可光切除的生物素化试剂、其合成方法及应用 本发明涉及一种可光切除的生物素化试剂及其合成方法和用途。具体地讲，本发明涉及一种包含光敏感部分和可检测的生物素部分的生物素化试剂及其合成方法和用途。
链球菌抗生物素蛋白-生物素技术广泛应用于生物技术、分子生物学、医学、物理学、化学等领域。这些用途主要是由于生物素能够强烈地同四聚体抗生物素蛋白(存在于鸡、鸟、爬行类动物、两栖类动物中)或链球菌抗生物素蛋白(来源于细菌streptomyce)结合。典型的例子是，生物素或生物素衍生物首先结合到靶分子上(如蛋白或核酸)，然后利用生物素和含链球菌抗生物素蛋白的亲合性介质(如磁珠或琼脂糖微珠)实现靶分子的分离。或者，通过偶联有特殊酶的链球菌抗生物素蛋白(如辣根过氧化物(HRP，horseradish peroxidase)，对生色反应其有催化作用)和生物素之间的相互作用而实现靶分子的检测。
目前，虽然链球菌抗生物素蛋白-生物素技术的应用不断增长，但对于一些应用而言，这种技术仍存在某些重要不足。这些不足主要产生于链球菌抗生物素蛋白和生物素之间的强的亲合力。这是因为，通过链球菌抗生物素蛋白-生物素技术分离靶分子或细胞之后，靶分子和细胞的释放需要破坏这种亲合作用。但是，这种链球菌抗生物素蛋白-生物素复合体的分离需要较剧烈的反应条件(6-8M盐酸胍溶液，pH＝1.5)，这种反应条件通常引起蛋白变性，生物活性分子失活和细胞死亡。例如，包含N-羟基琥珀酰亚胺酯基团的生物素衍生物经常用于含氨基的蛋白和核酸的连接。切割生物素和蛋白或核酸之间的酰胺键往往影响生物分子内的某些弱化学键。通过结合生物素化的抗体和细胞表面的特异抗原可以将特殊细胞从多细胞中分离。但是，抗体-抗原之间的作用力则需要将细胞处于较低pH条件或机械搅动，这些条件对细胞地成活是不利的。总之，利用现有方法实现靶组分以不变的形式回收是非常困难的。
最初，有人提出利用蛋白酶K吸收法去除链球菌抗生物素蛋白(M.Wilchek和E.A.Bayer，Anal.Biochem.，171：1，1998)。该法的一个缺点是蛋白酶K也吸收部分蛋白质，并且不能够完全去除链球菌抗生物素蛋白。此外，生物素化的DNA影响随后的一些应用(如用于遗传病检测的杂交类分析)。
生物素-链球菌抗生物素蛋白技术存在的另一个问题是内源生物素的存在，这将导致非靶分子的分离和检测，这对于精确而灵敏的检测分析而言是一个非常严重的问题。
为了从被附着的分子上去掉生物素部分，有机化学家们合成了几种化学法可切除的生物素衍生物。免疫纯(immunopure)NHS-SS-生物素(Pierce Chemical；Rockford III)就是最常用的试剂之一，该试剂通过-S-S-将生物素和N-羟基琥珀酰亚胺酯基团连结起来。NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)基团的使用可以使NHS-S-S-生物素在温和的条件下和蛋白质偶联，然后再通过用硫醇类化合物切割-S-S-键，去除生物素部分。这种方法有时也受到限制，因为硫醇类化合物也可以切割蛋白中的一些-S-S-键。此外，被切割后的分子包含活泼的-SH，它可以同其它分子形成-S-S-。因此包括-SH的底物的官能团活性将被消弱。例如，这样蛋白质的活性将减弱或消失，这样的核酸不再与其互补链杂交，从而在克隆技术上失去用途。
现有生物素链球菌抗生物素蛋白技术的另一个缺陷是难以实现靶分子分离和/或检测的操作自动化，因为靶分子的释放需要额外的化学试剂和仔细地控制反应。
生物素-链球菌抗生物素蛋白技术和PCR技术的结合早已用于特殊序列核酸的分离、检测。然而，插入的生物素部分的去除同样是一个问题，这将不可逆地改变DNA的结构，这样的生物素化也会干扰生物素化探针的应用，同时改变PCR产物的性质。PCR产物中的生物素将在基于抗生物素蛋白的检测系统中产生假信号。生物素插入到DNA中可能干扰链杂交反应。此外，生物素化的PCR产物不适合于克隆技术。生物素化核苷酸插入DNA中引起凝胶分析中迁移的延迟，这种迁移改变使得PCR产物的表征变得困难。因此，现存的生物素-链球菌抗生物素蛋白技术存在严重的不足。
为了去除偶联体中的生物素部分，Fahrenbolz和Rothschild分别报道了两种可光切除生物素活化酯的合成。这两种可光切除的物质都包含生物素部分和活化酯部分，两部分通过光敏基团连接。这两种生物素化试剂的应用在克服传统链球菌抗生物素蛋白——生物素技术的主要缺陷的同时，并不牺牲两者之间相互作用的高亲合性。但是，这两种可光切除生物素活化酯也有各自的缺点，例如，化合物I在使用光切割后，由于隔离臂和光敏基团的光分解产物2-亚硝基苯甲醛依然通过共价键连接在靶分子上，因而不能够以不变的方式释放出靶分子。化合物II要求使用300nm的紫外光分解释放靶分子。一些文献报道波长小于300nm的光照射对一些生物分子是有害的。
