附件的实施方案。
对附图的简要描述
图1是用于贮存隐生的J3线虫、装备了第一种形式的水活度控制附件实施方案的容器部分示意剖视图。
图2也是以部分示意剖视图形式描绘了用于贮存J3昆虫致病性线虫的容器，该容器包括图1中描绘的改进形式的水活度控制附件。
图3是将贮存隐生的J3线虫及其支持介质的容器示意剖视图，装有第三种形式的新型水活度控制附件的实施方案。
在附图的图1中描述的实施方案中，容器10(在它的上表面中具有一个大孔11)被螺旋帽12封盖。本发明的水活度控制附件的管13被封进孔里，该孔已穿过螺旋帽12。如果容器10的孔11通常被橡胶塞封盖，管13就应该气密性地装配入穿过橡胶塞的孔。
管13的下端在容器10内。管13的上端延伸入(并且被封入)圆柱形腔室14，它的上壁包括螺旋帽15。螺旋帽15包含一些通气孔16。如果螺旋帽15被合适的盖代替(如果腔室14不是圆柱形，情况总是这样)，该盖将备有气孔(通气孔)16。
腔室14盛有水饱和的聚丙烯酰胺凝胶颗粒18(或另一种合适的吸水性物质的颗粒)，颗粒18环绕腔室14中的管13部分的下部，是为了保持腔室14内空气中的水活度为1.00。如果应用饱和盐溶液来使聚丙烯酰胺凝胶颗粒饱和，将形成不同的所需水活度并且在腔室14中保持该水活度和(通过空气沿着管13的传递)在容器10中保持该水活度。
虽然应用饱和盐溶液能使腔室14中和容器10中形成选定的水活度，但本发明人发现了，如果容器10中的水活度保持在1.00而不是理想值(例如0.96)，检测不出任何种的昆虫致病性线虫最长贮存期的变化。我们认为这个观察结果表明，呈隐生状态与水和吸水性介质(优选是非纤维状纤维素颗粒)贮存的J3昆虫致病性线虫的样品29中的水活度变化很小，除非样品中的水活度和周围空气中的水活度之间存在显著差异。
管13含有棉绒堵塞物17或允许空气传递进出容器10的其它合适的物质，但该物质防止微生物和小虫子、尘粒和其它粒状污染物进入容器10。
可改变附图1中描绘的构造而适合个别贮存容器。例如，如果贮存容器具有侧孔而不是顶孔，管13的下部(即，低于腔室14的底层的管13部分)就应该更长而且应该弯曲以便管能大体上水平地进入容器10，使腔室14履行它作为非溢出水储器的常规功能。
图2描绘了水活度控制设备的一种改进形式。在该图中，将J3昆虫致病性线虫的样品29贮存在容器20中。容器20具有宽颈21，它被盖或帽15封闭。可将帽15旋到颈21上或者可将它卡接在颈21上。如在图1中描绘的实施方案中那样，图2中的帽15也配有一些通气孔16。一个环形腔室24被支承在容器20的颈部区内。
环形腔室24具有大体垂直的外侧壁25和大体垂直的内侧壁26。侧壁25的外径稍微小于颈21的内径。壁25和26通过圆形壁板部分27被连接。腔室24的顶部敞开，内侧壁26构成管23，它含有透气性堵塞物17。凸缘22从侧壁25的顶部向外水平延伸至一定的距离，以致：(a)凸缘22覆盖颈21的顶表面，以及(b)凸缘22的外径小于帽15的侧壁内径。环形腔室24盛有被水(或者任选被饱和盐溶液)饱和的吸水性物质18(例如聚丙烯酰胺凝胶颗粒)从而将腔室24上部空气的水活度(于是将容器20中的水活度)保持在1.00的值，或者通过应用盐溶液确定的值。
容器24可通过模制或压制从任意合适的材料形成。
图3中描述的贮存构造包括容器30，具有气密性帽或盖15。容器30中盛有处于所需水活度的隐生J3线虫及其支持介质的样品29。容器30的侧壁中(或者在它的侧壁之一中，如果容器30的水平截面是长方形的话)具有一些孔31。
具有正面33和背面34的塑料囊32包含：(a)被水或饱和盐溶液饱和的聚丙烯酰胺凝胶颗粒或淀粉聚丙烯酰胺凝胶颗粒18；以及(b)柔性间隔部件35。间隔部件35(它可以就便是一条以商标“SC0TCHBRITE”购买的材料)保障在贮存期间囊的正面和背面彼此不接触。背面34被涂布了-至少在靠近背面边缘的部位-能使背面粘到容器30上的粘合剂物质。如图3中所示，囊的背面34中的孔36大体上与容器30中的孔31重合(也就是说，至少部分地重叠)。囊的正面33中具有很多小孔37，它们允许空气进入囊和穿过孔36和31，而且在保持容器30中的水活度为1.00(或饱和盐溶液产生的值)时为线虫提供氧。
本领域技术人员显而易见的是，构成本发明两个方面的上述方法和各种形式的装置只是为了阐述本发明的那些方面，所以，可对所描述的和描绘的实施方案进行改变和修饰而不背离本发明的构思。