目前，有许多方法可用于复杂混合物中底物或靶分子的检测和分离，这些方法大多数要求底物或靶分子进行特殊的标记。这样虽然直观，但这些标记方法存在一些问题，例如，被分离的靶分子不可避免地被污染或纯化。一个典型的例子是利用结合有生物素的细胞经过链球菌抗生物素蛋白-生物素技术分离后，被分离的细胞经常已经死亡，这是由于结合试剂的毒性效应或使用条件剧烈的分离方法。当利用该法从生物样品中分离活性蛋白质时，也存在同样的问题。标记分子的存在通常使蛋白质变性或无活性，或者作为药品已经不可使用。利用某些试剂有时可以克服该问题。可是，分离和去除标记分子需要剧烈的条件，同时费时、费力、费钱，最终导致目标产物产率较低。这些靶物质的生存性能或功能活性也往往被严重削弱或破环。
本发明的目的就是要提供一种能够克服上述缺点的生物素化试剂，该试剂能够在温和的条件下通过共价键偶联到底物上，并通过光照，可以方便且有选择性地切割这些化学键，同时释放出底物。
本发明的另一目的是提供制备上述生物素化试剂的合成方法。
本发明的再一目的是采用上述可光切除的生物素化试剂从复杂混合体系中分离靶组分，通过偶联使该生物素化试剂与底物形成偶联体，再通过光照选择性地切割偶联体内的特殊共价键，释放出底物。
根据本发明，生物素化试剂应当是含有光敏感部分和可检测的生物素部分，该光敏感部分包括反应活性基团，该反应活性基团可以和底物分子的某些官能团形成一个或几个共价键，从而形成可光切除的生物素化试剂的偶联体。这种偶联体中的这些共价键可以选择性地被光分解，即被光切割，释放出底物。本发明的可光切除的生物素化试剂具有如下化学结构：式中，R1可以是H原子、C1-C8烷基、芳香基、芳香烷基、-COOH或-COOR；R2、R3、R4可以是H原子、C1-C8烷基或C1-C8烷氧基；X是与靶分子反应的活性基团，可以是卤素、-OH、-OP、-SH、-SP、-NH2、-NR5R6或-NHP，在此，P是保护基团或活化基团，R5和R6是氢、烷基、取代烷基、芳香基、取代芳香基、芳香烷基、取代芳香烷基、杂环芳香基或取代杂环芳香基；m、n是1-8之间的整数，可以相同，也可以不同，而且-(CH2)m-和-(CH2)n-所表示的烷基既可以是直链的，也可以是支链的；L是-O-，-CO-O-，-S-，-CO-S-，-M1-，-CO-NH-，-NR5-或-CO-NR5-；A是-O-，-S-，-NH-或-NR-；与A相连接的生物素基团也包括生物素衍生物的基团。优选的R2、R3、R4是H原子、C1-C3烷基或C1-C3烷氧基；优选的m、n是1～5之间的整数；优选的X为-OH、-SH或-NH2。
在上述结构中，带有硝基取代基的芳基基团是光敏感部分；通过官能团X，生物素化试剂可与靶分子或底物分子相连，形成偶联体；而上述结构中的生物素部分(参阅附图1)则起标记作用。偶联体在光照下，X与底物分子的结合键被打断，重新释放出底物分子。
光敏感部分和生物素部分是可光切除的生物素化试剂的重要组成部分；隔离臂(或叫摇臂，参阅图1)的存在，可以帮助生物素部分接近链球菌抗生物素蛋白，从而使两者发生有效的相互作用。光敏感部分、隔离臂、生物素的选择取决于可光切除的生物素化试剂所连接的底物包括氨基酸、蛋白质、抗体、核苷酸、DNA或RNA、糖、磷脂或细胞等。流行的光敏基团是2-硝基苯基的衍生基。其原理是，2-硝基苯基的试剂或偶联体内，在邻硝基和苄基H原子之间存在分子内氢键，在合适的光照时，H原子从苄其转移到硝基O原子，随后发生电子重排，这个反应导致酸式(aci)-硝基离子的形成。随后的电子转移和O原子的转移导致2-亚硝基衍生物的形成和靶分子的释放。
进一步地讲，本发明的可光切除的生物素化试剂可以具有如下结构：式中，R1可以是H原子、C1-C8烷基、芳香基、芳香烷基、-COOH或-COOR；R2、R3、R4可以是H原子、C1-C8烷基或C1-C8烷氧基；X是与靶分子反应的活性基团，可以是卤素、-OH、-OP、-SH、-SP、-NH2、-NR5R6或-NHP，在此，P是保护基团或活化基团，R5和R6是氢、烷基、取代烷基、芳香基、取代芳香基、芳香烷基、取代芳香烷基、杂环芳香基或取代杂环芳香基；m、n是1-8之间的整数，可以相同，也可以不同，而且-(CH2)m-和-(CH2)n-所表示的烷基既可以是直链的，也可以是支链的；L是-O-，-CO-O-，-S-，-CO-S-，-M1-，-CO-NH-，-NR5-或-CO-NR5-；A是-O-，-S-，-NH-或-NR-；与A相连接的生物素基团也包括生物素衍生物的基团。优选的R2、R3、R4是H原子、C1-C3烷基或C1-C3烷氧基；优选的m、n是1～5之间的整数；优选的X为-OH、-SH或-NH2。
本发明的可光切除的生物素化试剂还可以具有如下的化学结构：式中，R1可以是H原子、C1-C8烷基、芳香基、芳香烷基、-COOH或-COOR；R2、R3、R4可以是H原子、C1-C8烷基或C1-C8烷氧基；X是与靶分子反应的活性基团，可以是卤素、-OH、-OP、-SH、-SP、-NH2、-NR5R6或-NHP，在此，P是保护基团或活化基团，R5和R6是氢、烷基、取代烷基、芳香基、取代芳香基、芳香烷基、取代芳香烷基、杂环芳香基或取代杂环芳香基；m、n是1-8之间的整数，可以相同，也可以不同，而且-(CH2)m-和-(CH2)n-所表示的烷基既可以是直链的，也可以是支链的；L是-O-，-CO-O-，-S-，-CO-S-，-M1-，-CO-NH-，-NR5-或-CO-NR5-；A是-O-，-S-，-NH-或-NR-；与A相连接的生物素基团也包括生物素衍生物的基团。优选的R2、R3、R4是H原子、C1-C3烷基或C1-C3烷氧基；优选的m、n是1～5之间的整数；优选的X为-OH、-SH或-NH2。
可光切除生物素化试剂的合成包括三个主要步骤(参阅附图2和3)：(1)光敏部分的合成；(2)光敏部分和生物素部分的偶联；(3)苄基上-OH、-NH2、-SH等基团的生成及其活化。
在一个具体实施方案中，合成光敏部分的步骤(1)中可以使用带有烷基和/或烷氧基以及其它官能团如酰基的苯酚衍生物为起始物，在低温下于醋酸酐介质中用硝酸进行硝化反应，在苯环上引入硝基；上述苯酚衍生物在进行硝化反应前，可先用卤代羧酸酯如4-溴代正丁酸甲酯进行处理，一方面保护酚基在硝化反应时不被氧化，另一方面引入生物素化试剂的隔离臂的一部分，同时为其引入的羧基基团为进一步引入隔离臂的其它部分作好了准备。
在步骤(2)中，硝化反应所得的产物可以先与二胺反应，引入隔离臂的其它部分，再与生物素部分进行偶联；也可以先使生物素与二胺反应，所得产物再与上述硝化反应所得产物进行偶联。
在步骤(3)中，用还原剂对步骤(2)所得产物进行还原处理，将苯酚衍生物的苯环上的酰基等官能团还原生成-OH等基团，即进行活化处理。
经过上述合成步骤，就可得到本发明的生物素化试剂。
本发明的可光切除的生物素化试剂的一半是可检测的生物素部分。鸡蛋蛋白抗生物素蛋白和该水溶性维生素即生物素之间的结合是生物学中最强的相互作用之一，其结合常数为1×1015M-1，超过抗体-抗原之间相互作用。在链霉素抗生物素蛋白中发现的链球菌抗生物素蛋白对生物素具有特异性。这种强的相互作用以及生物素可结合于一系列底物的能力，使得这一技术被广泛应用。利用这一技术分离化学、生化和生物材料，通常是基于表面固定有抗生物素蛋白或链霉抗生物素白的固体材料(胶、磁珠、微滴定板)。
有许多化合物可应用于本发明的可光切除生物素化试剂。例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯可用于该试剂中，该基团对伯氨基具有选择性活性，可以和蛋白质中存在的伯氨基反应。当生物分子中的-COOH或磷酸基需要修饰时，含-OH的可光切除生物素化试剂可以与之反应生成酯键，亚磷酰胺形式的可光切除生物素化试剂可以和核酸中的-OH发生反应。这些生物素衍生物可以通过化学反应连接到氨基酸、核苷酸、蛋白质、多肽、核酸(DNA，RNA，PNA)、磷脂、激素和可作为配基和受体的分子中。
通过使用预先生物素化的键合分子可以扩展生物素-链球菌抗生物素蛋白技术在化学和生物材料中的应用。这些键合分子可以和靶分子选择性反应，从而实现靶分子的分离。例如，通过将生物素化的键合复合体键合到包含链球菌抗生物素蛋白的层析柱或磁珠上，可以方便地分离靶分子或细胞。这些键合分子包括抗体(选择性结合特异抗原)、DNA探针(选择性结合特殊序列DNA)、配体(选择性结合特异的受体)。这种方法已经成功地应用于一系列大分子和细胞的分离。但是，这些分离都要求生物素化的靶分子从链球菌抗生物素蛋白上释放下来，破坏生物素-链球菌抗生物素蛋白之间的作用需要一些非生理条件，例如低pH值、高浓度盐酸胍溶液。这些条件对靶分子或细胞是有害的，即使破坏了这种相互作用，靶分子依然是生物素化的。这会影响随后的应用，与此相反，本发明的可光切除生物素化底物可以快速而方便地去除生物素一链球菌抗生物素蛋白部分，而对底物的构形或活性几乎没有影响。
这里所说的靶分子(target molecule)是指利用本发明的试剂和方法被鉴定、表征、分离的物质。底物是指通过共价键结合在发明试剂上的物质。大多数情况下，底物也被称为靶分子。
上述合成的可光切除的生物素化试剂应用之一是将其偶联到底物上，形成具有如下结构的偶联体：式中，R1可以是H原子、C1-C8烷基、芳香基、芳香烷基、-COOH或-COOR；R2、R3、R4可以是H原子、C1-C8烷基或C1-C8烷氧基；X是与靶分子反应的活性基团，可以是卤素、-O-、-S-、-NH-或-NR5-，在此，R5是氢、烷基、取代烷基、芳香基、取代芳香基、芳香烷基、取代芳香烷基、杂环芳香基或取代杂环芳香基；m、n是1-8之间的整数，可以相同，也可以不同，而且-(CH2)m-和-(CH2)n-所表示的烷基既可以是直链的，也可以是支链的；L是-O-，-CO-O-，-S-，-CO-S-，-M1-，-CO-NH-，-NR5-或-CO-NR5-；A是-O-，-S-，-NH-或-NR-；与A相连接的生物素基团也包括生物素衍生物的基团。优选的R2、R3、R4是H原子、C1-C3烷基或C1-C3烷氧基；优选的m、n是1～5之间的整数。适合的底物包括蛋白质、多肽、氨基酸、氨基酸类似物、核酸、核苷、核苷酸、磷脂、囊泡、胶束细胞、病毒、脂肪酸、葡萄糖、多糖、无机分子、金属离子以及它们的组合体。同时，底物也可以是这些物质的衍生物或复合物，例如融合蛋白、蛋白-有机物复合物及金属有机化合物；底物也可以是药物分子、细胞因子、免疫体系调节剂、造血系统制剂、化疗制剂、放射性同位素、抗原、重组蛋白、酶、PCR产物、受体、荷尔蒙、疫苗、半抗原、毒素、抗生素、新生蛋白、细胞、合成药物分子以及它们的组合体。
上述生物素化试剂与靶分子所形成的偶联体的化学结构也可以为：式中，R1可以是H原子、C1-C8烷基、芳香基、芳香烷基、-COOH或-COOR；R2、R3、R4可以是H原子、C1-C8烷基或C1-C8烷氧基；X是与靶分子反应的活性基团，可以是卤素、-O-、-S-、-NH-或-NR5-，在此，R5是氢、烷基、取代烷基、芳香基、取代芳香基、芳香烷基、取代芳香烷基、杂环芳香基或取代杂环芳香基；m、n是1-8之间的整数，可以相同，也可以不同，而且-(CH2)m-和-(CH2)n-所表示的烷基既可以是直链的，也可以是支链的；L是-O-，-CO-O-，-S-，-CO-S-，-M1-，-CO-NH-，-NR5-或-CO-NR5-；A是-O-，-S-，-NH-或-NR-；与A相连接的生物素基团也包括生物素衍生物的基团。优选的R2、R3、R4是H原子、C1-C3烷基或C1-C3烷氧基；优选的m、n是1～5之间的整数。
上述生物素化试剂与靶分子所形成的偶联体的化学结构还可以为：式中，R1可以是H原子、C1-C8烷基、芳香基、芳香烷基、-COOH或-COOR；R2、R3、R4可以是H原子、C1-C8烷基或C1-C8烷氧基；X是与靶分子反应的活性基团，可以是卤素、-O-、-S-、-NH-或-NR5-，在此，R5是氢、烷基、取代烷基、芳香基、取代芳香基、芳香烷基、取代芳香烷基、杂环芳香基或取代杂环芳香基；m、n是1-8之间的整数，可以相同，也可以不同，而且-(CH2)m-和-(CH2)n-所表示的烷基既可以是直链的，也可以是支链的；L是-O-，-CO-O-，-S-，-CO-S-，-M1-，-CO-NH-，-NR5-或-CO-NR5-；A是-O-，-S-，-NH-或-NR-；与A相连接的生物素基团也包括生物素衍生物的基团。优选的R2、R3、R4是H原子、C1-C3烷基或C1-C3烷氧基；优选的m、n是1～5之间的整数。
在上述形成的偶联体中，包含可检测部分和光敏部分的可光切除生物素化试剂通过共价键结合到底物上形成偶联体。所形成的偶联体可以选择性地被切割，释放出底物。这里所说的切割是指使用光的光切割。照射使用的光可以是紫外光(从10.0nm到380nm)、可见光(380nm到750nm)和红光(750-0.12cm)，也可以同时使用多种光。光照可以持续几秒、几分、几小时，也可以是脉冲激光。单位面积光强度是可以改变的，最大光照效率有助于降低光照时间，减少不希望的副效应。
用光切割偶联体切应该不破坏释放出的底物或损伤底物活性。蛋白、核酸及肽、核酸化学中使用的保护基团对于波长340nm的光是非常稳定的。底物释放所需要的光照时间主要取决于光敏基团的化学结构，例如未取代2-硝基苯的光切除生物素化试剂，由于光照时光敏基团副产物的光过滤效应，因此光释放率和底物的回收率都非常低；而对于α-取代的2-硝基衍生物(甲基、苯基取代)，释放底物的产率明显地提高。
本发明的偶联体通过生物素部分可以固定在固相载体上，这些固相载体包括包覆有链球菌抗生物素蛋白的凝胶、玻璃、陶瓷、塑料、磁珠、金属珠或金属表面。
上述可光切除生物素化试剂的另一个具体应用是从复杂混合物中分离靶分子。可光切割生物素化试剂同混合物接触后，同靶分子反应形成偶联体，利用现有技术可以分离出这种偶联体。利用这种方法可以分离、检测的靶分子包括免疫体系调节剂、造血体系制剂、细胞因子、蛋白质、激素、基因产品、抗原、细胞(胎儿细胞、干细胞)、毒素、细菌、膜囊泡、病毒等。检测和分离取决于可光切除生物素化试剂结合底物的能力。例如，核酸可以通过碱基互补配对结合互补的核酸、含核酸的蛋白质或可以同其包含的化学部分反应的化学材料上；蛋白可以结合到对其具有特异性的单克隆抗体、多克隆抗体或抗体片段上、或者可以同蛋白上化学基团发生特异反应的化学材料上。以上所述复杂混合物可以是生物样品，如细胞浓缩物、细胞提取液，包括各种组分的核酸、细胞培养液、初级细胞、磷脂泡。底物也可以是蛋白质、多肽、氨基酸、氨基酸类似物、核苷、核苷酸等等。
本发明的可光切除的生物素化试剂另一个具体应用是可以将底物控制性释放入介质中。例如，可光切除的生物素化试剂和底物反应后形成生物素化的偶联体，该生物素化的偶联体可以结合到包覆有链球菌抗生物素蛋白的颗粒表面，然后放入介质中，通过光照射悬浮液可以控制性地释放底物到介质中。
本发明的可光切除的生物素化试剂再一个应用是分离PCR产物。例如，将可光切除的生物素化试剂联接到寡核苷酸引物上，将修饰的寡核苷酸用作PCR反应的一条引物，进行PCR扩增反应。利用包覆有链霉抗原蛋白的磁珠分离其中的含可光切除生物素化试剂的扩增链，然后，通过光照释放出靶序列。
本发明的另一应用是检测在复杂混合物中的靶分子。偶联体由底物和可光切除生物素化试剂通过共价键偶联形成。这种偶联体同复杂混合体系接触，末偶联的偶联体被去除，偶联的偶联体通过光照释放出可检测的生物素部分，通过检测释放出的生物素部分，就可以检测靶分子的存在。这些靶大分子可以是蛋白质、多肽、核酸、磷脂、多糖、金属有机化合物、病毒、细菌、寄生虫或它们的衍生物，检测之后，靶大分子就可以被分离。
链球菌抗生物素蛋白-生物素技术的一个特殊应用是医学诊断中靶物体的检测。链球菌抗生物素蛋白和生物素化的靶分子或探针之间的相互作用可以被连接在链球菌抗生物素蛋白上的酶增强(该酶能够催化生色反应)。目前，从商业来源可以得到的这种酶有菜过氧化酶、β-牛乳糖酶、葡萄糖氧化酶和碱性磷酸酶，这些酶都可以催化一种生色反应。其它的检测方法包括偶联链球菌抗生物素蛋白到具有荧光、化学发光、放射性或富电子密度的分子上。
总之，本发明通过引入可光切除生物素化试剂而克服了靶分子被污染或者失活或者功能活性被破坏等问题。本发明的试剂包括可检测生物素部分和光敏部分，底物可以通过与氨基、羟基、咪唑基、酯基、羧基、醛基和硫醇基形成的共价键偶联到该试剂上，形成偶联体。通过可检测部分生物素的存在，这些偶联体可以被快速检测和分离。此外，这些偶联体还可以选择性地被光切割，这为分离提供了方便，该法不需要复杂的技术和专门人员，对于不同的靶分子也不需要额外的条件和方法，通过光照释放出的底物具有功能活性，结构也不改变。
因此，这种可光切除生物素化试剂是一种明显节省时间、精力、花费的好方法，此外，现在可以从商业来源得到一系列通过化学或基因法修饰的抗生物素蛋白或链球菌抗生物素蛋白。这些衍生物可以应用在可光切割生物素技术中。免疫纯的中性抗生物素蛋白(ImmuoPureNeutrAvidin)(Pierce Chemian，Rockford III)就是一个明显的例子，这是一种修饰的抗生物素蛋白，经过脱糖，它不含RYD区，避免对许多细胞受体的非特异识别，对其它蛋白和细胞表面的非特异性吸附大大地降低。
下面结合附图用实施例来进一步说明本发明，但本发明的范围并不只限于这些实施例。这些只是用于说明本发明的各种制备方法和具体应用，因此不应该被看作是对本发明使用范围的限制。
图1是可光切除的生物素化试剂的化学结构；
图2是光不稳定活化酯的合成路线；
图3是可光切除的生物素化活化酯的合成路线；
图4是可光切除的生物素化的寡核苷酸的合成路线；
图5是可光切除的生物素化寡核苷酸的光分解机理；
图6是寡核苷酸的PAGE胶分析图：
Lanes 1：5′-Biotin-PC-d(GAG GTG CAG GGG TCT ATC AA)预先HPLC纯化；
Lanes 2，3：5′-NH2-d(GAG GTG CAG GGG TCT ATC AA)
图7是PAGE分离后寡核苷酸的HPLC分析图：
(a)5′-NH2-d(GAG GTG CAG GGG TCT ATC AA)
(b)天然的5′-Biotin-PC-d(GAG GTG CAG GGG TCT ATC AA)经过PAGE
处理(峰a，滞留时间5.55分钟，峰b，滞留时间20.67分钟)
图8是制备HPLC分离原寡核苷酸的HPLC分析图；
图9是水溶液中5′-Biotin-PC-d(GAG GTG CAG GGG TCT ATC AA)光照不同时间后的HPLC分析图
图10是经过不同光照时间后，从磁珠释放出来的5′-Biotin-PC-d(GAGGTG CAG GGG TCT ATC AA)的UV-Vis吸收光谱；
图11是PCR产物的琼脂糖凝胶分析图。
实施例1可光切除的生物素化活化酯的合成
结合附图2、3所示的合成路线，下面描述的是本发明的一种生物素化试剂的合成方案。A、4-(4-乙酰基-2-甲氧基苯氧基)丁酸甲酯(1)
将3.73g(20mmol)4-溴代正丁酸甲酯和5.52g(40mmol)无水K2CO3溶于80ml DMF(二甲基甲酰胺)中，室温下搅拌30分钟，加入3.37g(20mmol)纯化的3-甲氧基-4-羟基苯乙酮(商业来源的3-甲氧基-4-羟基苯乙酮在使用前须经过脱色、重结晶等纯化)，室温下继续搅拌24小时，加入30ml的蒸馏水，使所有无机盐溶解。然后加入等体积的CHCl3萃取，收集有机相。重复同样萃取三次。合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤，然后用MgSO4干燥。浓缩有机溶液，以氯仿/正己烷混合溶剂为淋洗液(4/1，V/V)在硅胶柱上层析提纯，可得化合物1。熔点：51-52℃。1H NMR(CDCl3，δ/ppm)：2.18-2.32(pentet，2H)，2.55-2.66(t，5H)，3.75(s，3h)，3.97(s，3H)，4.20(t，2H)，6.95(d，1H)，7.62(d，2H).MS(ESI)：m/z 266(M+).B、4-(4-乙酰基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)-丁酸甲酯(2)
将2.52g(10mmol)4-(4-乙酰基-2-甲氧基苯氧基)-丁酸甲酯溶于20ml的乙酸酐中，在-10°的温度下，缓慢滴加到50ml浓度为68％的浓HNO3和10ml乙酸酐的混合溶液中。磁力搅拌4小时，将反应混合物缓慢倒入200ml冰水中。混合物在冰箱中放置24小时，过滤沉淀。用水洗涤3次。以氯仿/乙酸乙酯混合溶剂为淋洗液(2/1，V/V)在硅胶柱上层析提纯，可得化合物2。熔点：109-110℃。1H NMR(CDCl3，δ/ppm)：2.21(pentet，2H)，2.50(s，3H)，2.57(t，2H)，3.71(s，3h)，3.95(s，3H)，4.16(t，2H)，6.75(s，1H)，7.61(s，1H).MS(FAB)：m/z 311(M+).C、4-(4-乙酰基-2-甲氧基苯氧基)-丁酸(3)
将2.66g(10mmol)4-(4-乙酰基-2-甲氧基苯氧基)丁酸甲酯和40ml 1M的LiOH溶液加入100ml的二氧六环中，室温下搅拌12小时，用10％的盐酸调整混合溶液的pH值为2-3。然后加入等体积的乙酸乙酯/CHCl3(v/v，1/1)混合溶剂和饱和NaCl溶液，收集有机相。重复萃取三次。合并有机相，用饱和NaCl溶液洗涤，再用MgSO4干燥。蒸干溶剂，剩余物用少量氯仿溶解，以氯仿为淋洗液在硅胶柱上层析提纯，可得化合物3。熔点：159-160℃。1H NMR(CDCl3，δ/ppm)：2.25(pentet，2H)，2.63(s，3H)，2.66(t，2H)，3.97(s，3h)，4.23(t，2H)，6.95(d，1H)，7.63(d，1H).MS(ESI)：m/z 252(M+).D、4-(4-乙酰基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)-丁酸(4)
1)将3.11g(10mmol)4-(4-乙酰基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)-丁酸甲酯和50ml的1M LiOH溶液加入50ml的二氧杂环己烷中，室温下搅拌20小时。然后加入等体积的乙酸乙酯/CHCl3(v/v，1/1)混合溶剂和饱和NaCl溶液，萃取收集有机相。重复萃取三次。合并有机相，用MgSO4干燥。浓缩有机层，以乙酸、甲醇和CHCl3的混合溶液(V/V/V，从1/1/98到1/2.5/96.5)为淋洗液在硅胶柱上层析提纯，可得化合物4。熔点：160-161℃。
2)将2.66g(10mmol)4-(4-乙酰基-2-甲氧基苯氧基)-丁酸溶于20ml的乙酸中，在-10°的温度下，缓慢加入到60ml浓HNO3和15ml乙酸的混合溶液中。磁力搅拌10小时，将反应混合物缓慢倒入300ml冰水中。待反应混合物冷却后，用饱和NaHCO3溶液洗涤，再用10％的稀盐酸调整溶液pH为3，用乙酸乙酯(3×80ml)为溶剂萃取。收集的有机相用饱和盐水洗涤。浓缩有机层，同样以乙酸、甲醇和CHCl3的混合溶液(V/V/V，从1/1/98到1/2.5/96.5)为淋洗液在硅胶柱上层析提纯，可得化合物4。熔点：160-161℃。1H NMR(CDCl3，δ/ppm)：2.19(pentet，2H)，2.48(s，3H)，2.61(t，2H)，3.94(s，3H)，4.15(t，2H)，6.88(s，1H)，7.5(s，1H).MS(FAB)：m/z 297(M+).E、4-(4-乙酰基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)-丁酸琥珀酰亚胺酯(5)
将1.50g(5mmol)4-(4-乙酰基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)-丁酸和0.69g(6mmol)N-羟基琥珀酰亚胺溶于30ml干燥的DMF中，磁力搅拌至溶解，边搅拌边滴加10ml DCC(二环己基碳二亚胺)(1.13g，5.2mmol)的DMF溶液。室温下搅拌24小时，过滤除去DCU(二环己基脲)，在滤液中加入30ml蒸馏水，用乙酸乙酯(3×30)为溶剂萃取。收集的有机相用饱和盐水洗涤，用MgSO4干燥。蒸干有机溶剂，以乙酸乙酯和正己烷混合溶剂为淋洗液在硅胶柱上层析提纯(乙酸乙酯/正己烷，1/2.5)，可得化合物5。熔点：123-124℃。1H NMR(CDCl3，δ/ppm)：2.31(pentet，2H)，2.52(s，3H)，2.90(d，4H)，3.02(t，2H)，3.95(s，3H)，4.24(t，2H)，6.75(s，1H)，7.63(s，1H).MS(ESI)：m/z 394(M+)F、N-(5-戊胺基)4-(4-乙酰基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)-丁酰胺(6)
将5ml 4-(4-乙酰基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)-丁酸琥珀酰亚胺酯(395mg，1mmol)的DMF溶液滴加到30ml 1，5-戊二胺(408mg，4mmol)的DMF中，边搅拌边滴加。室温下搅拌3小时，蒸干有机溶剂。用无水乙醇(3×25ml)洗涤3次，可得化合物6。熔点：152-152℃。1H NMR(CDCl3，δ/ppm)：1.68(t，6H)，1.92(br，4H)，2.13(pentet，2H)，2.47(t，2H)，2.55(s，3H)，3.23(s，2h)，3.51(s，2h)，3.91(s，3H)，4.25(t，2H)，6.88(d，1H)，7.5(m，1H).MS(FAB)：m/z 395(M+).G、生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯(7)
将0.5g(2mmol)生物素和0.3g(2.6mmol)N-羟基琥珀酰亚胺溶于12ml的DMF中，滴加3ml DCC(0.41mg，2mmol)的DMF溶液。室温下搅拌24小时，过滤除去DCU。滤液在0℃放置过夜，过滤除去DCU。减压蒸干溶剂，用乙醚(3×25ml)洗涤3次。在异丙醇中重结晶，可得化合物7。熔点：213-214℃。1H NMR(DMSO-d6，δ/ppm)：1.47(t，3H)，1.61(t，3H)，2.50(d，3H)，2.67(pentet，2H)，2.85(s，5H)，3.11(s，1H)，4.15(t，1H)，4.28(t，1H)，6.37(s，1H)，6.44(s，1H).MS(ESI)：m/z 341(M+).H、5-生物素酰胺基戊胺(8)
将5ml生物素琥珀酰亚胺酯(341mg，1mmol)的DMF溶液滴加到30ml1，5-戊二胺(408mg，4mmol)的DMF中，边搅拌边滴加。室温下搅拌3小时，蒸干有机溶剂。用无水乙醇(3×25ml)洗涤3次，可得化合物8。1H NMR(DMSO-d6，δ/ppm)：1.32(d，8H)，1.51(s，3H)，1.65(s，1H)，2.02(t，2H)，2.56(d，1H)，2.82(d，1H)，3.09(t，2H)，3.11(t，1H)，4.11(t，1H)，4.30(t，1H)，6.37(s，1H)，6.44(s，1H)，7.75(t，1H).MS(ESI)：m/z 328(M+).I、N-(5-生物素酰胺基戊基)4-(4-乙酰基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)-丁酰胺(9)
将328mg(1mmol)5-生物素酰胺基戊胺、1ml三乙胺和394mg(1mmol)4-(4-乙酰基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)-丁酸琥珀酰亚胺酯溶于30ml干燥的DMF中，室温下搅拌24小时。蒸干有机溶剂，用少量CHCl3溶解剩余物。以甲醇和CHCl3的混合溶液(V/V，从5∶95到20∶80)为淋洗液在硅胶柱上层析提纯，可得化合物9。熔点：143-144℃。1H NMR(DMSO-d6，δ/ppm)：1.25-1.53(m，12H)，2.05(pentet，2H)，2.22(t，1H)，2.60(s，1H)，2.79(tt，2H)，3.03(t，5H)，3.34(s，6H)，3.91(s，3H)，4.10(t，3H)，4.29(t，1H)，6.40(d，2H)，7.23(s，1H)，7.62(s，1H)，7.74(t，1H)，7.85(t，1H).MS(ESI)m/z 607(M+)J、N-(5-生物素酰胺基戊基)4-(4-(1-羟基乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)-丁酰胺(10)
将243mg(0.4mmol)N-(5-生物素酰胺基戊基)-4-(4-乙酰基-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)-丁酰胺溶于30ml的90％乙醇中，将反应混合物冷却到-5°，边搅拌边加34.6mg(0.9mmol)NaBH4。缓慢升温至室温，室温下搅拌4小时。加入2ml的丙酮使反应终止，用0.1M的盐酸调整溶液的pH值为6，蒸干溶剂，用少量蒸馏水洗涤除去无机盐。剩余物用少量乙酸乙酯溶解，以甲醇和CHCl3的混合物为淋洗液在硅胶柱上层析提纯(甲醇和CHCl的比从5∶95到20∶80)，可得化合物10。1H NMR(DMSO-d6，δ/ppm)：1.27-1.49(m，12H)，1.99(pentet，2H)，2.08(s，10H)，2.22(t，2H)，2.59(s，1H)，2.79(tt，2H)，3.01(t，5H)，3.89(s，3H)，4.02(t，3H)，4.16(t，1H)，4.32(t，1H)，5.47(pentet，1H)，5.47(d，1H)，6.40(d，2H)，7.35(s，1H)，7.51(s，1H)，7.73(t，1H)，7.87(t，1H).MS(ESI)：m/z 609(M+).K、N-(5-生物素酰胺基戊基)4-(4-(1-琥珀酰亚胺氧羰基氧代乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)-丁酰胺(11)
将61mg(0.1mmol)N-(5-生物素酰胺基戊基)-4-(4-(1-羟基乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)-丁酰胺溶于5ml干燥的DMF中，然后加入37.2mg(0.15mmol)N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯和700μl的三乙胺。室温下搅拌12小时。蒸干溶剂，用剩余物少量乙酸乙酯溶解，以甲醇和CHCl3的混合溶液(V/V，从5∶95到20∶80)为淋洗液在硅胶柱上层析提纯，可得化合物11。1H NMR(DMSO-d6，δ/ppm)：1.10(t，1H)，1.20-1.29(t，3H)，1.35(s，6H)，1.49(s，3H)，1.63(s，1H)，1.95(pentet，2H)，2.05(t，2H)，2.24(t，2H)，2.59(d，1H)，2.83(d，2H)，3.02(t，4H)，3.11(t，1H)，3.43(t，1H)，3.89(s，3H)，4.02(t，2H)，4.16(t，1H)，4.32(t，1H)，4.39(t，1H)，5.25(pentet，1H)，5.49(s，1H)，6.36(s，1H)，6.43(s，1H)，7.36(s，1H)，7.51(s，1H)，7.73(t，1H)，7.84(t，1H).MS(ESI)：m/z 750(M+).
实施例2
该实施例说明可光切除的生物素化寡核苷酸的合成及光切割反应：
将20 OD(25nmol)的5′-NH2-d(GAG GTG CAG GGG TCT ATC AA)溶于100μl的无菌蒸馏水，加入300μl NaHCO3缓冲溶液(50mM，pH 8.5)，待寡核苷酸完全溶解后，再加入100μl N-(5-生物素酰胺基戊基)-4-(4-(1-琥珀酰亚胺氧代羰基氧代乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)-丁酰胺(250nmol/ml)的DMF溶液。室温避光摇荡4小时。在冷冻干燥器上抽干溶剂，通过16％的聚丙稀酰胺变性胶进行初步纯化，产物的纯度为85％。进一步的纯化是在高效液相色谱半制备柱上进行的。收集到的稀溶液使用Microcon YM-3离心过滤浓缩器上浓缩，最后在冷冻干燥器上抽干。
为了测量光切割所需的时间，可以将HPLC纯化的5’-PC-biotin-oligo(48nmol)和1.5倍量的链霉生物素包裹的磁珠温育30分钟。再将磁珠旋转过滤、洗涤、重新悬浮在磷酸缓冲液中(pH7.2)，再进行照射。分为200μl的小份，分别照射1，2，3，4，5，10分钟，再重复进行旋转过滤和洗涤。
其中，图5示出了可光切除的生物素化寡核苷酸的光分解机理。图6是寡核苷酸的PAGE胶分析图：Lanes 1：5′-Biotin-PC-d(GAG GTG CAGGGG TCT ATC AA)预先HPLC纯化；Lanes 2，3：5′-NH2-d(GAG GTG CAGGGG TCT ATC AA)。图7是PAGE分离后寡核苷酸的HPLC分析图：(a)5′-NH2-d(GAG GTG CAG GGG TCT ATC AA)；(b)天然的5′-Biotin-PC-d(GAG GTG CAG GGG TCT ATC AA)经过PAGE处理(峰a，滞留时间5.55分钟，峰b，滞留时间20.67分钟)。图8是制备HPLC分离原寡核苷酸的HPLC分析图。图9是水溶液中5′-Biotin-PC-d(GAG GTG CAG GGG TCTATC AA)光照不同时间后的HPLC分析图。图10是经过不同光照时间后，从磁珠释放出来的5′-Biotin-PC-d(GAG GTG CAG GGG TCT ATC AA)的UV-Vis吸收光谱。
实施例3
该实施例说明可光切除的生物素化寡核苷酸在PCR反应中的应用及PCR产物的分离方法：
分别以5′-Biotin-PC-d(GAG GTG CAG GGG TCT ATC AA)、5′-PO4-d(AAA CCC GTA GGT GGC GTA G)和5′-NH2-d(GAG GTG CAG GGG TCTATC AA)、5′-PO4-d(AAA CCC GTA GGT GGC GTA G)为一对PCR反应引物，以酿酒酵母S228C菌株的基因组DNA为PCR反应模板，进行PCR扩增反应。在100μl试管中，依次加入20.2μl无菌H2O、2.5μl 10×PCRbuffer、0.5μl Genomic DNA、0.5μl dNTP、0.3μl Taq DNA聚合酶(ploymerase)和0.5μl浓度约为1μmol/L一对引物溶液。按照t图12所示的程序进行PCR扩增，使用PTC-200 Peltier Thermal Cycler(MJResearch)进行扩增。标记了生物素的核酸可以使用包被了链球菌抗生物素蛋白的磁珠进行捕获。捕获的物质用适当的缓冲液洗涤，再以所需的浓度重新悬浮。再将样品用365nm的光照射30分钟以释放出去修饰的PCR产物。
其中，图11是PCR产物的琼脂糖凝胶分析图。